Ingen Gen

INGENIERA GENTICA
(TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE ) ( CLONAJE)

1. INTRODUCCIN:
La informacin que determina las caractersticas observables de un organismo
concreto (FENOTIPO) est contenida en sus genes (GENOTIPO).
Un GEN es una molcula de ADN constituida por 2 cadenas de nucletidos
cuyas bases son 2 purinas (A y G) y 2 pirimidinas (T y C).
Las dos cadenas son complementarias de tal manera que cada purina est
unida siempre a una pirimidina determinada:
A
G
Jorge FUENTES-BERAZATEGUI
BIOTECNOLOGA
T
C
las 2 hebras del ADN SON ANTIPARALELAS. Esto significa que una de ellas tiene
polaridad 3 - 5, mientras que la otra 3' - 5'.
MECANISMO DE CRECIMIENTO (natural o sinttico) DE LA CADENA DE ADN
BIOTECNOLOGA
- d TTP desoxitimidina
- d ATP desoxiadenosina
- d CTP desoxicitosina
tri - fosfato
tri - fosfato
tri - fosfato
la Biologa Molecular tiene como fundamental objetivo el comprender cmo est organizada
y cmo se regula la expresin de la informacin contenida en el ADN, estos conocimientos
pueden permitir a la BIOTECNOLOGA obtener entre otras cosas de inters:
sanitario
agrcola
ganadero
a costos ms bajos que por los mtodos tradicionales. Como un gen es slo una mnima parte
del ADN genmico, la tecnologa del ADN recombinante (ADN - r ) que permite aislar un
BIOTECNOLOGA
gen de la totalidad del ADN genmico, purificarlo y clorarlo es, sin lugar a dudas, ms eficiente
que cualquiera de los mtodos clsicos empleados antes de la dcada del 80.
a continuacin intentaremos dar una visin que, sin perder el rigor tcnico, permita
comprender estas tcnicas de la biologa que ya estn cambiando el mundo y la imagen rgida
que tenamos del mundo de los seres vivos.
El clonaje de un gen se basa en:
1) la fragmentacin del ADN total del organismo que posee el gen de inters, para
separar de l y sin que resulte fragmentado, el gen elegido.
2) la unin del ADN correspondiente al gen elegido al ADN de un vector gentico
resultado de lo cual se obtiene una molcula de ADN recombinante (ADN - r).
3) la introduccin de este ADN - r en un hospedador adecuado que haga posible su
clonacin o propagacin o multiplicacin.
4) la seleccin de clulas individuales del hospedador que haya recibido (CLONES) la
molcula de ADN - r.
5) conseguir en esa clulas la expresin de ese ADN - r para obtener la protena que l
codifica.
6) separar y purificar la protena buscada.
7) si el vector es resistente al CLOROFENICOL (que inhibe la sntesis proteca celular)
se pueden obtener hasta 3000 copias del vector (con su ADN - r incorporado) aumentando la
productividad de la protena buscada.
DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
El ADN de un organismo procariota est constituido por una secuencia continua de genes
que se expresan;
El ADN de un organismo eucariota contiene regiones que no se expresan (INTRONES)
dispuestas entre las regiones que s se expresan (EXONES).
OTROS PROBLEMAS:
Un gen puede estar regulado de tal forma que slo se exprese:
a) en un determinado perodo de desarrollo del organismo;
b) slo en un tipo de determinado de clulas (tejidos)
CONSECUENCIAS:
Las caractersticas especiales de esos tipos de genes hacen que pueda ser de
inters el clonaje a partir de un ARN - m como material de partida, el cual, por accin de la
TRANSCRIPTASA INVERSA o RETROTRANSCRIPTASA pueden dar lugar a un ADN - c
(ADN complementario) que slo contendr las secuencias que se expresan (EXONES). Este
ADN - c puede clonarse, y bajo ciertas condiciones, expresarse en un hospedar bacteriano,
pude ser til tener todo el genoma de un organismo clonado, es decir, construir un BANCO
DE GENES o GENOTECA para disponer de todas las secuencias del ADN que codifican
protenas.
el BANCO DE GENES puede ser tambin obtenido a partir de ARN - m en forma de ADN c.
el banco de genes slo estar completo cuando se haya conseguido una coleccin de
BIOTECNOLOGA
clulas hospedadoras de tal forma que cada categora de ellas contenga un solo ADN o
ADN - c inserto.
OBTENCIN DE ADN
El ADN que se pretende clonar puede obtenerse de dos maneras:
por extraccin desde la clula que lo contiene,
por sntesis, como ADN -c , a partir de ARN - m .
Obtencin y purificacin de ADN celular
El estudio de la estructura molecular de las clulas bacterianas ha sido posible
gracias al perfeccionamiento de diversos mtodos de fragmentacin celular tales como:
la centrifugacin
la cromotografa
la electroforesis
La primera operacin a realizar consiste en la ruptura de las clulas lo que puede
realizarse por:
sonicacin
trituracin
sometiendo las clulas a presiones del orden de 1.400 atm. y
liberando rpidamente la presin.
Cualquiera de los mtodos permite obtener lo que genricamente llamamos
EXTRACTO CELULAR
A continuacin, la suspencin de clulas rotas se somete a centrifugacin
CENTRIFUGACIN
Para la centrifugacin se comienza a velocidades bajas para que se sedimenten

las clulas que no se han roto y luego se pasa a 10.000 g durante 10 minutoS.
BIOTECNOLOGA
El sobrenadante de esta primera centrifugacin contiene fragmentos de

membrana, ribosomas y todos los constituyentes solubles del citoplasma.
Este sobrenadante se somete ahora a una ULTRA - CENTRIFUGACIN. La
ultracentifuga opera en una cmara al vacio (para reducir el ruido) y a travs de refrigeracin se
hace un cuidadoso control de la temperatura.
El tratamiento de ultracentrifugacin depender del tipo de clulas en estudio.
Por ej.: para clulas eucariotas:
1 centrifugacin a 1000 g durante 10 min.
sobrenadante
culote: nucleos y clulas intactas
2 centrifugacin : a 20.000 g, 20 min.
sobrenadante
culote: mitocondrias y cloroplastos
3 centrifugacin: a 10.000 g , 1 hora
sobrenadante
culote: membranas
4 centrifugacin: a 150.000 g , 3 horas
culote: ribosomas
sobrenadante
extracto celular
BIOTECNOLOGA
FRACCIONAMIENTO DE LOS COMPONENTES CELULARES:

Del sobrenadante se pueden reparar por varias tcnicas la macroclulas
celulares, de las que las protenas son las ms abundantes.
una de la tcnicas ms tiles es la ultracentrifugacin en un gradiente de sacarosa. En
un tubo de centrfuga se colocan, por ej.: 3 concentraciones de sacarosa (la mayor en el fondo)
y se agrega la muestra (por ej. con 3 componentes).
Se centrifuga durante varias horas. Las protenas migran hacia abajo hasta
encontrar una densidad similar a la propia y all se estacionan.
cromotografa de afinidad de columna

electroforesis
EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN CELULAR
Si lo que se desea aislar es ADN el primer requisito es que este libre de otras
substancias.
Para ello, lo principal es tratar el sobrenadante de la ltima ultracentrifugacin (
si fueran clulas eucariotas, por ej. 3 horas a 150.000 g ) con ARN - asa.
Esto elimina los ARN
Las otras protenas pueden eliminarse desnaturalizandolas selectivamente
con fenol.
Si estas etapas se repiten varias veces pueden obtenerse ADN puro, pero ,por
supuesto, en fragmentos de varios tamaos al azar.
La longitud de estos segmentos nunca supera la centsima parte de un
cromosoma completa.
si se partiera de clulas completas, y sin pasar por la ultracentifugacin, el esquema bsico
del tratamiento sera el siguiente:
BIOTECNOLOGA
ELECTROFORESIS EN GEL
La forma rutinaria de analizar molculas de ADN es la electroforesis en gel.
El gel es una red compleja de molculas polimricas sobre un soporte
(placa de vidrio).
La electroforesis consiste en aplicar un campo elctrico continuo. El
desplazamiento de una partcula colocada sobre el gel de agar es inversamente
proporcional a su talla. para que pueda desplazarse deber tener carga elctrica.
Si se usa AGAROSA como gel se pueden separar molculas de varios cientos
hasta 2.000 pares de bases.
Si se emplea POLIACRILAMIDA se puede elegir el grado de polimerizacin y
obtener una malla que permita la separacin de trozos de ADN ms pequeos.
en la inmunoelectroferesis despus de someter una mezcla de molculas (ANTGENOS)
al campo elctrico, se hace correr los ANTICUERPOS especficos de las molculas
buscadas. La especificidad de la reaccin antgeno - anticuerpo y el empleo de anticuerpos
que lleven adosados un compuesto fluorescente permite la ubicacin inmediata del
fragmento de protena (INMUNOFLUORESCENCIA) por observacin , usando la luz U.V.
normalmente los fragmentos de ADN , despus de correr sobre la placa de agarosa o
poliacrilina, se tien (por simple rociado) con BROMURO DE ETIDIO y se observan
tambin empleando luz U. V.
las distancias que migran los trozos de ADN reflejan sus tamaos, que pueden
estimarse haciendo correr en forma paralela fragmentos de ADN de tamao conocido
como marcadores y referencia.
ABSORCIN DE LUZ U.V. POR EL ADN :
Un mtodo muy empleado para detectar la presencia de ADN en una
solucin es por absorcin de radiacin ultravioleta.
Debido a las bases de purina y pirimidina, el ADN presenta una absorbancia
BIOTECNOLOGA
mxima a los 260 nm.

