ENZIMOLOGA DIAGNOSTICA

INTRODUCCIN
1. Qu es una enzima?
Cuando un compuesto se transforma en otro, de diferente naturaleza, se ha producido una reaccin
qumica. Las reacciones qumicas ocurren a una determinada velocidad, que, entre otros, depende
de los siguientes factores:
La concentracin del sustrato/s: As, cuanto mayor sea la concentracin del compuesto
inicial ms rpido ser el proceso.
La temperatura: Cuya elevacin acelera las reacciones qumicas.
La presencia de un catalizador modifica la velocidad de una reaccin qumica.
Los procesos biolgicos en los seres vivos, son catalizados por ENZIMAS, como catalizadores que
son, presentan las mismas caractersticas generales:
-

Se requieren pequeas cantidades para que la reaccin tenga lugar.

No se consumen durante la reaccin qumica que catalizan.
No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables.
No modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin.

La diferencia fundamental entre un enzimas y un catalizador orgnico o inorgnico es la

especificidad de reaccin que determina la ausencia de subproductos en estas reacciones y que el
rendimiento del producto en las reacciones enzimticas sea casi del 100%. Esta especificidad
supone un ahorro de energa y protege frente al desaprovechamiento de metabolitos en las clulas
vivas.
As, los enzimas no pueden lograr el que se produzca una reaccin imposible, pero s que una casi
imperceptible suceda a una velocidad apreciable.
Los enzimas normalmente son protenas que tienen una actividad cataltica, aunque tambin hay
RNAs con actividad cataltica, son los Ribozimas. (no los vamos a estudiar por que tienen menos
inters clnico que los enzimas proteicos).
Actan de diferentes modos, pero siempre gracias a que un grupo de aminocidos, que se
encuentran prximos en la estructura espacial de la protena, facilitan la transformacin de que se
trate. Estos aminocidos constituyen lo que se denomina centro activo de la enzima.
1.1. Las enzimas disminuyen la energa de activacin de la reaccin.
Para que una determinada reaccin qumica ocurra deben darse tres condiciones:
-

Los reactivos (sustratos) deben colisionar.

La colisin molecular debe ocurrir en una orientacin adecuada.

Los reactivos deben poseer suficiente energa.

Esta energa se denomina Energa de Activacin. En las reacciones catalizadas enzimticamente

disminuye la Energa de Activacin y aumenta la probabilidad de una orientacin adecuada de los
reactivos.

2. Clasificacin y nomenclatura de los enzimas:

Tradicionalmente los enzimas se nombraban aadiendo el sufijo "asa" al nombre del sustrato. Por
ejemplo, la ureasa es la enzima que cataliza la hidrlisis de la urea formando amonaco y dixido
de carbono.

Sin embargo conforme se fueron descubriendo nuevas enzimas esta nomenclatura comenz a
resultar poco efectiva y confusa. La International Enzime Comission emiti en 1972 unas
directrices para sistematizar la nomenclatura y clasificacin de los diferentes enzimas conocidas y
aplicables tambin a futuros descubrimientos.
2.1. Clasificacin de los enzimas: Este sistema divide a las enzimas en seis clases que a su vez
pueden tener diferentes subclases. La clasificacin de los enzimas en estos seis grupos se basa en el
tipo de reaccin catalizada: Oxidorreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas y
Ligasas.
Clase 1. Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir, transferencia de
hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la reaccin general:
AH2 + B
Ared + Box

A + BH2
Aox + Bred

Ejemplos: Succinato deshidrogenasa o la Citocromo c oxidasa.

