Los mtodos y procedimientos de produccin de anticuerpos (conejos, ratas y

ratones) aprobados por la Universidad de Massachusetts animales Cuidado

Personal.

Se ruega a los investigadores para ordenar los animales de laboratorio a los vendedores
autorizados. Estas fuentes comerciales realizan pantallas regulares de salud de sus
animales y ofrecen historias de salud de la colonia. Los animales procedentes de estas
fuentes estn libres de muchos o todos de los agentes patgenos y parsitos de los
animales de laboratorio conocida o comn. Informacin de salud colonia actual acompaa
cada envo de animales. Estos animales son muy preferidos sobre los animales de los
criadores convencionales que no supervisan salud de las colonias rigurosamente, en todo
caso.
Anticuerpo policlonal Procedimiento Produccin en conejos
Antecedentes
Mayora de los docentes que contraen con el cuidado de los animales de anticuerpos
Servicio de Produccin siga el procedimiento estndar que implica inoculaciones
intradrmicas de material antignico. Este protocolo proporciona directrices y
precauciones de este procedimiento, y por la variacin ocasional, solicitado por el
investigador, que requiere intravenosa, subcutnea y / o intramuscular inoculaciones.
Procedimientos estndar
Una recogida de sangre inicial se realiza en cada nueva conejo para probar el suero preinmune. El conejo se tranquiliza con una inyeccin intramuscular de una mezcla de
ketamina (8 mg / kg) -xylazine (1,6 mg / kg) cctel. Alternativamente, acepromazina (10
mg / ml) se usa a una dosis de 0,5 - 1,0 mg / kg IM
El conejo se coloca en una caja de contencin de conejo estndar, el odo se afeit y se
limpi con 70% de alcohol suavemente. Un conjunto de "mariposa" de recogida de sangre
Vacutainer se utiliza para obtener la sangre. Una aguja se inserta en el vaso sanguneo y
el otro en un tubo separador de suero vacutainer.
Por lo general 2-3 ml de sangre se recogen en este momento con una cantidad mxima
dibujado que no exceda de 5,7 ml / kg. Se retira la aguja y se aplica presin al recipiente
para detener el sangrado. Una vez que se logra la hemostasia, el odo se limpia.
La primera inyeccin de inmunizacin puede realizarse en este momento. Es
responsabilidad del investigador para determinar la concentracin necesaria de antgeno
en la solucin inyectable. Los puntos de inyeccin estarn preparados aspticamente por
primera recorte la piel, a continuacin, utilizando una preparacin quirrgica de tres
etapas que consta de jabn quirrgico, enjuague de alcohol y la solucin de preparacin
quirrgica. Volmenes iguales de antgeno y el adyuvante se mezclan, utilizando dos

jeringas y una llave de paso de tres vas. La mezcla se administra por va intradrmica en
no ms de 10 sitios en la espalda y grupa. Una aguja de calibre 22 a 26 se usa
dependiendo de la consistencia de la mezcla. No ms de 0,05 ml se inyecta en cada sitio.
Despus de las inyecciones se han completado, los sitios son revisados, el conejo
monitoreado durante varios minutos y luego se devuelve a su jaula. El conejo se
comprueba regularmente, ya que se recupera de la sedacin.
El conejo se observa diariamente para controlar los posibles sitios de inflamacin. Si es
necesario, se toman medidas teraputicas veterinarios adecuados. La salud y el bienestar
de todos los conejos destinados a la produccin de anticuerpos sern monitoreados
regularmente por el veterinario a cargo y los miembros del personal de cuidado de los
animales. Cualquier conejo mostrando signos de desarrollo de granulomas o inflamacin
de los odos ser evaluado por el veterinario a cargo de la situacin clnica y las pruebas
de dolor y malestar. Tratamiento de enfermera estndar tales como compresas calientes,
o recortes de pieles y zonas de limpieza con soluciones antispticas, se iniciar cuando se
considere necesario
por el veterinario a cargo. La buprenorfina analgsica a una dosis de 0,01 a 0,05 mg / kg
cada 6 - 12 horas sern prescritos y administrados si el veterinario a cargo determina que
esto har que el animal ms cmodo.
Se mantendrn registros de todo el monitoreo, cuidados de enfermera y los tratamientos.
La segunda inmunizacin se realiza rutinariamente en 3-4 semanas. El conejo se
tranquiliz de nuevo usando el / combinacin xilacina ketamina o acepromacina. El mismo
procedimiento se sigue al igual que con la primera inyeccin. Alternativamente la
administracin subcutnea de antgeno puede ser utilizado. La administracin subcutnea
(SC) es una alternativa a sitios intradrmicos y mayores volmenes de inyeccin puede
ser utilizado. Antgeno se libera lentamente. Inculos de partculas se pueden usar.
Adyuvante puede ser usado para la primera serie de inoculaciones. Inyecciones SC se
harn sobre la parte posterior del conejo, 0,4 ml / sitio (volumen mximo de 0,8 ml / sitio),
el nmero mximo de sitios 10 / conejo. Se recomiendan los inculos ms pequeo si se
utiliza adyuvante de Freund. Utilice calibre 20 o una aguja ms pequea. El pescuezo y
ms de la pelvis se evitarn ya que estas son las reas utilizadas para la celebracin de
los conejos y las inoculaciones dolorosas har que el proceso de restriccin an ms
estresante para los animales.
Soluciones de antgeno se difunden a los espacios intersticiales luego a los ganglios
linfticos regionales. Aumento de la respuesta de anticuerpos puede conseguirse
mediante el aumento de nmero de sitios de inoculacin. Soluciones difunden a un grado
mucho mayor. Por lo tanto, la degradacin del antgeno y exposicin reducida al sistema
inmune puede estar asociada con la inoculacin por esta va. Reacciones de los tejidos y
las complicaciones de los inculos pueden ser distante del lugar de la inyeccin (s)
original. Al igual que con las inyecciones intradrmicas se observaron diariamente los
conejos de reacciones adversas. Cuando el conejo est listo para su primera coleccin de