El ADN bicatenario absorbe con menor energa que el monocatenaria. Esto
se debe a que los enlaces de puentes de hidrgeno entre las bases opuestas reducen la
absorbancia de la radiacin U.V.
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL ADN.

La oble hlice del ADN se mantiene unida por gran cantidad de enlaces
dbiles (puentes de hidrgeno):
3 puentes en las uniones C - G
2 puentes en las uniones A - T
La separacin de las 2 cadenas provocada por el calor se denomina FUSIN
Cuanto mayor sea el contenido de C - G tanto mayor ser el punto de fusin
BIOTECNOLOGA
El punto Tm de transicin de doble cadena a cadenas sencillas, punto de fusin, es una

funcin del contenido en C -G
Si se permite que el ADN fusionado se enfre lentamente, se puede volver a
formar el ADN nativo de doble hlice.
PRODUCCIN DE ADN SINTTICO:
Si se conoce la secuencia de aminoacidos de una protena (estructura
primaria) la "traduccin reversa" de los tripletes correspondientes, utilizando el cdigo
gentico, nos permite deducir la secuencia de los pares de bases que la codifican desde el
ADN.
En 1985, KAPLAN present una maquina automtica de sntesis de ADN que
puede producir fragmentos de ADN de 20 a 100 pares de bases. Estos pueden ser
conectados para lograr una secuencia ms larga.
Ejemplos:
sntesis del gen de la SOMOSTATINA ( una hormona peptida del crecimiento)
sntesis de los genes correspondientes a las cadenas A y B de la INSULINA
que se consiguieron hacer expresar en Escherichia coli.
produccin de mutaciones altamente especficas por sntesis de genes en los que se
cambian unas por otras bases.
cadena A
INSULINA
1 Gly
Phe 1
2 Ile
Val 2
3 Val
Asn 3
4 Glu
Gln 4
5 Gln
His 5
6 s Cys
Leu 6
7 Sys S - S
Cys 7
8 Ala
Gly 8
9 Ser
Ser 9
10 Val
His 10
11s Cys
Leu 11
12 Ser
Val 12
BIOTECNOLOGA
OVEJA Cys Cys Ala Gly Val Cys

* VACA Cys Cys Ala Ser Val Cys
* CERDO Cys Cys Thr Ser Iso Cys
* BALLENA Cys Cys Thr Ser Iso Cys
10
13 Lev
14 Tyr
15 Gln
16 Leu
17 Glu
18 Asn
19 Tyr
20 Cys
21 Asr
+ HUMANA
Glu 13
Ala 14
Leu 15
Tyr 16
Leu 17
Val 18
Cys 19
Gly 20
Glu 21
Arg 22
Gly 23
Phe 24
Phe 25
Tyr 26
Thr 27
Pro 28
Lys 29
Ala 30
cadena B
CABALLO Cys Cys Thr Gly Iso Cys
SNTESIS DE ADN-C:
Se deber tener en cuenta que:
debe haber una relacin transcriptasa inversa / ARN - m alta de manera de
asegurar un buen rendimiento del proceso;
debe evitarse la presencia de ARN - asas, para la cual, entre otros mtodo,
pueden agregarse inhibidores de estas enzimas como los vanadil ribonucletidos;
el proceso de sntesis puede ser ligeramente diferente segn se use como
molde ARN - m eucariota o ARN - procariota.
SNTESIS DE ADN - C A PARTIR DE ARN - m EUCARIOTA
Los ARN - m eucariotas presentan en el 3 un polmero A.
la actividad de la transcriptasa inversa se ver favorecida por el agregado de un
polmero de timidina (oligo - dt) complementario de ese (oligo - dA).
5
AAAA 3
DESOXIRRIBONUCLETIDOS;
Mg , K ; p alcalino;
oligo dT;
TRASCRIPTASA REVERSA;
3
TTTT 5
hidroliaia o digestin del
ARN m molde
3
TTTT
5
ADN - POLIMERASA
Mg , K ; pH alcalino
desoxirribonucletidos tri - P
TTTT
5
AAAA 3
NUCLEASA S 1
(degrada el ADN monofilar)
BIOTECNOLOGA
ARN
ADN - c
11
3
5`
TTTT
AAAA
5
3
ADN - c
DE DOBLE HLICE
SNTESIS DE ADN - c A PARTIR DE ARN (eucariota)

SNTESIS DE ADN - c A PARTIR DE ARN PROCARIOTA
Los procariotas no presentan ARN - polianelado. Como posibilidades caben:
aadir poli-A en el extremo 3 mediante la enzima POLI A - POLIMERASA de

Escherichia coli;
si se conoce la secuencia 3 - terminal del ARN, sintetizar en oligonucletido
complementario a dicha secuencia y emplearlo como iniciador.
FRAGMENTACIN DEL ADN

Los procariotas poseen una enzimas que se llaman ENDONUCLEASAS con
las que por un par de actividades enzimticas pueden defenderse de los ADN exgenos
tras infecciones virales, etc.
METILASAS: protegen a las clulas mediante la metilacin del ADN extrao.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN: se conocen ms
dde600endonucleasas en bacterias.
Las enzimas de restriccin cortan el ADN bicatenario en sitios especficos. Se las
ha clasificado en tres
Tipo I : no cortan al ARN en un sitio especifico sino a una distancia de tipos:
varios nucletidos de ese punto: son poco tiles en Ingeniera Gentica.
Tipo II : estas enzimas reconocen y rompen el ADN en secuencias
especificas (de 4
11 nucletidos), dando lugar a fragmentos de ADN discretos en
longitud y con secuencias terminales bien definidas.
Tipo III : su actividad est vinculada a la metilacin del ADN aunque
lo cortan a distancia definidas de las secuencias de reconocimiento.
las enzimas de restriccin del Tipo II son las empleadas casi con exclusividad por la
Ingeniera SECUENCIA ROTACIONAL . Por ej.: Eco RI del plsmido RI de Eschericia coli)
tiene la siguiente secuencia de reconocimiento:
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
Con estas enzimas se obtendr un nmero de fragmentos de ADN mayor
cuanto menor se el nmero de nucletidos en la secuencia de reconocimiento.
Ej:
para una secuencia de reconocimiento de 4 nucletidos, se producir un corte
cada 4 = 256 pares de bases, suponiendo que las 4 bases aparecen con
la
misma frecuencia en el ADN .
Si la secuencia de reconocimiento es de 6 nucletidos, se producir un corte
cada 4 = 4096 pares de bases del ADN.
no es recomendable emplear endonucleasas de restriccin de corte frecuente ya que se

corre el peligro de fragmentar la secuencia que se quiere clonar. As, tenemos en cuenta que
12
BIOTECNOLOGA
un gen procariota tpico tiene de 1 a 2 pares de kilobases ( 1 kilobase = 1.000 bases), es

probable que una endonucleasa de restriccin que reconoce 6 pares de bases no llegue a
cortar tal secuencia.
Otros ejemplos de formar de cortar ADN:
3CCC GGG 5
5GGG CCC 3
Xma I
Xanthomonas malvacearum
3 C CC
5 GGG
GGG 5
CCC
Sma I
Serratia marcescens
3G GATCC 5
5 CCTAGG 3
Bam HI
Bacillus amyloliquefaciens
Las enzimas de restriccon del Tipo II, producen tres tipos de terminales:
a) terminales 5 - 5 PROTUBERANTES
Ej.: Eco RI
5 .... G A A T T C ... 3
3 ... C T T A A G ... 5
Eco RI
5 A A T T C ...
3 G ...
... G3
... C T T A A 5
b) terminales 3 - 3 PROTUBERANTES
Ej.: Pst I
5 ... C T G C A G ... 3
3 ... G A C G T C ... 5
Pst I
... C T G C A 3
5 G ...
G 5
3 ACGTC ...
C) terminales ROMOS
Ej.: Hae III
BIOTECNOLOGA
(Haemophilus aegypticus)
13
5 ... G G C C ... 3
3 ... C C G G ... 5
Hae III
... G G 3
... C C 5
5 C C...
3 G G ...
En las tablas se muestran las secuencias de reconocimiento de varias enzimas

del Tipo II.
NUCLEASAS DE RESTRICCIN (Tipo II)
SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO
AATT
---------
----------
---------
Eco RI
---------
--------
---------
---------
AGCT
Alu I
Hind III
Pvu II
Sac I
-------
--------
--------
---------
ATAT
--------
--------
Nde I
Eco RV
---------
---------
--------
-------
CATG
--------
--------
Nco I
Sph I
------
---------
-------
--------
CCGG
Hpa II
------
Xma I
Nae I
---------
Scr FI
Bst NI
Nci I
CGCG
FnuD II
Mlu I
Sac II
BssH II
Nru I
---------
---------
---------
CTAG
---------
---------
--------
--------
Xba I
Dde I
---------
-------
GATC
Mbo I
Bgl II
Pvu
Bam HI
Bel I
Hinf I
---------
----------
GCGC
Hha
---------
-------
Nar I
Mst I
Fnu4HI
---------
Ns B II
GGCC
Hae III
Stu I
Xma III
Apa I
Bal I
Sau 96 I
Ava II
--------
GTAC
Rsa I
Rru I
--------
Kpn I
--------
-------
--------
---------
TCGA
Taq I
Cla I
Xho I
Sal I
Asu II
---------
---------
---------
TGCA
---------
---------
Pst I
---------
-------
---------
--------
--------
TTAA
----------
--------
Alf II
Hpa I
Aha III
---------
---------
---------
N = nucletido cualquiera
BIOTECNOLOGA
14
(Hind III : Haemophilus influenzae serotipo D)