Clase 2. Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo qumico (distinto del hidrgeno) de
un sustrato a otro, segn la reaccin:
A-B + C

A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reaccin representada en la Figura

glucosa + ATP

ADP + glucosa-6-fosfato

Clase 3. Hidrolasas: Catalizan las reacciones de hidrlisis:

A-B + H2O

AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin:

lactosa + agua

glucosa + galactosa

Clase 4.Liasas: Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

A-B

A+B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reaccin:

cido acetactico

CO2 + acetona

Clase 5. Isomerasas: Catalizan la interconversin de ismeros:

A

Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa isomerasa, que catalizan las reacciones
representadas en la tabla inferior:

fosfotriosa isomerasa
gliceraldehdo-3-fosfato

fosfoglucosa isomerasa

dihidroxiacetona-fosfato

glucosa6-fosfato

fructosa-6fosfato

Clase 6. Ligasas: Catalizan la unin de dos sustratos con hidrlisis simultnea de un nucletido
trifosfato (ATP, GTP, etc.):
A + B + XTP

A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reaccin:

piruvato + CO2 + ATP

oxaloacetato + ADP + Pi

2.2. Nomenclatura: El nombre sistemtico de un enzima consta actualmente de 3 partes:

el sustrato preferente
el tipo de reaccin realizado
terminacin "asa"

Un ejemplo sera la glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerizacin de la glucosa-6-fosfato

en fructosa-6-fosfato.
Muchos enzimas catalizan reacciones reversibles. No hay una manera nica para fijar cual de los
dos sentidos se utiliza para nombrar al enzima. As, la glucosa fosfato isomerasa tambin podra
llamarse fructosa fosfato isomerasa.
Cuando la accin tpica del enzima es la hidrlisis del sustrato, el segundo componente del nombre
se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa. Adems de los nombres
sistemticos, an persisten otros consagrados por el uso. As, la glucosa: ATP fosforiltransferasa se
llama habitualmente glucoquinasa.
Adems el nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico, encabezado por
las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro nmeros separados por puntos. El
primer nmero indica a cual de las seis clases pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas
subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos qumicos especficos
que intervienen en la reaccin
As, la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) se define como EC 2.7.1.2. El nmero 2 indica
que es una transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y
el ltimo 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.
2.2. Clasificacin de los enzimas segn su origen:
o Enzimas especificas de plasma: son las enzimas que tienen su lugar de accin en el
plasma. Estas enzimas son sintetizadas en determinados tejidos y vertidas a la sangre
activamente, que es su lugar de accin, donde se encuentran su sustrato y su coenzima. Por
ejemplo las enzimas del complejo protrombnico, lipoproteinlipasa, plasmingeno y
pseudocolinesterasa. Este grupo de enzimas son sintetizadas fundamentalmente por el
hepatocito y son muy activas en el plasma (a diferencia de otras que si estn aumentadas
indican dao). Entonces de este grupo de enzimas nos interesa saber sus valores inferiores;
porque una disminucin de su actividad indica una alteracin en la sntesis, y como la
mayora son producidas en el hgado esto nos estara indicando una alteracin de la
funcionalidad heptica.
o Enzimas de secrecin: Son enzimas secretadas por glndulas tejidos muy especializados,
su lugar de accin est alejado, es el caso por ejemplo de las enzimas digestivas segregadas
por el pncreas y que van al duodeno a ejercer su accin, como por ejemplo la amilasa,
lipasa, tripsina, etc. Clnicamente, estas enzimas en sangre estn en baja actividad.
o Enzimas celulares de tejidos u rganos : Son todos los enzimas actan dentro de la misma
clula que las sintetiza, no tienen accin en plasma por falta de sustrato y de coenzima. Se
dividen en 2 grupos:

 Ubicuas: Son todas las que intervienen en el metabolismo general como por ejemplo
LDH, MDH, ALT o Alanina-aminotransferasa, AST o Aspartato-aminotransferasa.
Organoespecficas: Enzimas especificas de determinados rganos tejidos que
actan en procesos metablicos especficos de ciertos tejidos. Por ejemplo la GLDH, y
SDH.
El conocimiento de la procedencia celular del enzima, de su distribucin y difusin a travs de
sangre, linfa y tejido intersticial, as como de sus vas de eliminacin, nos ofrecer datos de gran
inters para estudiar un fenmeno patolgico y su posterior evolucin.
3. Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la
especificidad del enzima. Las aplicaciones prcticas del estudio de la cintica enzimtica son muy
amplias. En este sentido, los ensayos enzimticos in vitro se emplean rutinariamente en los
laboratorios clnicos, ya que una velocidad enzimtica anormal puede dar una pista sobre una
patologa determinada. Adems la informacin proporcionada puede indicarnos alteraciones en una
ruta metablica determinada. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse
con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La
medida se realiza siempre en condiciones ptimas para que la enzima pueda catalizar la reaccin a
velocidad mxima (Vmax). Esto se consigue cuando:
-

Las condiciones de pH son ptimas.

