Ejercicio experimental 2. Identificacin de las clulas del sistema inmune.

OBJETIVO

Identificar los diferentes componentes celulares de la respuesta inmune en sangre

perifrica humana a travs de sus caractersticas morfolgicas y de afinidad por
colorantes.

CMO?
A travs de una tincin basada en la tincin de Wright que se describe a continuacin:
MATERIALES
Microscopio ptico
Portaobjetos
Lanceta estril
Cronmetro
Alcohol
Aceite de inmersin
Colorante de Wright
Buffer de fosfatos, pH=7.0
TCNICA
-Limpiar el dedo pulgar (de la mano que menos ocupe la persona voluntaria) con agua y
con jabn. Desinfectarlo posteriormente con alcohol.
-Con la lanceta estril realizar una puncin en la parte apical del dedo de forma paralela
a la huella digital del dedo pulgar.
-Depositar una gota de sangre de (aproximadamente 40 l) en un extremo de un
portaobjetos.
-Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del
portaobjetos de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre (monocapa). El porta
absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por encima de ella para no daar las clulas.
Dejar secar a temperatura ambiente.

-Colocar el frotis de sangre sobre la bandeja de tincin.

- Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.

- Tras 1-3 min, aadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con
movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metlico.
- Se deja actuar de 5 a 10 min.
- Lavar con agua.
- Dejar secar aireando el portaobjetos
- Observar al microscopio ptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando aceite
de inmersin.
OBSERVACIN MICROSCPICA
Al microscopio se vern con un dominio predominante los glbulos rojos, hemates o eritrocitos
teidos de color rojo por la eosina. No tienen ncleo y son ms delgados por el centro que por los
bordes.
Los glbulos blancos o leucocitos se identifican fcilmente por la presencia de ncleo, teido
de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:
1. Linfocitos: de tamao aproximado al de los glbulos rojos, tienen un solo ncleo que ocupa
casi todo el glbulo.
2. Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, ncleo grande,
redondo, son los ms mviles y su funcin principal es la fagocitosis.
3.
Polimorfonucleares: ncleo fragmentad. Pueden ser eosinfilos, con abundantes
granulaciones teidas de rojo por la eosina, neutrfilos y basfilos.
Con una adecuada tincin se conseguir los siguientes aspectos morfolgicos de las clulas:
1. Forma y dimisiones de la clula
2. Aspecto de la cromatina.
3. Citoplasma
4. Granulacin

Ejercicio experimental 3. Identificacin rganos linfoides.

OBJETIVO

Identificar la estructura macroscpica y localizacin de los diferentes rganos

linfoides primarios y secundarios a travs de sus caractersticas morfolgicas e
identificar las clulas que en ellos residen por su afinidad por colorantes.

CMO?
A travs de la diseccin de rganos linfoides en ratones y la tincin de Wright.
MATERIALES

Microscopio ptico
Portaobjetos
Caja petri
Equipo de diseccin
Agujas
Guantes
Jeringa de 1mL
Tela de organza
Tabla de diseccin
Cronmetro
Alcohol
Aceite de inmersin
Colorante de Wright
Buffer de fosfatos, pH=7.0

FUNDAMENTO
Prcticamente todos los mtodos empleados para teir clulas hematopoyticas se basan en el
empleo del colorante de Wright, constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de
metileno. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH
de las diferentes estructuras celulares, de forma que tienen carcter bsico aquellas que fijan en
mayor medida la eosina (Colorante cido). Mientras las que poseen propiedades cidas fijan
principalmente el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras
basfilas presentes en el ncleo o en el citoplasma se tien de azul, mientras que otros
componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren un color rosado.
PRCEDIMIENTO
1) Localizacin de los rganos linfoides.
- Sacrificar al ratn por dislocacin cervical.
- Fijar el ratn a la tabla de diseccin.
- Rociar alcohol sobre el ratn para facilitar el manejo del mismo.
- Realizar una incisin en V en la piel del ratn en regin abdominal del mismo, retirar con
cuidado la piel del ratn hacia los lados y comenzar la extraccin de los ganglios
linfticos, bazo y timo. (Apoyarse con el esquema)
- Depositar 3 ganglios en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Depositar el timo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Depositar bazo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Disgregar todos los rganos con la ayuda del embolo de una jeringa de 1 mL y tela de

organza.
Una vez obtenidas las suspensiones celulares, colocar una gota de la suspensin
celular en un portaobjetos limpio y desengrasado y dejar secar
Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.
Tras 1-3 min, aadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con
movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metlico.
Se deja actuar de 5 a 10 min.
Lavar con agua.
Dejar secar aireando el portaobjetos.
Observar al microscopio ptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando
aceite de inmersin.