UNION DE FRAGMENTOS DE ADN
Una vez disponible el ADN correspondiente a un gen de inters se puede proceder a tratar
tanto este ADN como el de un vector gentico )generalmente un virus i un plsmido con
una misma enzima de restriccin.
Por. ej.: Eco RI que produce extremos 5 - protuberantes de una sola cadena
(extremos cohesivos). Las molculas heterlogas se unen por simple apareamiento de
secuencias complementarias.
Otro mtodo consite en el empleo del agregado de nucletidos

complementarios sintticos aadidos tanto al ADN como al vector. Estos nucletidos son
molculas con 3 molculas de cido fosfrico:
BIOTECNOLOGA
15
VECTORES GENTICOS
El ADN que participa en las recombinaciones genticas puede formar parte
de varias estructuras. El nmero de genes da una idea del nmero de funciones que
codifica cada tipo de ADN.
BIOTECNOLOGA
16
ORGANISMO
O
ESTRUCTURA
. de csmidos
. de plsmidos
. de virus, fagos
. de bacterias
. de levaduras
. de clulas vegetales
y animales
N APROXIMADO
DE
GENES
.
.
.
.
10
10
10
10
. 10
10
10
Debemos recordar que mientras que el ADN procariota est constituido por una
secuencia continua, el ADN eucariota contiene regiones que codifican funciones o protenas
(llamadas EXONES) entre los cuales hay otras regiones que por el contrario, no se expresan
(llamadas INTRONES).
Un vector gentico es una molcula de ADN con un origen de replicacin distinto
del ADN cromosomal y que posee zonas de su genoma que no son esenciales para su
multiplicacin, donde pueden introducirse trozos de ADN exgeno.
Estos vectores actan como portadores de ese ADN permitiendo su replicacin en forma
de una molcula hbrida vector - ADN exgeno dentro de la clula anfitriona del vector.
En general, puede separarse fcilmente el ADN cromosomal del ADN del vector,
obteniendo as cantidades importantes del ADN insertado (CLONACIN).
Como vectores para la transferencia y clonacin de ADN ms utilizados son:
los plsmidos
los fagos atenuados o temperados
los csmidos
PLSMIDOS
Son molculas de ADN:
circulares
extracromosomales
autorreplicativas
1,5 x 10 = peso molecular = 200 x 10
los plsmidos grandes son conjugativos y existen de 1 a 2 copias. por cromosoma
bacteriano.
los plsmidos pequeos no son conjugativos y existen ms de 10 copias por
cromosoma bacteriano.
algunos plsmidos exhiben el fenmeno de la INCOMPATIBILIDAD por el que 2 plsmidos
relacionados no pueden ser mantenidos a la vez dentro de la misma clula.
los plsmidos son incapaces de aadir ADN exgeno al ADN de la clula anfitriona (por
BIOTECNOLOGA
17
ej.: por intercambio recproco de segmentos =

los plsmidos codifican para numerosas y variadas funciones celulares:
FERTILIDAD: capacidad de transmitir material gentico durante la conjugacin.

RESISTENCIA A ANTIBITICOS: son los plsmidos R que existen en ms de 50
especies de bacterias.
RESISTENCIA A METALES PESADOS: Col , Hg .
RESISTENCIA A LA RADIACIN ULTRAVIOLETA.
PRODUCCIN de substancias que inhiben o matan clulas de la misma especie
PRODUCCIN DE ANTIBITICOS
UTILIZACIN DE FUENTES DE CARBONO POCO FRECUENTES (ver cuadro)
FORMACIN DE TOXINAS Y ANTIGNOS DE SUPERFICIE.
INDUCCIN DE TUMORES EN PLANTAS: ej.: el plsmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens (tumores de agallas).
INFLUENCIA EN LA ESPORULACIN (Streptomyces)
PLSMIDOS CATABLICOS DE pseudomonas (SAUNDERS, 1987)

PLSMIDO
NAH
SAL
CAM
OCT
TOL
pJP1
pAC25
pAC27
SUBSTRATO QUE
DEGRADA
CONJUGATIVO
naftaleno
cido saliclico
alcanfor
octano, hexano, decano
p m-xileno y tolueno
c. 2,4 diclorofenoxiactico
3 - clorobenzoato
3 y 4 clorobenzoato
SI
SI
SI
NO
SI
SI
SI
SI
Aunque no puedan ser integrados al ADN cromsomico pueden conferir propiedades

importantes a la clula anfitriona y mantenerse dentro de la misma a travs de su
REPLICACIN AUTNOMA
Un plsmido ptimo para ser utilizado como vector en Ingeniera Gentica es aquel que:
a) tiene un control relajado de replicacin, o sea, puede replicarse
independientemente del ADN comosmico: esto permite obtener grandes cantidades del ADN
exgeno insertado en l;
b) la resistencia a antibiticos que confiere a la clula anfitriona debe permitir la
identificacin de las clulas que lo contienen;
c) posee secuencias de ADN con caractersticas tales que pueden ser
reemplazados por ADN exgeno sin que esta subtitulacin altere las caractersticas de
replicacin;
d) posee un amplio espectro de secuencias de reconocimiento para enzimas de
restriccin.
e) los sitios de restriccin se encuentran en el plsmido de tal manera que la
insercin de ADN exgeno en cualquiera de ellos deje utilizable al menos un marcador
fenfotpico para seleccin;
f) por seguridad, a veces es preferible que no sea conjugativo.
BIOTECNOLOGA
18
Para Escherichia coli se han diseado un gran nmero de plsmidos. Se ha

podido insertar en algunos de ellos hasta 5 10 kilopares de bases.
ALGUNOS PLASMIDOS DE Escherichia coli EMPLEADOS EN INGENIERA GENTICA
PLSMIDOS
Cco EI
pSC 101
pCR 1
SITIOS DE
RESTRICCIN
MARCADORES
Eco RI, Sma, Xma I,

Hind II, Pst 1
Elimm
Eco RI
Eco RI, Hind III, Sal I
Tc
Km
Elimm
pMB 9
Eco RI, Hind III, Sal I

Bam HI, Sph
Tc
Elimm
p BR 322
Eco RI, Hind III, Sal I,

Bam HI, Pst I, Pvu II
Ap
Tc
p BR 328
Eco RI, Hind III, Sal

I,
Bal I, Pvu II, Bam HI,
Pst, Pvu I.
Cm
Ap
Tc
p AT 153
P BR 327

I,
Xma III, Bam HI,
Pst I, Pvu I, Sph I.
I,
Bam HI, Pst I, Pvu I,
Sph I.
AMPLIFICABLES
Ap
Tc
Ap
Tc
+
+
+
+
* varios cientos de copias en presencia de clorofenicol

Elimm: produccin de COLICINA; TC , Km , Ap , Cm , resistencia a tetrasiclina,
Kanamicina, ampicilina y Clorombenicol.
Un vector gentico comnmente empleado es el pBR 322 que contiene: pBR 322
elementos necesarios para si replicacin (del pMB 29); ORI representa el origen de
replicacin del plsmido;
el gen Ap (del pRSF 2124) que confiere resistencia a la ampicilina;
BIOTECNOLOGA
19
el gen Tc (del pSC 101) que confiere resistencia a la tetraciclina;

una secuencia de nucletidos que puede cortarse con la enzima de
restriccin Bam HI;
secuencia de nucletidos que pueden igualmente cortarse con Eco RI,
Hind III, Sal I, Pvu II, Xma III, Sph I y Pst I.
.4363 pares de base
Si el plsmido se corta con BamHI para insertar el ADN exgeno se pierde la resistencia a la
tetraciclina ( 0 Sal I ).
Si se corta con Pst I, a la ampicilina.
Si se corta con Eco RI no pierde ninguna de las 2.
BIOTECNOLOGA
20
ESTRUCTURA COMPLETA DEL pBR 322
se muestran los sitios de ruptura.
direccin de transcipcin de los genes Ap y Tc

direccin de duplicacin semiconservativa del ADN
los nmeros corresponden al nucletido 5 de cada secuencia de reconocimiento.