Las condiciones de temperatura son ptimas.
La reaccin se da en presencia de cofactores.
Se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.

En estas condiciones la velocidad puede determinarse midiendo la aparicin de los productos o la

desaparicin de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del
tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o simplemente, la cintica de la
reaccin.
Figura 1. Al seguir la velocidad de
aparicin de producto (o de
desaparicin del sustrato) en funcin
del tiempo se obtiene la llamada
curva de avance de la reaccin.

A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo

porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin (ver figura de arriba). Para evitar esta
complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La velocidad inicial de la
reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0
se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la
concentracin de sustrato ([S]) como esencialmente constante a lo largo del experimento. Adems,
en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto
formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican
enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos la
velocidad inicial de la reaccin (v0 ) frente a la concentracin inicial de sustrato ([S]0) obtenemos
una grfica como la de la figura 2. Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentracin de sustrato y por tanto, la reaccin es de primer orden. Pero a altas
[S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0 . En este
punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es
mxima (Vmax).
Figura 2. Modelo de MichaelisMenten: Si representamos la
velocidad inicial frente a la
concentracin inicial del sustrato
obtenemos una curva hiperblica.

Al efectuar anlisis de enzimas en el laboratorio es fundamental que la concentracin de

sustrato sea lo suficientemente elevada como para favorecer la saturacin enzimtica y por ello que
la reaccin se site en una cintica de orden cero. Con el fin de asegurar que una reaccin
enzimtica tenga cintica de orden cero durante un anlisis, es necesario proporcionar la
concentracin ptima de sustrato. La CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN (Km) es til para
ello. Dicha constante representa la concentracin de sustrato (en mol/L) cuando la velocidad de
reaccin es Vmx. El valor de Km se obtiene de la grfica de Michaelis-Menten.
Km es una constante cuyo valor permanece sin cambios para cada conjunto o par ES salvo
que se modifiquen las condiciones de reaccin que afectan al enlace del enzima con el sustrato. Por
otra parte, Km nos da informacin sobre la afinidad del enzima por el sustrato, de tal forma que si
Km es alta, la afinidad entre ambos elementos es baja (y, por tanto, la velocidad de reaccin es
lenta); en caso de que Km sea baja, la afinidad enzima/sustrato es alta y la velocidad de reaccin
rpida.
6. Enzimas ms significativos en diagnostico clnico.
Lactato-deshidrogenasa (LDH EC 1.1.1.27):
Es una oxidorreductasa cuya actividad es necesaria en la interconversin del cido pirvico
(piruvato) en cido lctico (lactato) y viceversa; como recordaremos, este paso metablico apareca
tras la glicolisis si las condiciones eran anaerobias, por ello este enzima desempea un papel muy
importante en los tejidos que utilizan la glucosa como principal fuente energtica (msculo
esqueltico, tejido cardaco, hgado, eritrocitos y plaquetas, rin, pulmones y bazo).
La LDH es un tetrmero formado por cuatro cadenas polipeptdicas; cada cadena o
subunidad puede ser de dos tipos: cardaca (H) o muscular (M). Las combinaciones de estas
subunidades producen cinco isoenzimas denominadas LDH-1 (4 cadenas H), LDH-2 (3 cadenas H y
una cadena M), LDH-3 (2H y 2M), LDH-4 (1H y 3M) y LDH-5 (4M); estos isoenzimas poseen
distinta carga elctrica, por lo que pueden separarse por electroforesis, de tal modo que los dos
primeros (LDH-1 y LDH-2) poseen una alta movilidad electrofortica, la LDH-3 tiene una

movilidad intermedia y la LDH-4 y LDH-5 se mueven con lentitud sobre el soporte de la