2. Observar al microscopio las preparaciones de bazo, ganglios y timo.

ANEXO 1.
ratn

Esquema de localizacin de los rganos linfoides primarios y secundarios en

Sup erficial cervicals

ANEXO 2. Caractersticas de los rganos linfoide primarios y secundarios

Al microscopio se ver:
Bazo: Dominio predominante de glbulos rojos teidos de color rojo por la eosina. No
tienen ncleo y son ms delgados por el centro que por los bordes.

Linfocitos: de tamao aproximado al de los glbulos rojos, tienen un solo

ncleo que ocupa casi toda la clula.
Macrfagos: son los leucocitos de mayor tamao, poco frecuente, ncleo
grande, laxo y redondo.
Clulas dendrticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con una
gran cantidad de prolongaciones citoplasmticas.

Ganglio: No se observan eritrocitos.

Linfocitos: de tamao aproximado al de los glbulos rojos, tienen un solo

ncleo que ocupa casi toda la clula.
Macrfagos: son los leucocitos de mayor tamao, poco frecuente, ncleo
grande, laxo y redondo.
Clulas dendrticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con
una gran cantidad de prolongaciones citoplasmticas.

Timo: No se observan eritrocitos.

Linfocitos: de tamao aproximado al de los glbulos rojos, tienen un solo

ncleo que ocupa casi toda la clula.

Anexo 3. Cortes histolgico de Timo, Bazo, Ganglios y Placas de Peyer.

Timo
El timo est rodeado de una delgada cpsula de tejido conectivo que se proyecta hacia el
interior como septos dividiendo al rgano en lobulillos. En cada lobulillo se aprecia una corteza
de linfocitos densamente agrupados y una mdula ms clara. El timo carece de ndulos linfoides
y est sostenido por clulas reticulares epiteliales. Los corpsculos de Hassall son exclusivos
del timo y se localizan en la mdula. Son estructuras redondeadas y acidfilas constituidas por
clulas epiteliales aplanadas dispuestas en forma concntrica, que pueden sufrir queratinizacin
y calcificacin en la zona central.

Lobulillos

Zona cortical

Corpsculo de Hassall

PLACAS DE PEYER
Las placas de Peyer estn formadas por agregados de ndulos linfoides situados en la lmina
propia y submucosa de intestino delgado, particularmente leon. Se pueden apreciar en
ocasiones los centros germinales. El tejido linfoide difuso entre dichos folculos linfoides est
formado por linfocitos T.

GANGLIOS LINFTICOS
En periferia se distingue el tejido conjuntivo capsular fibroso por debajo del cual aparece el seno
subcapsular como un espacio vascular que en determinados puntos es difcil de apreciar, en la
parte cortical se observan folculos secundarios y tejido linfoide difuso quedando una porcin
central correspondiente a la zona medular rica en vasos sanguneos y senos linfticos.

Bazo
La seccin esplnica muestra una cpsula fibrosa de la que se desprenden trabculas o septos
que dividen parcialmente al parnquima esplnico. El bazo consta de una porcin conocida como

pulpa blanca o pupa roja. La pulpa blanca est situada periarteriolarmente (alrededor de las
ramas de la arteria esplnica central) formando estructuras envolventes o vainas cilndricas
conocidas como vaina linfoide periarteriolar que se mantienen parcialmente separadas de la
pulpa roja por una capa de tejido linfoide laxo conocida como zona marginal. Dentro de la pulpa
blanca las clulas linfoides se distribuyen tanto de forma dispersa como agrupadas en folculos.
La pulpa roja formado por senos venososo y cordones celulares (cordones de Billroth).

Bazo: cpsula (a), la pulpa roja

(b), la pulpa blanca (c) y las
trabculas (d).