(de R.W.OLD y S.B. PRIMROSE; "Principles of Gene Manipulatiin").
BACTERIOFAGOS
Los fagos presentan algunas ventajas sobre los plsmidos y de ellas la principal es
que pueden alojar mayores fragmentos de ADN exgeno.
El ms empleado es el BACTERIOFAGO LAMBDA DE E. coli.
El genoma del fago
es un ADN de doble cadena de un tamao de 50 Kb.
BIOTECNOLOGA
21
Se extrae de la cpside viral como una molcula circular, debido a que en sus extremos 5
posee 12 nucletidos protuberantes de cadena sencilla y de secuencia complementaria
(extremos cohesivos COS) cuya hibridacin permite la circularizacin de la molcula.
tan importante es el fago
como vector de clonacin, que A.D. HERSHEY ha
escrito en un libro para ocuparse de l (The bacteriofage lambda).
Slo haremos referencia aqu a sus principales caractersticas.
Si consideramos al fago
como una milcula lineal podemos esquematizarlo:
en la parte izquierda estn los genes requeridos para la sntesis del virus:
1 : protenas del CPSIDE
estructura
2 : protenas de la COLA
del fago
en la parte derecha estn:
5 : genes implicados en la lisis de la clula anfitriona
4 : genes que codifican la sntesis del ADN del fago.
a parte central est constituida por:
3 : genes que controlan la recombinacin e integracin de ADN exgena.
- xxx - xxx - : genes que no son esenciales para el desarrollo del fago.
vectores de
el ADN de esta zona es el que se puede emplear para fabricar

clonacin.
La zona central puede ser utilizada para:

reemplazar el ADN del fago por fragmentos exgenos de ADN que se pretende
clonar
vector
de reeplazamiento
insertar fragmentos de ADN exgenos
Vector
de insercin
despus de extrado de la cpside viral y de haber sido transformado en un vector

de reemplazamiento o en un vector
de insercin, el ADN del fago se reempaqueta en
la cpside obtenindose un virus infeccioso que contiene o porta fragmentos de ADN
exgeno.
los vectores
los vectores
de reemplazamiento tienen capacidad de hasta 25 kb.

de insercin tienen capacidad de hasta 18 kb.
(hasta 10 kb en los plsmidos)

BIOTECNOLOGA
22
COSMIDOS
Los csmidos son vectores genticos que pueden considerarse mezcla de
plsmidos y fagos.
posee genes que le confieren reistencia a antibiticos, el origen de replicacin de un

plsmido, los extremos cohesivos del fago , secuencias de corte por enzimas de
restriccin donde pueden colocarse los fragmentos de ADN exgeno que se quiere
clonar.
su tamao es PEQUEO : 5 kb.
tiene capacidad para fragmentos de ADN exgeno de hasta 45 kb.
OTROS VECTORES
Si bien la bacteria Escherichfia coli es la clula ms empleada como anfitriona
de ADNr, se han creado vectores que pueden funciones en otros tipos de clulas.
PARA PROCARIOTAS
Bacillus sp : sobre todo para producir enzimas;

Pseudomonas sp : son recomendables par hospedar plsmidos
recombinates debido a su capacidad para degradar muchos contaminantes.
PARA EUCARIOTAS
BIOTECNOLOGA
23
LEVADURAS
Las levaduras contienen el PLSMIDO 2
Se han construdo plsmido para levaduras para obtener protenas de
mamferos que pueden o no contener el plsmido 2
.
Algunos de estos plsmidos por contener secuencias del ADN cromosmico
de las
pueden replicarse dentro de ellas de manera autonma y estar presentes en
varias copias.
Las levaduras ms empleadas son:
. Saccharomyces cereviside
. Kluyveromyces fragilis
. Hansenula polymorpha
VEGETALES
Se han diseado vectores de clonacin de genes en vegetales empleando el

PLSMIDO Ti de Agrobacterium tumefaciens .
La bacteria Agrobacterium tumefaciens es inductora de tumores en forma de
agallas en los vegetales al incorporarse al ADN de las plantas.
Estos plsmidos se construyen cortando el plsmido Ti e insertando ADN
con el objeto de fmejorar el valor nutritivo o las caractersticas de flos frutos, incorporar la
resistencia a herbicidas, y se busca poder expresar en cereales los genes fijadores de
nitrgeno de RHIZOBIUM.
Clulas de mamfero
Se emplea el SV 40
El ADN de este virus tiene un peso molecular de 3 x 10 dalton.
Posee 2 sitios de restriccin:
uno para Hpa II
otro para Bam HI
Estas enzimas permiten cortarlo en 2 fragamentos:
uno que contiene un gen (GEN A) que codifica la protena requerida para la
replicacin viral junto al gen que codifica el origen de esta replicacin;
otro que contiene solamente los genes que codifican las protinas
estructurales del virus.
el primer segmento sirve para ligar el ADN que se quiere clonar obteniendose un virus
mutante capaz de donarse en las clulas anfitrionas del mono (las del rin).
INTRODUCCIN DEL ADN-R EN LA
CELULA ANFITRIONA
CASO DE PROCARIOTAS
Lo ms usual es:
a) introducir el ADN exgeno utilizando como vectores plsmidos y bacteriofagos
previo tratamiento de las bacterias con soluciones de Ca y Mg a bajas temperaturas.
b) el ADN - r si penetra con un bacteriofago puede hacerlo tambin segn el
BIOTECNOLOGA
24
mecanismo de la TRANSDUCCIN que ya hemos descripto.

c) molculas de ADN - r pueden penetrar en una clula bacteriana mediante un
mecanismo descripto como TRANSFORMACIN cuyo mecanismo puede describirse como
sigue:
TRANSFORMACIN
El ADN - r slo puede penetrar una bacteria en el momento de la divisin celular
en el que se est sintetizando la pared celular: en este estado del ciclo de
crecimiento las clulas se dicen COMPETENTES;
El ADN - r se une a esos lugares accesibles de la pared celular; unido el ADN r a la pared celular una de las fhebras del mismo es degradada por
endonucleasas;
la hebra no degradada ingresa a la clula bacteriana;
por fla existencia de zonas de homologa el ADN - r es ontegrado al ADN
cromsmico (por ej.: por intercambio recproco de segmentos).
d) por FUSIN DE PROTOPLASTOS

Se llama PROTOPLASTOS a las clulas desfprovistas de su pared celular.
Esto puede conseguirse por digestin de la pared celular con la enzima
LISOZIMA o bien por tratamiento con PENICILINA que es un antibitico inhibidor especfico
de la sntesis de la pared celular.
El polietilen glicol favorece la fusin de las protoplastos y la obtencin de una
clula hbrida vfiable (capaz de dividirse).
La fusin de protoplastos permite recombinar ADN provenientes de ce`pas y
hasta de especies diferentes y obtener as una clula hbrida.
La recombinacin de protoplastos se produce con la frecuencia superior al 20
% (relativamente alta).
Los protoplastos una vez fusionados reparan por recombinacin su ADN y
esto es muy importante porque su ADN y esto es muy importante porque la recombinacin
puede hacerse entre segmentos de muy diferente localizacin. . Algunos productos
obtenidos por BIOTECNOLOGA dependen de un gran nmero de genes (rutas
metbfolicas de produccin del metabolito, alteracin de la permeabilidad celular, etc.).
El rendimiento del proceso puede ser optimizado por irradiacin con
ultravioleta: esta es letal para los protoplastos que no han refparado por fusin y
recombinacin sus cromosomas.
CASO DE CLULAS EUCARIOTAS

a) La fusin de protoplastos que comenz aplicndose primero a clulas vegetales y
animales
Recordar que el producto de la fusin de 2 protoplastos es una nueva clula,
hbrida pero viable, es decir, capaz de dividirse y formar colonias.
b) la transformacin (introduccin de ADN - r) de clulas eucariotas desprovistas de
la pared celular , tanto para clulas vegetales como animales.
c) la microinyeccin (sobre todo en caso de clulas de mamferos).
BIOTECNOLOGA
25
RECONOCIMIENTO Y SELECCIN DE LAS

CLULAS QUE CONTIENEN ADN -r
genes marcadores
hibridacin
de colonias
por electroforesis
Por la presencia de genes marcadores
El reconocimiento y seleccin de clulas que contengan ADN recombinante
puede realizarse estudiando la presencia de genes marcadores includos en la molcula del
ADN - r.
Estos genes confieren a la clula anfitriona resistencia a algn antibitico, lo
que le permite crecer en presencia del mismo.
Despus de cortar, por ej.: el pBR 322 y el ADN que contiene el gen de
inters, utilizando una LIGASA se obtiene el plsmido con el ADN r. Luego se trasnforma
un cultivo de E. coli y se siguen los pasos del esquema.
HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICOS

Cuando se tiene ADN de una sola hebra la hidridacin consiste en la formacin de la
segunda hebra por simple complementariedad de bases. Es lo que se denomina
TRANSFERENCIA DE SOUTHERN En este mtodo, si se parte de un ADN natural (de 2
26
BIOTECNOLOGA
hebras), uno de los pasos intermedios ser, necesariamente, su desnaturalizacin, o sea la

obtencin de un ADN de cadenas sencillas.
Es decir, la TRANSFERENCIA SOUTHERN describe el proceso de hibridacin
de una sonda de ADN sencillo con ADN complementario. Este ADN complementario puede
estar marcado , por ej.: con P 32 , de manera de poder obtener una radiografa con rayos X.
La transferencia de SOUTHERN puede realizarse a partir de una placa de
electrofresis en agarosa o bien a partir de un cultivo en cajas de Petri.
La TRANSFERENCIA DE NOTHERM hibrida ADN de una sola hebra pero con
ARN marcado, por ej.: con P lo que permite la posterior obtencin de una imagen
radiogrfica con rayos X.
HIBRIDACIN DE COLONIAS
Este es el mtodo ms til.
Debe disponerse de una SONDA que consiste en un cido nucleico con una
secuencia Complementaria y posee un marcador radioactivo (generalmente P ). En este
mtodo se parte de las colonias cultivadas en agar y presumiblemente transformadas.
A partir de esta "placa madre" se hace una REPLICACIN EN PLACA.
Esta consiste en hacer contactar una almohadilla estril de terciopelo con la
"placa madre"
Con la almohadilla de terciopelo se lleva la imagen especular de las colonias de
la "placa madre" a una membrana filtrante de nitrocelulosa que luego se deposita sobre otra
caja de Petri que contiene un medio nutritivo slido.
Los nutrientes difunden a travs del filtro lo que permite obtener despus de la
incubacin lo que hemos dicho es la imagen especular de la "placa madre".
BIOTECNOLOGA
27
..
A continuacin se lisan con un lcali las colonias que han desarrollado sobre la
membrana filtrante.
Esta operacin tambin desnaturaliza su ADN (lo corta en 2 hebras) y este
ADN se fija por calentamiento a 65 C.
BIOTECNOLOGA
28
El resultado de estas operaciones es la substitucin de las colonias por ADN