electroforesis. La localizacin de cada isoenzima tambin vara:
-LDH-1/LDH-2 corazn y eritrocitos.
-LDH-3 pulmn y bazo.
-LDH-4/LDH-5 msculo e hgado.
En el suero de individuos sanos, la fraccin isoenzimtica predominante es la LDH-2
seguida, por este orden, de LDH-1, LDH-3, LDH-4 y LDH-5.
La actividad LDH se incrementa en varias afecciones: infarto de miocardio, anemia
megaloblstica, leucemia, lesin heptica (hepatitis, cirrosis, obstruccin biliar) y lesin muscular
(ejercicios intensos, aplastamiento, distrofias); es un buen indicador de hemlisis. En cualquier
caso, la elevacin aislada de este enzima debe considerarse como un dato inespecfico.
Transaminasas:
Constituyen una clase de enzimas includas entre las transferasas que estn ampliamente
extendidas en el organismo y que catalizan la transferencia de un grupo amino (-NH2) desde un
aminocido a un cetocido. Las dos transaminasas de mayor importancia son la AST (o GOT EC
2.6.1.1) y la ALT (o GPT EC 2.6.1.2):
-ASTasprtico-aminotransferasa ; GOTglutmico-oxalactico-transaminasa
-ALTalanina-aminotransferasa ; GPTglutmico-pirvico-transaminasa
Las reacciones catalizadas por la AST (o GOT) y la ALT (O GPT) se representan a
continuacin:
AST
Asprtico + Glutrico Oxalactico + Glutmico
ALT
Alanina + Glutrico Pirvico + Glutmico
La AST se encuentra predominantemente en el citoplasma y las mitocondrias del hepatocito,
en msculo cardaco y esqueltico y en rin; en menor grado se encuentra en eritrocitos, pncreas,
bazo y pulmn. La ALT se localiza principalmente en el citoplasma heptico y, en menor grado, en
msculo esqueltico, corazn, rin, pncreas, pulmn y eritrocitos. Las transaminasas nunca se
detectan en orina a menos que exista una lesin renal.
Las determinaciones de AST y ALT son de gran utilidad para diagnosticar enfermedades
hepticas agudas y crnicas (hepatitis, cirrosis), as como afecciones cardacas (infarto agudo de
miocardio) y musculares (distrofias, aplastamientos, gangrenas).
Creatin-quinasa (CK EC 2.7.3.2):
Es un enzima citoplasmtico y mitocondrial que se incluye en la clase de las transferasas y
cataliza, en ambos sentidos, la reaccin siguiente:
CK
Creatina + ATP Fosfocreatina + ADP + energa
Mg++

La actividad CK es de particular importancia en el tejido muscular, ya que toda contraccin

de sus fibras exige hacer uso del ATP. Adems de en el msculo esqueltico, encontramos
abundante CK en cerebro, corazn, estmago, intestino y eritrocitos.
La CK se presenta como un dmero que consta de dos subunidades (B o cerebral y M o
muscular) que se combinan de distintas formas para dar lugar a tres isoenzimas:
-CK-BB (2 subunidades B): predomina en cerebro y S.N.C.
-CK-MB (1 B y 1 M): predomina en corazn.
-CK-MM (2 subunidades M): predomina en msculo y corazn.
En suero normal, las proporciones de los distintos isoenzimas de la CK son las siguientes:
CK-MM 94%
CK-MB 6%
CK-BB 0%
Existe una cuarta forma de CK denominada mitocondrial (CK-mito) que nunca se observa
en suero normal, pero que, cuando aparece, es indicativa de daos extensos en los tejidos, con
liberacin del contenido mitocondrial.
La CK se eleva principalmente en enfermedades que afectan al tejido musculoesqueltico
(distrofias, aplastamientos, hipotiroidismo), miocardio (infarto agudo) y cerebro. Como la CK total
se eleva en muy diversas afecciones, su determinacin tiene menor significado clnico que la de sus
isoenzimas.
Fosfatasa alcalina (ALP EC 3.1.3.1):
Es una hidrolasa que acta a pH 9'0-10'5, catalizando la liberacin de fsforo orgnico con
produccin de un alcohol:
ALP
H2O + R-PO4H R-OH + H2PO4
-

