Biotecnologa Agroindustrial

Produccin de enzimas

Dr. Ing. Waldir D. Estela Escalante, MSc, PhD

Enzimas industriales

La may ora de enzimas utiliza das en la industria son e nzim as
extracelulares de ori gen microbi ano.

Enzim as de may or importancia: amilasas y amiloglucosidasas
para la pro duccin de gl ucosa a partir de almid n, la glucosaisomerasa para la pr oduccin d e f ructosa, la renina microbian a se
utiliza en v ez de la reni na de terne ra en la pro duccin de qu esos.

En la actualidad se pro ducen comercialm ente las siguientes
enzim as:
 Enzim as utilizad as en la industria: amilasas, proteasa s,
lipasas, catalasas, isomerasas

Produccin de enzimas extracelulares mediante fermentacin

 Enzim as utilizad as con propsitos analticos

 Enzim as utilizad as en medicina.

Cultiv o microbiano
Fermentador para sie mbra

Cultivo en superficie
Cultivo sumergido
Extrac cin de agua y
filtracin

Enzima lquida
Enzima lquida
concentrada

Adicin de estabilizantes

Enzima lquida

Precipitacin
y filtracin
Secado por aire
o por atomizacin
Trituracin

Enzima en polvo


May or aplicacin de las en zimas en la in dustria de alimentos:

hidrolisis de almid n, industrias lcteas, industria de las f rutas y
zumos, cerv ecera, panadera, etc.

Enzim as extracelulares conv ierten el almidn en ja rabes qu e
contienen glucosa, maltosa y oligosacridos, ejem.: produccin de
azcar es f ermentables en cerv ecera y bebidas alcohlicas

La sntesis de enzimas extracelulares est usualmente asocia da
con la f ase de crecimiento exponencial o post-exp onenci al.

-amilasas mas usadas comercialme nte son de Bacillus
lichenifor mis, Bacillus a myl oliqu efaciens y Aspergillus oryzae y
amiloglucosid asa de Asper gillus nige r.

En procesos de extraccin de zumos de f rutas y de elaboracin

de v inos, la pectinasa producid a por A. niger el ev a el rendimiento
de zumo, red uce la v iscosidad y mejora la extraccin de
pigmentos de la cscara de las f rutas y v egetales macerados.

La glucosa isomerasa es la enzima intr acelular come rcial ms
utilizad a en la ind ustria alimentaria, conv ierte la glucosa en
f ructosa durante la producci n de jara bes de maz ricos en
f ructosa.

Kluyvero myces lactis, Kluyvero myces fragilis y Bacillus spp
produce n enzimas intracelula res como las lactasas.

Al ternativas para mejorar la produccin de enzimas

a.

Optimizacin de las condiciones de fermentacin;

induccin, uso de nutrientes de coste inf erior, utilizacin ptima
de los componentes en la solucin n utritiv a y utilizacin de
cultiv o f ed-batch.

b.

Liberacin de las enzimas a partir de las clulas mediante

nuev os mtodos de ruptura celular

c.

Procesos modernos de purificacin, cromatograf a de

intercambio inico, cromatogr af a de f iltracin, cromatograf a de
af inidad y precipitacin.

d.

Procesos de inmovilizacin de enzimas para su reutili zaci n.

e.

Produccin continua de enzimas en biorre actores especiales.

Produccin de amilasas

Amilasas hidroli za n el almidn, su princip al uso esta en la
produccin d e edulcor antes para la ind ustria alimentari a.

La hidrlisis del almidn con amilasas resulta primero en la
produccin d e polmeros de cade na corta (dextrinas), luego e n
maltosa y f inalmente en glucosa.

La glucosa es menos dulce que la f ructosa (su ismero), as la
etapa subsiguie nte es la transf ormacin de la glucosa a f ructosa
utilizan do la en zima gl ucosa isomerasa.

Las enzimas ms importantes en el pr oceso de sacarif icacin del
almidn son las -ami lasas, -amilasas, glucoamilasa, glucosa
isomerasa, pulula nasas e isoamilasas.