sangre despus de la inmunizacin, se tranquiliz y se coloca en la casilla de restriccin y

se sigan los procedimientos descritos anteriormente. La mxima cantidad de sangre
extrada no debe exceder el 10% del volumen del conejo total de la sangre (57 ml / kg)
una vez cada dos semanas. Hematocrito del conejo debe medirse a intervalos de 4-5 das
si hay alguna duda acerca de la recuperacin de una extraccin de sangre.
Las desviaciones del procedimiento estndar
Los investigadores que deseen seguir un esquema de inmunizacin que no sea el enfoque
intradrmica deben mencionar esta variacin en el protocolo presentado en el Cuidado y
Uso Comit Animal Institucional (IACUC) y discutir los detalles (tales como volmenes de
inyeccin y adyuvante preferido) antes de tiempo para la Servicio de Cuidado de
Animales.
Al igual que con inoculaciones intradrmicas, los conejos se sedaron para estos
procedimientos para la comodidad del animal y para garantizar la colocacin correcta de
los inculos.
La administracin intravenosa de antgeno
Uso: La administracin intravenosa (IV) puede ser preferible para la exposicin inicial a
los antgenos en partculas y para las inyecciones de refuerzo de antgenos solubles en
solucin salina.
Adyuvante: No adyuvante debe ser administrado por esta va. Agua-en-aceite
emulsiones deben ser evitados.
Sitio de procesamiento de antgenos: el antgeno se entrega a los sistemas
reticuloendoteliales de los pulmones, el hgado y el bazo.
Sitio recomendado y volumen de inyeccin: la vena marginal de la oreja, 0,5-1,0 ml.
Utilice aguja de calibre 21 o ms pequea.
Lmites recomendados de los componentes de la solucin de inmungeno:
Soluble, detergente inico <0,2%; detergente no inico <0,5%; sal, 0,3 M; urea <1 M.
Los riesgos para el animal: A excepcin de la exposicin principal de material soluble,
no particulada, esta ruta tiene significativamente mayores riesgos que otras rutas. Puede
dar lugar a una embolia pulmonar. Inoculaciones Boost pueden precipitar una respuesta
anafilctica. Si esta ruta debe ser utilizado, el veterinario a cargo debe estar presente, y
tienen el siguiente protocolo de emergencia y materiales disponibles:
Si una respuesta anafilctica se sabe o se espera que ocurra despus de una
inoculacin intravenosa, pre-medicarse con antihistamnicos tales como hidrocloruro de
difenhidramina (Benadryl), 1 mg / kg IV lentamente, y 0,5 mg / kg IM Benadryl.
Si se produce una reaccin anafilctica:

reaccin leve: Dar 0,5 mg / kg Benadryl IV lentamente, y 0,2 a 0,5 ml epinefrina SC. Iniciar
fluidos fisiolgicos clida IV segn sea necesario. reaccin severa: Dar 0,5-1,0 ml
epinefrina IV, y 0,5 mg / kg Benadryl IV lentamente. Iniciar fluidos fisiolgicos clida IV tan
pronto como sea posible.