Sus isoenzimas se encuentran ampliamente distribuidas en los tejidos humanos,

localizndose preferentemente en hgado, hueso, placenta, intestino, bazo y rin. La ALP presente
en suero procede de dos tejidos principales: hgado y hueso; los isoenzimas pueden ser
diferenciados por electroforesis.
El aumento de actividad ALP en suero se observa en diversas afecciones, sin embargo su
significado clnico se relaciona principalmente con la deteccin de enfermedades seas (ostetis
deformante o enfermedad de Paget, raquitismo, osteomalacia, metstasis osteoblsticas) y hepticas
(especialmente la obstruccin biliar).
Fosfatasa cida (ACP EC 3.1.3.2):
Como la anterior, es una hidrolasa que libera fsforo orgnico con produccin de alcohol,
pero, a diferencia de ella, acta a pH 4'5-7'0.
Se encuentra ampliamente distribuida en los tejidos y lquidos orgnicos, predominando en
prstata, hgado, rin, eritrocitos, plaquetas y osteoclastos.

Como la actividad ACP en la prstata es ms de 1.000 veces superior a la de otros tejidos, se

solicitan determinaciones de esta sustancia principalmente para diagnosticar afecciones prostticas
(cncer de prstata) y, en menor grado, para enfermedades malignas de los huesos (metstasis,
mieloma, etc.).
Amilasa (AMS EC 3.2.1.1):
La a-amilasa es un enzima que requiere Ca++ como activador y pertenece a la clase de las
hidrolasas. Cataliza la ruptura de los enlaces 14 internos del almidn, glucgeno y otros
polmeros de glucosa, dando lugar a oligosacridos.
Las principales fuentes tisulares de este enzima son las glndulas salivares y el pncreas
exocrino. Puede encontrarse tambin en sudor, pulmn, huesos, ovarios y tiroides.
Puesto que la AMS se filtra en pequeas cantidades en el glomrulo renal y no se reabsorbe
totalmente en los tbulos, la determinacin analtica de esta sustancia puede realizarse tanto en
suero como en orina.
Se han identificado dos isoenzimas de la AMS: la pancretica o P (con tres subvariedades
P1, P2 y P3) y la salivar o S (tambin con tres subvariedades S1, S2 y S3). En el suero de un
adulto normal, el 40% de la actividad total de AMS se debe al tipo P y el 60% restante al tipo S.
La actividad de la AMS se eleva en varias enfermedades, no obstante su significado clnico
se relaciona principalmente con la pancreatitis aguda (especialmente si existe P3, habitualmente
indetectable en suero).
Lipasa (LPS EC 3.1.1.3):
Es una hidrolasa que rompe dos uniones glicerol/cido graso de los triglicridos, dando
como resultado un monoglicrido y dos cidos grasos:
LPS
Glicerol + 2 H2O Monoglicrido + 2 cidos grasos
Se localiza en pncreas, mucosa intestinal, estmago, leucocitos y tejido adiposo, pero slo
la forma pancretica tiene significado clnico, utilizndose en el diagnstico de pancreatitis aguda.
A diferencia de la amilasa, se reabsorbe totalmente en los tbulos renales, por lo que no se detecta
en orina.
Gamma-glutamil-transferasa (GGT/GT EC 2.3.2.1):
Es una transferasa cuya funcin ms importante es la transferencia del grupo -glutamil del
glutation y otros pptidos.
Los principales tejidos que contienen GGT incluyen el hgado, rin, pncreas e intestino,
aunque la mayor parte de la actividad srica de este enzima se deriva del hgado.
El uso clnico ms frecuente de la GGT es la deteccin y diagnstico diferencial de las
afecciones hepatobiliares, especialmente de la obstruccin biliar o colestasis. Puesto que el alcohol
y ciertos frmacos (antidepresivos y anticonvulsivantes) inducen su sntesis, este enzima es un
indicador bastante sensible de abuso de alcohol (de hecho se utiliza para vigilar la abstinencia, ya
que desciende tras 2-5 semanas del abandono del consumo de esta sustancia).