-amilasas
-amilasas
Glucosamilasas
Pululanasas,
Isoamilasas

Extremo reductor

Mecanismos de hidrlisis del almidn por amilasas

-amilasas hid roli zan en laces -1,4 glicosdicos. Son

endoe nzim as y a que seccionan el polmero en el interior de la
molcula.

Las -amilasas se clasif ican de acuerdo con sus ef ectos de
licuef accin del almidn, su pH ptimo, rango de temperatura y
estabilidad.

Las bacterias que prod ucen - amilasas son: Bacillus subtilis, B.
cereus, B. a myloliqu efaciens, B. coagulans, B. poly myxa, B.
stearother moph ilus, B. acidocaldarius, B. subtilis var.
a mylosaccha raticus, B. lichenifor mis, Lactobacillus, Micrococcus,
Pseudo mo as, Arthrobacter, Escherichia, Proteus,
The r mo monosp ora y Serratia.


Hongos prod uctores de -amil asas son los gneros Asper gillus,
Penicilliu m, Mucor, Ca ndida, Neur ospora y Rhizopus.

-amilasas contien en una gr an pro porcin d e tirosina y
triptfano en la protena en zimtica y la may or parte requieren
calcio como estabilizad or.

-amilasas mas importantes prod ucidas por B. a myl oliqu efaciens,
Bacillus lichenifor mis y Aspergillus oryzae. Las amilasas de
Bacillus se utilizan much a ms extensamente que las de
Aspergill us.

La sntesis de -amilasa por B. lichenifor mis y A. oryzae ocurre
durante la f ase de crecimiento exponencial, mientras que e n B.
sutilis y B. amyl oliqu efaciens la en zima se produce e n la f ase
post-exponenci al.

Aplicaciones importantes de las -amilasas

Industria

Origen
Bacillus

Del almidn

Harinera
Del alcohol

Aplicacin

Aspergillus

Panadera

Licuefaccin del almidn para producir glucosa,

fructosa, maltosa

Modificacin de harina deficiente en -amilasas

Licuefaccin del almidn previa a la adicin de malta

para sac arificacin

Aumento en la proporcin de azcares fer mentables

+
Cerv ecera
Azcar

Prepara cin de la cebada, licuefaccin de aditivos

+
+

Mejora de la fermentabilidad del mosto, modificacin

de las caract erstica s de la cervez a
Mejora la filtrabilidad de las melazas de azcar por
degradacin de las partculas de almidn contenido
en las mismas

Produccin de -amilasas bacterianas

La producci n industrial de -amilasas se realizan en cultivos
batch y fed-batch.

La adicin de a ntibiticos especf icos inhiben la sntesis de
protena en B. subtilis y as la produccin de - amilasas.

La v elocidad de f ormacin de la enzima es muy baja durante el
crecimiento expone ncial en muchas cepas de pro duccin, pero
justo antes de que la v elocidad de crecimiento decaiga y
comience la f ormacin de las esporas, aumenta la produccin d e
amilasas.

Se asume que un a pequ ea cantida d de en zima se prod uce
constitutiv amente y se excreta al medio, donde su accin sobre el
almidn cond uce a la prod uccin de inductores de b ajo peso
molecular.

Produccin de -amilasas a partir de hongos

La producci n de amilasas es constitutiv a, pero como con las
dems enzim as, est reprimida por re gulad ores.

Para la pro duccin de amil asa utiliza ndo Aspe rgillus ory zae p uede
utilizarse la sigu iente solucin d e nutrientes: 8% de almid n, 1.2%
NaO3, 0.1% K2HPO4 0.1% MgSO4, 0.05% KCl, 0.003 % FeSO4,
0.08% Mg (NO3)2, 0.05% Mg (H 2PO4)2, 2% extracto de malta.

La temperatura ptima se encuentra entre 28 y 30C y la duracin
del proceso de f ermentacin es de 3 4das.

Produccin de -amilasas

m.o productores: Bacillus poly myxa, B. cereus, B. me gateriu m,
Strepto myces sp., Pseudo monas sp., y Rhizo pus japonic us.

El rendimie nto en las cepas silv estres es generalmente bajo, se
han descubie rto mutantes que prod ucen 200 v eces ms enzima
que la cepa silv estre.