La administracin intramuscular de antgeno:

Uso: La ruta intramuscular (IM) es una alternativa a sitios intradrmicos, y mayores
volmenes de inyeccin puede ser utilizado. Antgeno se libera lentamente. Inculos
partculas puede ser usado.
Coadyuvante: Puede ser utilizado para la primera serie de inoculaciones.
Sitio de procesamiento de antgenos: Vanse los comentarios de la administracin
subcutnea. Sitio recomendado y volumen de inyeccin: grupo muscular del
cudriceps o msculo bceps femoral (msculos proximales de las extremidades
posteriores, alrededor de fmur), 0,5 ml / extremidad. Se recomiendan los volmenes ms
pequeos si se utiliza adyuvante de Freund y slo una extremidad deben ser utilizados
cuando se utiliza de Freund a menos que el uso de ambas extremidades puede ser bien
justificado. Los inculos se debe colocar en el cuerpo muscular, evitando los vasos
sanguneos, fascia y otros tejidos adyacentes. Use 21 o una aguja ms pequea.
Los riesgos para el animal: reacciones de tejidos y las complicaciones de los inculos
pueden estar alejados de la zona de inyeccin (s) original. Los inculos se puede colocar
cerca de los nervios que pueden estar implicados en las reacciones tisulares posteriores.
Criterios de valoracin: Al final del proyecto, cada animal se practic la eutanasia a
peticin del investigador. Por lo general, el animal es profundamente anestesiados con la
mezcla de ketamina-xilazina, se realiza una extraccin de sangre final, y luego los conejos
sacrificados con una pentobarbital sdico veterinaria solucin de eutanasia basada
(Euthasol 390 mg / ml y 50 mg pentobarbital / mL fenitona) a una dosis de 1 mL por
4.5Kg de peso corporal (86.7mg / kg pentobarbital y 11.1mg / kg fenitona).
Produccin de anticuerpos policlonales en ratas
Antecedentes
Este protocolo proporciona directrices y procedimientos para la produccin de anticuerpos
policlonales en ratas. Personal de Animal Care trabajar en estrecha colaboracin con el
profesorado, que contraen con el servicio, para organizar planes y programas que son
compatibles con el bienestar de las ratas y de los requisitos de los programas de
investigacin de inmunizacin y de extraccin de sangre. Algunas pautas de vacunacin
estndar se incluyen a continuacin.
Restriccin

Restriccin fsica apropiada de las ratas se utilizar para algunas inoculaciones. Anestesia,
ya sea el isoflurano inhalante o agentes inyectables como la ketamina (90 mg / kg)
-xylazine (10 mg / kg) cctel dada por va intraperitoneal (IP), ser utilizada para los
procedimientos que causan ms dolor momentneo y la angustia y para aquellos para los
que la rata debe mantenerse inmvil durante un corto perodo de tiempo. Un retenedor de
rata comercialmente disponible ser utilizado para las inyecciones y las colecciones de
pequeos volmenes de sangre por va intravenosa
La recogida de sangre
Para las colecciones de supervivencia, la sangre se recoge de la cola. Pequeo a
volmenes moderados pueden obtener mediante el uso de la vena lateral de la cola. La
rata se coloca en un retenedor de rata comercialmente disponible y la cola se calienta en
agua caliente o bajo una lmpara de calor. Un torniquete se coloca en la base de la cola y
se inserta una aguja de calibre de apropiado para el tamao del animal en la vena. Una
jeringa de pequeo volumen se utiliza para retirar la muestra teniendo cuidado de no
colapsar la vena. Alternativamente, la sangre puede ser recogida mediante la colocacin
de tubos de microhematocrito en el cubo de la aguja mientras la sangre fluye libremente.
Volmenes ms grandes (hasta varios mililitros) pueden ser recolectados a travs de la
arteria de la cola ventral. La arteria se introducir usando una aguja de mariposa de
calibre 23 con un corto tubo conectado a una jeringa de 3 ml. La anestesia se utilizar
cuando se accede a la arteria de la cola ventral. En cualquier caso, la hemostasis se
lograr despus de la recogida por la presin, la hipotermia localizada o la cauterizacin
qumica. Exanguinacin Terminal, por cardiocentesis, se llevar a cabo con la rata bajo
anestesia profunda.
Salvo que se solicite especficamente, no se realizarn extracciones de sangre retroorbital. Si se solicita, stas se llevarn a cabo en ratas anestesiadas por personal
capacitado. Para muestreos repetidos, se utilizarn los ojos alternos. Pomada oftlmica se
administrar despus del procedimiento.
Exmenes oftalmolgicos se llevarn a cabo regularmente en las ratas despus del
procedimiento. Volumen total de sangre de una rata es de aproximadamente 6,0 ml por
100 g de peso corporal. No ms de 10% del volumen total por rata se recoger cada dos
semanas. Si la sangre se debe recoger semanalmente, la salud de la rata ser
monitoreado de cerca y hematocritos determinado.
Inmunizacin
Suspensiones Inmungeno-adyuvantes se inocularon por va subcutnea sobre la cara
dorsal de la rata en volmenes que no exceda de 0,1 ml por sitio. Calendarios de
vacunacin recomendados sern una dosis de refuerzo a los 14 das despus de la
inyeccin inicial, y refuerzos posteriores con ms frecuencia de la semana. Si se utiliza
CFA (adyuvante completo de Freund), el adyuvante incompleto de Freund (IFA) se utilizar
para todas las inyecciones despus de la primera dosis de CFA. Las ratas se controlarn