Colinesterasa (ChE EC 3.1.1.7):

Es una hidrolasa que cataliza la ruptura de la acetil-colina en colina y cido actico. Se
conocen dos formas diferentes de colinesterasa: la verdadera (o acetil-colinesterasa AChE) y la
pseudocolinesterasa (ChE).
La AChE se localiza preferentemente en los eritrocitos y S.N.C., mientras que la de la ChE
lo hace en hgado y sustancia blanca del encfalo.
Los anlisis clnicos de colinesterasa se solicitan en casos de intoxicacin por
organofosforados, en enfermedades hepticas (hepatitis, cirrosis, cncer) y en situaciones en las que
debe administrarse succinil-colina como miorrelajante previo a la anestesia general (ya que existen
determinadas formas de la colinesterasa que no degradan este miorrelajante; en estas situaciones
puede aparecer fallo respiratorio durante la anestesia).
Aldolasa (ALS EC 3.4.1.1):
Es una liasa que rompe la fructosa-1,6-difosfato en dihidroxiacetona-fosfato y
gliceraldehido-3-fosfato.
Se detecta actividad aldolasa en todas las clulas vivas, pero predomina en msculo
esqueltico, hgado y cerebro, lugares en donde existe en forma isoenzimtica (ALS-A en msculo,
ALS-B en hgado y ALS-C en cerebro).
Su utilidad clnica se relaciona principalmente con afecciones musculares (distrofias, sobre
todo) y, en menor grado, con alteraciones hepticas y cerebrales.
5-Nucleotidasa (5'NT EC 3.1.3.5):
Cataliza la hidrlisis de los nucletidos en nuclesidos, con liberacin de fosfato.
Se localiza en muchos tejidos, especialmente el heptico; clnicamente, junto a ALP, se
relaciona con afecciones hepatobiliares (colestasis), de tal manera que si aumentan ambos enzimas,
el proceso se localiza en vias biliares, mientras que si slo aumenta ALP, el proceso es de origen
seo.
Leucinaminopeptidasa (LAP EC 3.4.1.1):
Es una hidrolasa que rompe el enlace peptdico N-terminal de los pptidos, especialmente de
aquellos que tienen leucina como aa externo.
Se localiza preferentemente en hgado, rin e intestino delgado y se relaciona con
afecciones hepatobiliares.

7. Metodologa para la determinacin de enzimas.

7.1. Toma de muestra y conservacin para la determinacin de enzimas:
La muestra destinada a las determinaciones de enzimas debe cumplir una serie de requisitos
que son bsicos para garantizar la calidad del resultado:
1.

Evitar la stasis venosa prolongada durante la extraccin (por mantenimiento excesivo del
compresor), pues se produce hipoxia y un aumento de la permeabilidad de las clulas
sanguneas, con vertido de su contenido al medio.

2.

No poner las muestras para las determinaciones enzimticas en tubos lavados con detergentes,
ya que se pueden alterar la estructura proteica del enzima.

3.

Transportar refrigerada la muestra destinada a determinacin enzimtica, pero sin congelar

(salvo que haya de conservarse largo tiempo sin procesar).

4.

No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces, pues ello puede
ser causa de desnaturalizacin irreversible del enzima.

5.

Separar lo antes posible el cogulo del suero/plasma, pues ciertos enzimas (LDH, ACP) son
componentes de las plaquetas y se liberan al medio si existe destruccin de las mismas.

6.

No trabajar con muestras hemolizadas, ya que en ellas se encuentran aumentados los enzimas
intraeritrocitarios, que han sido liberados al medio, sobre todo LDH, ACP, CK y AST.

7.

Evitar el envejecimiento de las muestras, sobre todo si vamos a determinar ACP o CK, ya que
son enzimas muy lbiles (especialmente el primero de ellos). Los enzimas ms estables son la
ALP y la ChE.