desnaturalizado y fijado en el mismo sitio que ellas ocupaban.
A continuacin, la membrana filtrante se incuba en una solucin de la sonda
marcada con P a temperatura tambin de 65 C. La sonda marcada slo se hibridar
cuando haya complementariedad perfecta entre las 2 hebras de ADN.
Luego se procede a lavar el filtro para eliminar la sonda que no se ha unido.
Una radiografa por exposicin a los rayos X del filtro permite conocer las
posiciones de la sonda hibridada y a partir de ellas seleccionar, recuperar y cultivar las
colonias transformadas
RECONOCIMIENTO Y SELECCIN DE CLULAS
CON ADN- r POR ELECTROFORESIS SOBRE GEL
La TRANSFERENCIA SOUTHERN consta de los siguientes pasos:
El ADN celular, de alto peso molecular se fragmenta con varias enzimas de

restriccin
Los fragmentos obtenidos en cada uno de los ataques se separan por tamaos
empleando electroforesis en gel de agarosa;
Luego el gel de agarosa se coloca sobre una hoja de nitrocelulosa;
Se hace pasar una solucin amortiguadora para que los fragmentos de ADN pasen
a
la hoja de nitrocelulosa.
Sobre la hoja de nitrocelulosa queda una rplica de los fragmentos de ADN sobre el
gel
de agarosa;
Se desnaturaliza el ADN con lcali (se obtiene ADN monofilar) y se fija a 65 C;
Se hbrida con una sonda de ADN monofilar marcado con P ;
Los fragmentos de ADN que hayan hibridado con la sonda se harn visibles despus
de una autorradiografa con rayos X.
La TRANSFERENCIA NOUTHERN slo se diferencia de la SOUTHERM en que la sonda
empleada para hibridar el ADN monofilar es una sonda, tambin marcada con P , pero no de
ADN sino de ARN.
Como slo el ARN- m se puede hibridar a un ADN monofilar, la primera
operacin
OPCIN
es aislar el ARN-m.
Para aislar el ARN-m del ARN-r y del ARN-t se puede utilizar la propiedad, ya
mencionada, de que el ARN-m presenta una cola poli-A en el extremo 3.
La separacin se realiza haciendo pasar la mezcla de cidos nucleicos a travs de una
columna de celulosa con extremos poli-T.
El ARN-m se hace hibridar luego con el ADN desnaturalizado total. Luego se lava, con
lo cual el ARN-m no hibridado es eliminado.
A continuacin se libera el ARN-m hibridado y se lo traduce "in vitro".
Se determina la estructura de la protena y a continuacin se selecciona el clon que
contena el ADN-r lavado.
BIOTECNOLOGA
29
ARN total
. aislamiento de ARN-m utilizando una columna de celulosa oligo . d T
. hibridacin de todo el ARN-m con el total del ADN
. lavado de los ARN no hibridados
. liberacin del ARN-m hibridado
. traduccin "in vitro" del ARN-m hibridado
. determinacin de la estructura de la protena producida
. seleccin de los clones que poseen el ADN-r buscado.
La opcin ms sencilla, si se conoce la estructura de la protena que codificar el ADN-r

buscado, es sintetizar el ARN.m correspondiente marcndolo con P
(verdadera
TRANSFERENCIA NORTHERN).
BIOTECNOLOGA
30
SECUENCIACIN DEL ADN

La secuenciacin del ADN representa el paso ltimo en la caracterizacin del gen..
Deben destacarse que:
hay programas de computacin que permiten comparar secuencias de manera eficiente
(FRISTENSKI et al. )
existen bancos de informacin sobre secuencias nucleotidicas que pueden ser consultados
y que contienen todas las secuencias de genes que han sido publicadas (GENBANK)
De todas maneras, la secuencia de nucletidos en un gen slo puede ser
deducida parcialmente
porque la secuenciacin abarca slo la parte codificadora del gen y dejfa de lado los
sectores reguladores y aquellos que no codifican (INTRONES).
la secuenciacin no tiene en cuenta que un aminocido puede ser codificado por ms de
un cordn.
Debemos recordar que el ADN crece siempre en el sentido 5 ----- 3 por
incorporacin de un desoxirribonucletido trifosfato en el extremo 3 (oxhidrilo libre). Los 4
desoxirribonucletidos trifosfato son:
d TTP : desoxitimidina - tri - P
d ATP : desoxiadenosn- tri - P
BIOTECNOLOGA
31
d CTP : desoxicitosina - tri P

d GTP : desoxiguanidin - tri P
Es evidente, que si alguno de los 4 desoxirribonucletidos - tri- P, no contiene el
oxidrilo en la posicin 3 (ser entonces un di - desoxirribonucletido - tri ) se convertir en
un TERMINADOR DE LA CADENA.
Uno de los mtodos de secuenciamiento de ADN es el de SANGER - NICKEN COULSON que consite en lo siguiente:
a) se parte de una hebra de ADN a la que se le adosa un cebador o iniciador corto
de ADN (esto implica el conocer el extremo o desconocida esa secuencia "pegar" primero una
conocida);
b) se divide en 4 alicuotas iguales;

c) a cada una de ellas se agrega un desoxirribonucletido - tri - P marcado
radioactivamente y un di - desoxirribonucletido - tri - P (terminador); una porcin con A, otro
con C, otra con T y otra con G; y adems ADN - polimerasa;
d) se hacen correr los compuestos de A, T, C y G por electroforesis sobre un gel
de poliacrimida, cada una de las mezclas por un camino;
e) en cada uno de los 4 casos la ADN polimerasa ha ido produciendo la cadena
BIOTECNOLOGA
32
complementaria, incorporando por lo menos una vez una de las cuatro bases nitrogenadas A,
T, C y G.
e) cada una de las 4 cadenas complementarias se cortar cuando se incorpore
a la misma un di- desoxirribonucletido - tri - P (terminador).
f) se hacen correr paralelamente cada una de las 4 mezclas reaccionantes por
electroforesis sobre un gel de poli - acrilamida;
g) la electroforesis separa los fragmentos sintetizados por la ADN - polimerasa,
h) la autorradiografa por exposicin a los rayos X permite ubicar las bandas de
cada producto de reaccin.
i) el patrn obtenido puede leerse directamente.
ALGUNAS APLICACIONES DE LA
INGENIERA GENTICA
POLIMERIZACIN EN CADENA DEL ADN
La ampliacin "in vitro" del ADN (o PCR: Polymerase Chain Reactin) ha
significado una autentica revolucin en la Biologa.
Fue desarrollada en 1985 por K.B. MULLIS de la empresa norteamericana
CETUS.
Permite obtener en un breve tiempo grandes cantidades de copias de un trozo
de ADN a partir de muy poco ADN (incluso el aportado por una sola clula).
La patente de la PCR fue comprada por la empresa HOFFMAN - LA ROCHE.
Sus aplicaciones comprenden desde la investigacin de una mutacin en un
embrin (problema tico: podra as impedirse el nacimiento de un nio a travs de un
diagnostico prenatal de enfermedades hereditarias graves), descubrir una infeccin virica o
bacteriana, seguir la evolucin de un cncer, establecer la paternidad o no de un nio e
incluso, hasta identificar a un criminal.
En la prctica, el ndice medio de ampliacin de una PCR es de
33
BIOTECNOLOGA
aproximadamente un milln.
Supongamos que deseara investigar una anomala de la hemoglobina en el
marco de un diagnstico prenatal.
El gen responsable, supongamos est compuesto de 1.500 nucletidos. una
toma de sangre del feto a la madre embarazada aportara como mnimo unas 10.000 clulas.
De estas 10.000 clulas se obtendran 10 g del ADN genmico del feto y de
estos slo 10 g del ADN de ese gen.
Y esto, puede realizarse en pocas horas mientras que las tcnicas clsicas que
hemos visto con el uso de enzimas de restriccin y de los vectores adecuado llevara varias
semanas.
10 g de ADN se analizaran rpidamente a travs de una electroforesis. Por
ej.
Veamos en un esquema en que consiste la tcnica de la PCR.
Se puede observar que el ADN se multiplica en forma exponencial.