despus de inmunizaciones porque las reacciones de tejidos y las complicaciones de los

inculos pueden ser distante del lugar de la inyeccin (s) original.
Produccin de anticuerpos policlonales en ratones o Inmunizacin de ratones en
la Preparacin para la recoleccin de la Bazo para el Desarrollo hibridoma
Antecedentes

Este protocolo proporciona directrices y procedimientos para la produccin de anticuerpos

policlonales en ratones. Personal de Cuidado de Animales trabajar en estrecha
colaboracin con el profesorado, que contraen con el servicio, para organizar programas
de inmunizacin y de recoleccin de sangre que son compatibles con el bienestar de los
ratones y los requisitos de los programas de investigacin. Algunas pautas de vacunacin
estndar se incluyen a continuacin
Restriccin
Restriccin fsica adecuada de los ratones se utilizar para algunas inoculaciones.
Anestesia, ya sea el isoflurano inhalante o agentes inyectables tales como ketamina (6090 mg / kg) -xylazine (4-8 mg / kg) cctel dada por va intraperitoneal (IP), ser utilizada
para los procedimientos que causan ms dolor momentneo y angustia. Un retenedor de
ratn comercialmente disponible ser utilizado para la recogida de muestras de sangre de
la cola.
La recogida de sangre
Para las colecciones de supervivencia, la sangre se recoge de la cola. La sangre se recogi
por puncin o mellar el lateral de la cola vena usando una aguja de calibre 22 estril. La
hemostasia se lograr despus de su recogida por la presin, la hipotermia localizada o
cauterizacin qumica. Desangramiento Terminal, por cardiocentesis, se realizar slo con
el ratn bajo anestesia profunda.
Salvo que se solicite especficamente, no se realizarn extracciones de sangre retroorbital. Si se solicita, stas se llevarn a cabo en ratones anestesiados por personal
capacitado. Para muestreos repetidos, se utilizarn los ojos alternos. Exmenes
oftalmolgicos se llevarn a cabo regularmente en los ratones despus del procedimiento,
y pomada oftlmica aplican segn sea necesario.
El volumen de sangre total de un ratn es de 5,5 ml por 100 g de peso corporal o
aproximadamente 1,5 ml de una 30 g de ratn. No ms de 10% del volumen total por
ratn se recoger cada dos semanas. Si la sangre se debe recoger semanalmente, la salud
del ratn ser monitoreado de cerca y hematocritos determinado.
Inmunizacin
va subcutnea

Suspensiones inmungeno-adyuvante se inoculan en la piel ms flexible sobre la cara

dorsal del ratn en el volumen que no exceda de 0,1 ml por sitio. Calendarios de
vacunacin recomendados sern una dosis de refuerzo a los 14 das despus de la
inyeccin inicial, y refuerzos posteriores con ms frecuencia de la semana. Si se utiliza
CFA, adyuvante incompleto de Freund (IFA) se utilizar para todas las inyecciones despus
de la primera dosis de CFA. Se tendr cuidado de preservar algn rea subcutnea en el
pescuezo para permitir la restriccin fsica del ratn, si es necesario, sin molestias aadido
al animal. Los ratones sern supervisados despus de inmunizaciones porque las
reacciones de tejidos y las complicaciones de los inculos pueden ser distante del lugar de
la inyeccin (s) original.