Las -amilasas bacteria nas tienen ms resistencia al calor
(>70 C) que las -ami lasas de plantas y el pH ptimo es tambin
ms alto (alreded or de pH 7.0).

En contraste a la -amilasa, el calcio no es necesario pa ra la
estabilizacin y activ acin de las -amilasas bacterian as.

Produccin de glucoamilasas

Actan sobre el almid n cortando un idad es de glucosa a partir del
extremo no reductor.

Med iante la accin de gl ucoamilasas se obtiene n glucosa,
maltosa y dextrinas. Los m.o que se utilizan par a prod ucir
glucoamilasas son Asper gillus nig er, A.oryzae, A.awa mori,
Rhi zop us niveus.

La f ermentacin industrial de las glucoamilas as se llev a a cabo
casi exclusiv amente en cultiv os sumergidos.

Algunas cepas pu eden p roducir v arios tipos de glucoamilasas, de
las cuales puede qu e slo una 2 pue den hid roli zar el almi dn.


El almidn o dextrin as inducen la pro duccin de la e nzim a, las

soluciones de nutrie ntes para la pro duccin de glucosa estn
basadas gen eralme nte en almid n.

La glucosa prod uce repr esin catablica. El tiempo de
f ermentacin v ara desde 3 a 5 das dependien do del
microorgan ismo y la temperatura de f ermentacin puede v ariar
entre 28 35C.

La calidad de las espora s utilizadas en el inculo tiene

efecto sobre el rendimiento en glucoamilasa en A. niger.

Produccin de pululanasas e isoamilasas

Hidroli zan la amilo peptin a. Aerobacter ae roge nes ATCC 15 050
excreta pululan asas al medio en la etapa tarda de la f ase
exponencia l.

Con cepas inducibles se pued e utilizar maltosa como f uente de
carbohid rato, pero en la actuali dad se utilizan mutantes
constitutiv os. Se llev an a cabo procesos de f ermentacin batch y
continua.

Especies productoras: Aero bacter aero gen es, Bacillus poly myxa,
Pseudo mo nas saccharophil a, Streptococcus sp., y Streptomyces
sp., y aquellas prod uctoras de isoamilasa son: Pseudo mo nas
a mylo dera mosa, Ag robacteri u m, Ser ratia, Nocar dia, Bacillus,
Pediococcus, Lactobacillus y Leuconostoc.

Almidn de maz (40% peso/volumen)

Agua desionizada
Ca2+ (20ppm), -amilasa (0.15%)

5 min, 105C

60 min, 95C

pH 4.5, 60C, filtracin

Dilucin (10 20% peso seco)

Glucoamilasa (0.5 unidades/g almidn)

48h, 60C

Glucosa (98% rendimiento)

Produccin de una solucin de glucosa a partir de almidn

Produccin de glucosa isomerasa

Isomeriza la glucosa a f ructosa, la reaccin es rev ersible y se
produce un a mezcla d e ambos, la reaccin dep ende d e la
concentracin de en zima utili za da y la temperatura.
Sacaros a
(azcar de caa)

Almidn
(trigo, maz, patatas)

Invertasa

Hidrlisis enzimtica
cida

Glucosa/fructosa
50:50, azca r invertida

Glucosa

Isomeras a
Glucosa/fructosa
60:40, isojarabe

Las bacterias que isomeri zan di rectamente: Bacillus coagul ans,

Strepto myces rubi ginosus, Actinopla nes missour iensis,
Flavob acteriu m arbo rescens.
Produccin de glucosa isomerasa por Bacillus

B. coagulans se utiliza in dustrialmente pa ra la pro duccin
comercial de glucosa isomerasa.

La xilosa induce la activ idad de la glucosa isomerasa en cepas
silv estres.

La glucosa acta como represo r tanto en cultiv os batch y
continuo.

En cultiv os batch, B. coagulans no pro duce la en zima dur ante la

f ase logartmica. Al metabolizar un a segund a f uente de carbono
(diauxia) comie nza la prod uccin de la en zima.