problema de los CEBADORES
Se necesita inexcusablemente conocer la secuencia de por lo menos los
extremos del ADN.
En la prctica, cuando se buscan determinadas contaminaciones, el equipo de
un costo de $ 30.000, contiene un "banco" de cebadores (para Salmonella, Shigella, virus de
la hepatitis B, agentes de enfermedades como lepra, tuberculosis, etc.).
Si se conoce la secuencia de aminocidos de una protena, a travs del Cdigo
Gentico, pueden sintetizarse los cebadores correspondientes para ampliar y estudiar el gen
que codifica su sntesis. Si se conoce alguno de los e extremos se puede sintetizar el
cebador correspondiente y fijar en el otro un ANCLA constituido por una serie de C o G.
Cuando se
desconocen ambos, se fijan ANCLAS en los 2 extremos.
las condiciones experimentales deben ser optimizadas para conseguir los mximos
BIOTECNOLOGA
34
rendimientos.
ventajas : pone en evidencia las formas "viables pero no cultivables" de microorganismos
pero amplifica tambin ADN de clulas muertas.
problemas de contaminacin: deben extremarse los cuidados pues una sola molcula
de
ADN intruso, por la sensibilidad del mtodo, puede llegar a falsear los resultados.
LOS PROBLEMAS TICOS DE LA PCR
podra llegarse a un abuso del diagnstico prenatal y a que la sociedad
slo aceptara a individuos que gozarn de buena salud.
la PCR podra generar una discriminacin de individuos en el plano
laboral;
pondra a los padres en la disyuntiva de aceptar o no tener algn defecto;
las huellas genticas pondran al descubierto que en Europa, por ej.: ms
del 10
% de los hijos que se presumen legtimos son en
realidad adulterinos;
en Francia (en 1991) la ley estableci que al margen de los fines mdicos o
cientficos, la identificacin gentica de las personas, an en
casos judiciales, slo
puede realizarse con el acuerdo expreso
de las personas a quienes se toman
muestras.
La identificacin de personas a travs de la PCR esta basada en :
si bien el ADN humano presenta mnimas variaciones de un individuo a
otro,
existen en el genoma regiones llamadas MINISATLITES
y MICROSATLITES
variables y repartidos a lo largo de los
cromosomas;
para poder diferenciar una persona de otra slo interesan las fracciones
de ADN
polimrficas, es decir que sean muy distintas de una
a otra persona:
los MINISATELITALES sin pequeas secuencias de bases que se
repiten. Por ej.:
si una hebra de ADN normal fuera:
... A G G A T G C T C A A T...
Un minisatlite seria
... A G G G C T C T C T C T CT C T C T T G C T C A A T...
se presenta como una sucesin de un par de bases nitrogenadas repetidas "n" veces,
mientras que un MICROSATLITE no sobrepasa de un par de bases copiadas
sucesivamente no ms de 5 veces;
los genetistas han logrado identificar algunas de estas secuencias
hepervariables de una persona a otra, no solo por su constitucin sino
por su longitud;
los genetistas han sintetizado a partir de estas secuencias sondas
radioactivas
capaces de identificar los minisatlites que
constituyen lo que llamaramos una
verdadera HUELLA
GNICA : en una electroforesis se obtiene para cada persona
lo que sera equivalente al CDIGO DE BARRAS con que se
identifican los
productos en un supermercado;
en la HUELLA GNICA de un individuo slo aparecen dos bandas
35
BIOTECNOLOGA
individuales:
una heredada del padre y otra de la padre.
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
ABUELO
ABUELA
ABUELO
ABUELA
PADRE
MADRE
HIJO 1
HIJO 2
HIJO 3
MATERNO
MATERNA
PATERNO
PATERNA
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Para producir anticuerpos habra que inyectar animales con los antgeneos,
esperar que estos los produjeran, extraer la sangre y separarlos del suero. El procedimiento,
largo y tedioso, permita obtener, en cantidades limitadas, anticuerpos que variaban de un
animal a otro en especificidad y afinidad, y que adems contenan protenas contaminantes.
Con el descubrimiento de CESAR MILSTEIN se puede disponer ahora de
anticuerpos absolutamente homogneos, que se pueden producir en forma continua y con la
misma especificidad y afinidad.
En los aos de la dcada de los 90, la venta de anticuerpos monoclonales
supera holgadamente los 4.000 millones de pesos anuales.
las clulas productoras de losa anticuerpos son los LINFOCITOS B que se extraen del
BAZO y pueden cultivarse "in vitro" aunque no sobreviven ms all de algunas divisiones.
el descubrimiento de MILSTEIN consisti en FUSIONAR los linfocitos B con clulas

MIELOMATOSAS (clulas cancerosas de un tumor de finfocitos) en un medio de cultivo
adecuado al que adems se agrega POLIETILENGLICOL.
como las clulas MIELOMATOSAS tienen capacidad de vivir indefinidamente, las clulas
que se obtienen por fusin y se llaman HIBRIDOMAS , no slo puede crecer indefinidamente
sino que adems producen los mismos anticuerpos que los linfocitos B.
como slo una de cada 2 X 10

clulas de linfocitos B logran fusionarse, deben
eliminarse las clulas mielomatosas no hibridadas.
para ello se usan clulas mielomatosas genticamente alteradas y por ello incapaces de
sintetizar la HIPOXANTINA - GUANINA - FOSFO - RIBOSIL - TRANSFERASA.
como esta enzima slo la producen los linfocitos

HIBRIDOMAS.
BIOTECNOLOGA
B , slo lograrn sobrevivir los

36
.
Para producir industrialmente los anticuerpos monoclonales se emplea un mtodo
denominado ENCAPEL
Los hibridomas se colocan en una solucin de ALGINATOS (substancia derivada
del alga GRACILARIA.
Luego, se vuelcan por gotas en otra solucin de polmeros de ALMIDN y quedan
as finalmente encapsulados.
Encapsulados los hibridomas, como el almidn polimerizado permite el pasaje de
BIOTECNOLOGA
37
gases y nutrientes, se reproducen a la vez que tambin a travs de la cpsula eliminan los
productos de desecho.
Cuando se alcanza la concentracin adecuada de anticuerpos monoclonales, stos
se recuperan por ruptura de la cpsula, tal como se ve en el esquema
Algunos de los usos de los anticuerpos monoclonantes
diagnostico de:
. embarazos
. hepatitis
. virus del SIDA, bacterias, parsitos
. cncer
teraputica de:
. leucemia
. cncer
. prevencin de rechazos en trasplantes
industriales: . purificacin en columna de:
interfern
insulina
hormona de crecimiento
etc.
MILSTEIN no patent su descubrimiento: su modestia no le permiti imaginar el

cambio que produciran los anticuerpos monoclonales en la ciencia.
TRATAMIENTO DEL CNCER CON ANTICUERPOS MONOCLONALES
Hasta hoy, el tratamiento del cncer sigue siendo un problema sin solucin.
Aunque hay drogas que sirven de inhibidores de las clulas cancerosas y pueden matarla, y es la
que se llama QUIMIOTERAPIA DEL CNCER, muchas veces estas substancias tambin son
BIOTECNOLOGA
38
txicas para clulas normales: an a dosis moderadas generalmente producen efectos

secundarios muy desagradables. Lo mismo puede decirse del tratamiento con
RADIACIONES
En los ltimos aos se trabaja sobre una idea qie podra denominarse BALA
MGICA. Dentro de este concepto, un antibitico puede ser considerado como una bala
mgica. Se sabe que los antibiticos matan e impiden la proliferacin de clulas bacterianas sin
afectar mayormente clulas de tejidos animales o vegetales. Esto sucede porque la mayor parte
de los antibiticos solo inhiben procesos metbolicos propios de las clulas procariotas. Ms
dficil es el combate de hongos y ms an de enteroparsitos que por ser clulas eucariotas
tienen metabolismos muy semejantes a las clulas de los mamferos por lo cual las substancias
que son txicas para ellos tambin lo son para las clulas hospedadoras.
Hoy se sabe que flas clulas cancerosas llevan sobre su membrana ANTIGENOS
diferentes a los de las clulas normales.
La idea de una bala mgica para combatir clulas cancerosas est sustentada en
el hecho de preparar anticuerpos monoclonales especficos para esos antgenos y que a su vez
stos lleven adherida alguna substancia txica capaz de destruir clulas cancerosas. Esta
puede, a su vez, provenir de bacterias, plantas o sntesis qumica.
Como antecedentes de proyectos en marcha sobre este fundamento pueden
citarse los llevados a cabo por :
- INSTITUTO NACIONAL DEL CNCER (EEUU de A)
- CLNICA SCRIPPS (California, EEUU de A)
- CITOGEN (EEUU de A)
- CARLO ERBA (Italia)
- LABORATORIOS LILLY (EEUU de A)
etc., etc.
BIOTECNOLOGA
39
INSULINA HUMANA
Uno de los primeros objetivos de la Ingeniera Gnetica fue la de poder producir
a bajo costo substancias caras y aplicacin mdica de limitada produccin.
La primera de estas substancias de importancia terapetica en producirse fue la
insulina humana.
Como ya era conocida la secuencia de aminoacidos de las 2 cadenas (A y B)
de la insulina, a travs del Cdigo Gentico se sintetizaron los ARN-m por separado y de
ellos los ADN-c complementarios correspondientes.
A cada uno de los ADN-c se uni el gen de produccin de la
galactosidasa.
Luego en los lugares ECO RI y BAM HI del vector gentico pBR 322 se introdujeron los
ADN en forma independiente. Se obtuvo as 2 lneas de Escherichiae coli por
transformacin.
BIOTECNOLOGA
40
Las 2 lneas de bacterias se cultivaron por separado en un medio que contena

tiogalctosido inducindose as la produccin de 2 protenas hbridas: cada una contiene
galactosidasa unida a travs de metionina a la respectiva cadena de insulina.
Las protenas as obtenidas se separan y purifican.
Se tratan luego con BrCN que corta las protenas a nivel de las metioninas. Se
purifican las cadenas sin metionina y luego se oxidan junatas abtenindose inulina humana
activa. Esta produccin de insulina humana no slo abarat los costos y los problemas de
disponibilidad de pncreas de animales (vacunos) sino que por su elevada pureza elimin las
reacciones inmunolgicas de algunos pacientes.
conocimiento de la
estructura de la insulina humana
(cadenas A y B)
ARN-m)
ARN-m)
ADN (gen) de la
- galactosidasa
ARN-m) - ARN-m)
ARN-m) - ARN-m)
ADN-c
p BR -322
sitio
ECO - RI
CADENA A
2 cepas transformadas
de E. coli
cultivos en medio
con tiogalctosido
CADENA B
meteorito
meteorito
Br CN
CADENA A
PRODUCCIN DE
INSULINA HUMANA
sitio BAM HI
Br CN
OXIDACIN DE LAS
2 CADENAS JUNTAS
CADENA B
INSULINA
PRODUCCIN DE ASPARTAMO
El aspartamo es el L - aspartil - L - fenilalamina ster.
BIOTECNOLOGA
41
(ASPARTAMO)
dipptido Asp - Phe
El aspartamo es un producto importante como EDULCORANTE en los