Cobalto y magnesio son necesarios en el medio par a la mxima
produccin d e en zima, anqu e se han aislado mutantes qu e
produce n cantidades ra zon ables en ause ncia de cobalto.

Como f uente de nitrgeno se puede utili zar extracto de lev adura o
lquido de maceraci n de maz, la eleccin y concentracin de la
f uente de nitrgeno es v ital para el rendimiento.

En cultiv os continuos la glucosa es el substrato limitante del
crecimiento. La limitacin de oxgeno es necesario p ara obten er
rendimie ntos ptimos, y a que las condiciones microaerf ilas
dentro de las clulas estabili zan el sistema.

Produccin de glucosa isomerasa por Streptomyces

Se produce sol o en cultiv os batch. Existen mutantes que no
requie ren cobalto.

El inculo son espor as que se cultiv an durante 24 48 horas a
30C en medio a gitado. El medio d e cultiv o contiene harin a de
soy a, extracto de lev adura, glucosa, almidn, f osf ato y agua
desioni zad a. 5% de inculo se utili za en bio rreactor de pr oduccin
(80 150 m3).

Strepto myces olivaceus NRRL 3588 pr oduce glucosa isome rasa a
pH 8.5 y 60 70C.

FIC

cido

Mezclado

Concentracin

Tratamiento
con carbn
FIC
Mezclado

MgSO4
Alcali

Sistema de produccin de fructosa con 2 series en paralelo, cada una de 3

columnas

En el sistema anterior se utiliza jar abe de gl ucosa (93 96 %w/ w).

El medio se purif ica por f iltracin, se trata con carbn e
intercambio inico p ara impe dir la prd ida de la activ idad
enzim tica durante la isomeri zaci n.

Se aad e Mg como activ ador, la reaccin se llev a a cabo a pH 8.5
y 60 65C. El tiempo que se requier e para la isomeri zacin es
de 0.8 4horas.

En el proceso de recu peraci n, la solucin conv ertida se acidif ica
y luego se pasa sobre carbn activ o y resina de intercambio inico
para elimin ar las sales y los pigmentos.

Produccin de proteasas

Se utiliza n en la industria d e deterge ntes, del cuero, industria
lctea (renina), f armacologa, produccin de hi droli za dos de
protena, etc.

Se produce n con bacterias y hongos. La produccin de prote asas
extracelulares est regul ada f undamentalmente p or la
composicin del medio (co ncentracin de io nes de amoni o y
AAaas), presin p arcial de oxgen o, v elocidad de aireacin y el
tiempo de f ermentacin.

En el proceso se considera el pH ptimo de la p roteasa. Las
proteasas incluy en proteasas alcalinas, neutras y cidas.

Las proteasas alcalinas son producid as por B. lichenifor mis, B.

a myloli quefacie ns, B. me gateriu m; Strepto myces griseus, S.
rectus; Aspergillus niger, A. oryzae, A. flavus. Las proteasas
producid as se usan en la industria de deter gentes.

En todas las condiciones de crecimiento, las especies de Bacillus
produce n proteasas extracelula res durante la f ase de crecimiento
post-exponenci al.

Las proteasas neutras son excretadas por Bacilus subtilis, B.
cereus, B. megateri u m, Pseu do mon as aerugi nosa, Strepto myces
griseus, Aspergillus ory zae, etc. Las proteasas producidas se
usan en la industria el cuer o y algunas tambin en la industria de
alimentos para la f abricacin de gall etas, pan y otros.

Las proteasas cidas son prod ucidas por ho ngos. Las proteasas
cidas tienen un pH ptimo de 2 4. Se utilizan en medicin a, en
la digestin de la pr otena de soy a para la produccin de salsa de
soy a y en la degradacin d el gluten de trigo e n panif icacin.

Produccin de renina

Se utiliza e n la prod uccin de quesos. Son m.o que pro ducen
cido lctico, disminuy en el pH hasta el punto isoelctrico de la
casena, lo que conduce a la precipitaci n en la f orma de cuajos
que pue den ser separ ados del suer o.

La enzima purif icada obtenid a del cuajo se denom ina ren ina,
quimasa o quimiosin a. El principal p unto de uni n de la reni na
sobre la k-casena son la f enilalanina y la metionina.