denominados productos DIETTICOS.
En solucin acuosa, el dulzor del aspartamo es 200 veces superior al de una
solucin de sacarosa al 4 % (40g/l).
Para produccin industrial de aspartamo se utilizan L - asprtico y L - fenilalamina,
cuyas producciones pasaron desde 1981 (50 ton.) a ms 4.000 en 1997.
El aspartamo es el dipptido Asp - Phe.
El aspartamo est contraindicado en aquellos individuos que padecen de
FENILCETONURIA o IDIOTEZ FENILPIRVICA.
La fenilcetonuria es una enfermedad hereditaria de carcter recesivo y del tipo
metablico y no ligada al sexo.
Algunos ejemplos (que podramos haber citado antes)
daltonismo
recesivas
Enfermedades
hemofilia
hereditarias
ligadas
dominantes raquitismo - vitamina D - resistente
al sexo
____________________________________________________________________________
metbolicas
Enfermedades
BIOTECNOLOGA
fenilcetonuria
Diabetes mellitus
albinismo total
42
heriditarias
no ligadas
al sexo
metablicas
no recesivas
enanismo
albinismo parcial
no metablicas
recesivas
sordomudez
hereditaria
no metablicas
dominantes
polidactilia
braquidactilia
La fenilcetonuria, por defecto de genes recesivos, se traduce en la ausencia de la

enzima que transforma la fenilalamina en tirosina (una HIFROLASA) por lo cual la fenilalamina
se convierte en cido fenilpirvico:
Mediante las tcnicas de la Ingeniera Gentica, ha sido posible obtener un polmero o

polipptido que por accin enzimtica puede ser convertido en el dipptido aspartil fenilalamina o aspartamo (comercializado bajo la marca NUTRASWEET).
Cmo se lo ha conseguido?
Si consultamos el CDIGO GENTICO veremos que los codones:
para Phe son: UUU
UUC
BIOTECNOLOGA
43
UUA
para el c. Asp.:
GAU
GAC
Estos codones, en el ADN sern tripletes:

AAA
para Phe
AAG
AAT
CTA
para Asp
CTG
habr que sintetizar los tripletes correspondientes al ADN.

Estas estructuras, pueden corresponder, por ej.
OLIGONUCLETIDO:
a las siguientes para este
HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANO

Es un polipptido de 191 aminocidos producida por la glndula pituitaria. Regula
el crecimiento corporal.
Su escasez puede llevar a la baja estatura de algunos enanos.
Para obtenerla se combin la sntesis qumica del ADN que codifica los
aminocidos 1 24, anteponindole el triplete ATG (que codifica METIONINA), esto asegura la
iniciacin correcta de la traduccin, y se uni este ADN al gen productor de la
44
BIOTECNOLOGA
galactosidasa de Escherichia coli.

Para los aminocidos 25 191, se copiaron los ARN - m de glndula pituitaria
humana, que por retrotranscripcin se convirti en el ADN-c para el segmento 25
191.
Con la enzima de restriccin Hae III (GG CC) se lo cort justo delante del triplete
correspondiente al aminocido N 25 y se peg al extremo del fragmento resultante un triplete de
terminacin.
Se clonarn por separado los 2 ADN. Se unieron con un ADN ligasa, a travs del
gen de la
galactosidas, y se lo incorpor al pBR -322.
Se clon el gen en la bacteria. Se obtuvo su expresin y grandes cantidades de fla
hormona de crecimiento humano unida a
galactosidas de Escherichia coli a travs del
aminocdio metionina.
Se hidroliz "in vitro" el producto as obtenido utilizando BrCN (bromuro de
ciangeno o cianuro).
Se intenta representar los pasos de la tcnica seguida en el esquema siguiente.
APLICACIONES DE LA INGENIERA GENTICA EN LA AGRICULTURA

Con seguridad, la manipulacin gentica de plantas y animales ya est
produciendo una verdadera revolucin en la produccin de alimentos.
En lo que va del siglo, ser el tercer gran cambio:
BIOTECNOLOGA
45
del
a) el primero, se produjo entre 1920 y 1950 con la mecanizacin, o sea el reemplazo

hombre y del animal por las mquinas;
b) el segundo, que se llam revolucin verde , se produjo entre 1950 y 1980 con el
empleo de fertilizantes y de productos qumicos para combatir las plagas;
c) la manipulacin gentica y la obtencin de plantas y animales transgnicos est ya

produciendp un gran impacto y a esto debemos agregr la posibilidad de clonar
animales,
como los mamiferos, con una mejora substancial de las razas y resistencia a
enfermedades.
MICROPROPAGACIN DE VEGETALES
La micropropagacin de vegetales, basada en una reproduccin ASEXUAL, es
un procedimiento relativamente sencillo que, entre otras ventajas, presenta las siguientes:
acortamiento de los plazos naturales de desarrollo de los vegetales, sobre todo

cuando
se reproducen slo por semillas que tardan muchos das en
germinar (caso de rboles de
maderas preciosas; palmeras como las que
producen cocos; dtiles o aceite de palma)
obtener un cultivar de plantas exactamente iguales en su resistencia a

enfermedades,
calidad y cantidad de los frutos, etc.
producir en poco tiempo un nmero, prcticamente tan grande como se quiera,

de
plantas exactamente iguales (ej.: las necesarias para implantar un
viedo de varietale finos)
entre las propiedades de las plantas obtenidas por esta metodologa se

pueden conseguir aumentar sus contenidos en aminocido esenciales o
vitaminas.
(ESTO VA DESPUS DEL GRFICO DE LA PGINA SIGUIENTE)
Aparte de poder producir miles de plantas al mismo tiempo, esto posibilita el poder
someterlas luego a variables adversas como la sequa, la salinidad del terreno, alguna
enfermedad en particular, etc., para recomenzar con la/s sobreviviente/s y obtener el cultivar que
cumple con todas las expectativas.
Se ha logrado obtener as zanahorias, alfalfa, arroz, maz ricas en determinado
cido aminado o vitamina.
MICROPROPAGACIN DE VEGETALES
BIOTECNOLOGA
46
BIOTECNOLOGA
47
APLICACIONES DE LA INGENIERA GENTICA A LA GANADERA

Animales transgnicos
La cra de convencional de animales ha conducido a razas adaptada a un clima
o fin determinado. La posibilidad de transferir material genico de una a otra raza puede
acelerar enormemente este proceso.
El aumento del tamao incorporado al cigote el gen de la hormona humana de
crecimiento ha tenido xito en salmones y vacas. En aves de granja, ha reducido
cesiblemente la tasa de reproduccin.
Otros objetivos han sido el aumento de la lactacin en vacas, e incluso la
produccin de leche conteniendo protenas medicamentosas, la mejora de las calidades del
cuero y de la lana, etc.
Hast hoy, la tcnica de obtencin de animales transgnicos tiene muy bajo
rendimiento. Probablemente la CLONACIN permita resolver este problema.
La produccin de leche por vacas transgnicas proporcionara una leche libre
de productos alergnicos y con protenas humanas lo que la hara ideal para alimentar bebs
prematuros.
Clonacin de animales
Desde hace varias dcadas, las multinacionales de Biotecnologa compiten en
dos frentes:
la mejora de la productividad y de la calidad de la cabaa ganadera;
la explotacin de animales transgnicos, es decir que portan genes extraos,
destinados a producir en su leche protenas de inters terapetico.
El concepto de clonacin no es nuevo, sobre todo par los veterinarios.
Una "historia" de lo ocurrido desde 1950 podra ayudar a ubicarse a algunos:
1950 : se logra congelar con xito semen de toro a 79 grdos bajo cero para su
transporte
e inseminacin de vacas.
1952 : a partir de clulas indiferenciadas, Thomas KING y Robert BRIGGS
logran clonar
ranas
1962: John GOURDON logra clonar ranas a partir de clulas de renacuajos;
1978: Nace el primer bebe concebido mediante "fecundacin in vitro". Ese
mismo ao, la pelcula "Los Nios del Brasil" plantea la posibilidad de obtener
rplicas clnicas de
Adolf HITLER
1982: Cientficos de la Universidades de Seattle (San Diego) y California
obtienen el primer ratn transgnico, portador del gen de la hormona de
crecimiento de la ratas;
1984: primer nacimiento de un beb a partir de un embrin congelado
1985 : Ralph BRINSTER obtiene cerdos que producen en su leche la hormona
de
crecimiento humano.
1987 : Primera cepa de ratones transgnicos que portan genes humanos.
1992 . Primera inyeccin intra citoplasmtica nuclear de espermatozoides;
1993 : Steven SPILBERG produce la pelcula "PARQUE JURSICO"
(dinosaurios
clnicos).
BIOTECNOLOGA
48
1998 : El Dr. Richard SEED anuncia su intencin de clonar bebs humanos.
Qu representa DOLLY?
la cordera DOLLY fue "concebida" por Ian WILMUT y su equipo de

investigadores del Instituto ROSLIN, de Edimburgo (Escocia).
DOLLY es la prueba viviente de la resolucin de uno de los mayores desafos
de la Biologa moderna: no slo la clonacin de mamferos, sino la
manipulacin gentica de una clula de un individuo adulto para obtener una
copia idntica de l.
DOLLY representa la culminacin de ms de 5 dcadas de investigaciones,
con ms fracasos que xitos. Ya en las postrimeras de la Primera Guerra
Mundial, el embrilogo alemn fue tildado de loco al proponer sustituir el
ncleo de un vulo de rana (N) por el de una clula de embrin (2N) de este
batracio. Recin en 1952, los norteamericanos Thomas KING y Robert
BRIGGS, consiguen llevar a cabo esta experiencia y demostraron adems que
las primeras divisiones celulares que acontecen despus de la fecundacin
son clulas indiferenciadas (clulas TOTIPOTENTES). Hasta ese momento no
ha comenzado la diferenciacin tisular. Cuando este proceso comienza, los
cientficos no consiguieron, hasta DOLLY, la clonacin a partir de una clula
diferenciada o SOMATICA
El esquema muestra someramente como naci DOLLY con un xito sobre 277
embriones obtenidos por la tcnica empleada.
A DOLLY siguieron GEORGE Y CHARLEY, dos terneros engendrados en