El cuajo es una proteasa de Mucor miehe i que se usa en la

manuf actura del queso.

El cuajo se utiliza como en zima coag ulante de la lech e, se extrae
del cuarto estomago de terne ros de 3 4 semanas que ha n sido
criados con leche.

Debido a la alta pro duccin y demanda de quesos se ha
desarroll ado la pr oduccin de r enina p or mtodos microbia nos.

Los m.o ms importantes productores de enzim as coagulantes de
la leche son: gneros Alcali genes, Bacillus, Co ryneb acteriu m,
Lactobacillus, Serratia, Streptococcus y Streptomyces. Tambi n
los hongos Asper gillus, Can dida, En dothia, Mucor, Penicilliu m,
Rhi zop us, Torul opsis y otros.

Las enzimas microbi anas obteni das debe n tener los siguientes
requer imientos:
 Buena coa gulaci n de la casena sin hidrlisis
 Dar buen olor y estructura al queso
 Carecer de olor d esagra dabl e
 No txica
 Baja prote lisis para impedi r el desarro llo de amar gor en el
proceso de madur acin
 Baja activ idad lipsica para ev itar el desarrollo de ra nciedad e n
el queso.

Slo tres hongos se utilizan en la pro duccin mun dial.

Tipo I: Mucor pusillus (cultiv o en superf icie)
Tipo II: Endothia par asitica (cultiv o sumergido)
Mucor mi ehei (cultiv o sumergido)

La renin a produci da por En dothia pa rasitica se v ende
comercialmente como prep arad o lquido. Es una prote asa cida,
estable a pH 40 5.5.

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Produccin de pectinasas

Los prepar ados de pectinasas contien en al menos 6 en zimas que
cortan la pectina en dif erentes sitios. Las pectinasas se clasif ican
de acuerdo con su sitio de ataque sobr e la molcula d e pectina.

La producci n de pectinasas se reali za con Asper gillus nige r o A.
wentii. La f ermentacin con A. niger dura 6 0 80h en cultiv os f edbatch a pH 3 4 y 37C utilizando 2% d e sacarosa y 2% de
pectina como inductor.

En la purif icacin, la biomasa se separa por f iltracin o
centrif ugacin, se aaden agentes estabili zantes, se precipita la
enzim a con agentes org nicos y se seca.

Las pectinasas se utilizan par a clarif icar jugos de f rutas, en la
maceracin de v egetales y f rutas, en la extraccin de aceite de
oliv a.

Produccin de lipasas

Enzim as extracelulares que cortan las gr asas en di o
monoglicri dos y cidos grasos.

Los m.o productores son hongos como Asper gillus, Mucor,
Rhi zop us, Penicilliu m, Geotrichu m, lev aduras como Tor ulopsis y
Can dida, bacterias como Pseud o monas, Achro mo bacter y
Staphilococcus.

Los m.o que se utilizan en la pr oduccin ind ustrial son:
Aspergill us, Mucor, Rhizo pus y Candida.

En algun os casos los aceites y grasas pueden ind ucen o reprimi r

la produccin d e lipasas. El glicerol y la glucosa reprimen la
sntesis de lipasas.

Las lipasas estn genera lmente unid as a las clulas, y por tanto
inhibe n su superpro duccin, la adicin de ma gnesio hace q ue las
lipasas se liberen y as aumenta la produccin.

Las lipasas se usan limitadamente en la ind ustria de prod uctos
lcteos. Los cidos grasos libres determinan el olo r y el gusto del
queso y el proceso de maduracin de los quesos es af ectado por
las lipasas.

En la producci n de queso ro quef ort (queso azu l) se aade n
esporas de Pen icilliu m roqu eforti y actan como una f orma de
prepar acin de lip asas.

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Temp eratura y pH ptimos de varias lipasas microbianas

Organismo
Penicillium crysogenum
Pseudomonas fragi

pH ptimo
6.2 6.8
7.0 7.2

Temperatura ptima
37
32

Rhizopus delemar
Aspergillus niger
Staphylococcus aureus

5.6
5.6
8.0

35
35
37

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