Inglaterra (pero a partir de clulas embrionarias) y la ternera MARGARITA,
clonada por Jean- Paul RENARD (DELinra, fRANCIA) a partir de clulas
musculares extradas de un feto bovino de 60 das.
ALGUNAS DE LAS POSIBLES APLICACIONES DE LA CLONACIN

Estudios sobre el envejecimiento
Como DOLLY contiene por un lado el ADN de las clulas mamarias adultas de la
oveja blanca y mitocondrias de la oveja con manchas negras, se podr estudiar el papel de las
mitocrondrias en el proceso de envejecimiento.
BIOTECNOLOGA
49
Frmacos puros y baratos

La produccin de animales transgnicos como vacas y ovejas permite producir
leche con protenas humanas de uso teraputico. Como la obtencin de animales
transgnicos tiene muy bajos rendimientos, la clonacin podra resolver este problema.
Terapia celular
Si se consiguiera clonar clulas humanas sin tener que fusionarlas con vulos
enucleados, se podran producir clulas sanas para tratar patologas como algunos cnceres,
BIOTECNOLOGA
50
la diabetes o el mal de Parkinson.

Animales "humanizados" para obtener rganos para trasplante
La clonacin de animales portadores de genes humanos podra proporcionar
animales que "donen" sus rganos para hacer trasplantes (ej.: cerdos para trasplantes de
corazn) (ya vimos que un corazn de cerdo "humanizado" fue trasplantado a un mono en
1996). Se alejara as el fenmeno indeseable del rechazo.
Solucin a la infertibilidad humana.

Las parejas estriles podran recurrir a la clonacin para tener hijos: por ej. los
espermatozoides podran ser sustituidos por otras clulas o un vulo (N) ser enucleado para
inyectarle un juego de cromosomas (N) de la madre.
Solucin a la extincin de especies animales o vegetales

Como se dispone de clulas congeladas de especies en vas de extincin
(como el oso panda, el rinoceronte de Sumatra, etc.) se podra utilizar la clonacin como una
solucin posible.
Leche para nios prematuros

Vacas transgnicas podran suministrar leche libre de substancias alergnicas y
con protenas ideales para bebs prematuros.
Experimentacin con animales modelo

La clonacin de primates modelo podra, por ej.: servir para estudiar algunas
enfermedades graves de los humanos, como la fibrosis qustica )de origen hereditario)
DESAFO PARA LOS PASES EN VAS DE DESARROLLO

En primer lugar, no debemos creer en que los cientficos de los pases
desarrollados trabajan por la humanidad, y si lo hacen en verdad, quienes los patrocinan
esperan resarcirse de su inversiones a travs del pago de patentes de invencin.
As, para descubrir los productos transgnicos de las naturales, una de las
maneras ms sencilla ha sido incorporar como los genes de inters el gen de la LUCIFERINA
La LUCIFERINA es una protena responsable de la bioluminiscencia, fenmeno
biolgico difundido en protozoos, algunos peces y ciertas bacterias.
En presencia de ATP y de xigeno, la enzima LUCIFERSA cataliza la
reaccin:
luciferina
ATP
luciferina + ADP + luz
La luciferasa viene en un pequeo frasco, un trozo del vegetal o leche

transgnica o carne animal transgnico o bacteria transgnica, proporcionan el ATP. La luz
emitida es captada por un censor como "luz fra", como los empleados para dilucidar si un
billete es o no verdadero.
Este ensayo, tan sencillo, pone al descubierto el uso de un ser transgnico y el correspondiente
y debido pago de patentes.
En segundo lugar, debemos tener muy presente, que en particular la Repblica
Argentina, tiene un potencial enorme de recursos naturales para desarrollar la BIOTECNOLOGIA
y otro tanto en recursos humanos. Recordemos que este desarrollo de la BIOTECNOLOGIA DE
AVANZADA no solo tenemos a Bernardo HOUSAY, Luis LELOIR y Csar Milstein, sino toda una
escuela argentina representada entre otros por la fundacin Campomar, el INTA, el INGEBI,
BIOSIDUS.
BIOTECNOLOGA
51
Slo hacen falta el convencimiento de los jvenes para emprender una tarea
estratgica para el desarrollo nacional, y sobre todo, la DECISIN POLTICO
Sera muy injusto olvidar al Dr. Atanasio QUIROGA, descubridor de la ARGININA
(conf. Pars 25/04/1896)
BIOTECNOLOGA
52

Ingen Gen

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INGENIERA GENTICA

(TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE ) ( CLONAJE)

Para la centrifugacin se comienza a velocidades bajas para que se sedimenten

El sobrenadante de esta primera centrifugacin contiene fragmentos de

culote: nucleos y clulas intactas

2 centrifugacin : a 20.000 g, 20 min.

culote: mitocondrias y cloroplastos

3 centrifugacin: a 10.000 g , 1 hora

4 centrifugacin: a 150.000 g , 3 horas

FRACCIONAMIENTO DE LOS COMPONENTES CELULARES:

cromotografa de afinidad de columna

mxima a los 260 nm.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL ADN.

El punto Tm de transicin de doble cadena a cadenas sencillas, punto de fusin, es una

OVEJA Cys Cys Ala Gly Val Cys

CABALLO Cys Cys Thr Gly Iso Cys

SNTESIS DE ADN - c A PARTIR DE ARN (eucariota)

aadir poli-A en el extremo 3 mediante la enzima POLI A - POLIMERASA de

FRAGMENTACIN DEL ADN

no es recomendable emplear endonucleasas de restriccin de corte frecuente ya que se

un gen procariota tpico tiene de 1 a 2 pares de kilobases ( 1 kilobase = 1.000 bases), es

Otros ejemplos de formar de cortar ADN:

En las tablas se muestran las secuencias de reconocimiento de varias enzimas

(Hind III : Haemophilus influenzae serotipo D)

Otro mtodo consite en el empleo del agregado de nucletidos

ej.: por intercambio recproco de segmentos =

FERTILIDAD: capacidad de transmitir material gentico durante la conjugacin.

PLSMIDOS CATABLICOS DE pseudomonas (SAUNDERS, 1987)

Aunque no puedan ser integrados al ADN cromsomico pueden conferir propiedades

Para Escherichia coli se han diseado un gran nmero de plsmidos. Se ha

ALGUNOS PLASMIDOS DE Escherichia coli EMPLEADOS EN INGENIERA GENTICA

Eco RI, Sma, Xma I,

Eco RI, Hind III, Sal I

Eco RI, Hind III, Sal I,

Eco RI, Hind III, Sal

Eco RI, Hind III, Sal

* varios cientos de copias en presencia de clorofenicol

el gen Tc (del pSC 101) que confiere resistencia a la tetraciclina;

.4363 pares de base

ESTRUCTURA COMPLETA DEL pBR 322

se muestran los sitios de ruptura.

direccin de transcipcin de los genes Ap y Tc

los nmeros corresponden al nucletido 5 de cada secuencia de reconocimiento.

El genoma del fago

es un ADN de doble cadena de un tamao de 50 Kb.

como una milcula lineal podemos esquematizarlo:

el ADN de esta zona es el que se puede emplear para fabricar

La zona central puede ser utilizada para:

despus de extrado de la cpside viral y de haber sido transformado en un vector

de reemplazamiento tienen capacidad de hasta 25 kb.

(hasta 10 kb en los plsmidos)

posee genes que le confieren reistencia a antibiticos, el origen de replicacin de un

su tamao es PEQUEO : 5 kb.

tiene capacidad para fragmentos de ADN exgeno de hasta 45 kb.

Bacillus sp : sobre todo para producir enzimas;

Se han diseado vectores de clonacin de genes en vegetales empleando el

mecanismo de la TRANSDUCCIN que ya hemos descripto.

d) por FUSIN DE PROTOPLASTOS

CASO DE CLULAS EUCARIOTAS

RECONOCIMIENTO Y SELECCIN DE LAS

HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICOS

hebras), uno de los pasos intermedios ser, necesariamente, su desnaturalizacin, o sea la

El resultado de estas operaciones es la substitucin de las colonias por ADN

El ADN celular, de alto peso molecular se fragmenta con varias enzimas de