7.2. Fundamento de las determinaciones enzimaticas.

Dada su baja concentracin en sangre u orina, el estudio de los enzimas en el laboratorio de
diagnostico clnico se basa, de una forma general, en la demostracin "in vitro" de la actividad
cataltica que un enzima cualquiera tiene "in vivo". No es, por tanto, a diferencia de otras tcnicas
de laboratorio, la cantidad (en peso) del enzima presente en la muestra lo que se mide, sino su
funcionalidad. Esto no quiere decir que sea imposible la determinacin de la cantidad de enzima
presente (que puede conseguirse por mtodos de alta sensibilidad, ya sean inmunolgicos -como el
RIA, ELISA, EQL, inmunoelectroforesis- o cromatogrficos).
La actividad cataltica de un enzima se mide mediante la determinacin de la cantidad de
sustrato transformada en producto por unidad de tiempo (en condiciones definidas y controladas).
Las unidades de actividad cataltica son la U.I./L (en el sistema convencional) y el Katal/L
(en el sistema internacional):
U.I. = cantidad de enzima que produce 1 mmol/min de producto
Katal = cantidad de enzima que produce 1 mol/s de producto
1 U.I. = 1'6710-8 Kat

En la prctica, para determinar la actividad cataltica de un enzima cualquiera (y siempre

que mantengamos constante la temperatura y el pH de la reaccin y trabajemos con concentraciones
de sustrato al menos 10 veces mayores que Km para as alcanzar una cintica de orden cero),
podemos:
Medir el aumento de producto que se forma a lo largo de la reaccin.
Medir la disminucin de sustrato que va ocurriendo a lo largo de la reaccin.
Para que una determinacin enzimtica sea vlida, hay que hacer hincapi en que la
concentracin de enzima debe ser el nico factor limitante de la reaccin y en que la velocidad de
dicha reaccin no debe estar influda por situaciones distorsionantes (temperatura, pH, sustrato
insuficiente) ni sustancias presentes en el medio (activadores, inhibidores).
Si representamos en unos ejes de coordenadas el aumento de producto (o la disminucin de
sustrato) en funcin del tiempo de reaccin, obtendremos los siguientes grficos:
1.
Fase de retraso: tras aadir muestra (con el enzima problema) a una mezcla de reaccin, se

produce un periodo de latencia (cuya duracin va de segundos a minutos) durante el cual

enzima y reactivos se unen entre s. La actividad enzimtica no debe determinarse durante
esta fase, ya que la reaccin se encuentra dentro del periodo de cintica de primer orden
(existen pocos complejos Enzima-Sustrato y muchas molculas libres de enzima).
2.

Fase de velocidad inicial: durante ella, la velocidad de formacin de producto (o de

disminucin de sustrato) tiene lugar de una manera lineal con respecto al tiempo. La
reaccin enzimtica tiene ahora dinmica de orden cero y, por tanto, todas las molculas de
enzima estn en forma de complejos ES. Esta es la fase en la que debe determinarse la
actividad enzimtica.

3.

Fase de velocidad reducida: se caracteriza por una disminucin progresiva de la formacin

de producto (o de la disminucin de sustrato). La reaccin enzimtica vuelve a tener cintica
de primer orden, por lo que aqu tampoco debe determinarse la actividad enzimtica. La
disminucin de la velocidad de reaccin se debe fundamentalmente al agotamiento del
sustrato, con la consiguiente existencia de molculas de enzima libres. Cuando se entra en la
fase de velocidad reducida, la reaccin deja de ser lineal, por lo que se dice que se ha
alcanzado el LIMITE DE LINEALIDAD; en estas circunstancias, la muestra debe ser
diluda y vuelta a analizar (para que, al disminuir la concentracin de enzima, el sustrato se
agote ms lentamente y el periodo lineal se alargue). Antes de dar el resultado, debemos
multiplicarlo por el factor de dilucin.

7.3. Metodologa:
Una vez que la reaccin enzimtica se inicia (al aadir suero a una mezcla de reaccin) y se
alcanza la cintica de orden cero, pueden utilizarse dos mtodos para determinar la actividad
enzimtica: el de punto final y el cintico (ya sea de puntos mltiples o de vigilancia continuada):
Mtodo de punto final:
Es poco utilizado actualmente; supone incubar la mezcla un tiempo predeterminado y,
transcurrido dicho tiempo, detener la reaccin y medir la variacin de la absorbancia (por tcnicas
colorimtricas o ultravioletas), calculando a partir de ella la actividad del enzima. Su principal
desventaja es que no sabemos con certeza si la reaccin progresa en forma lineal y, por tanto, tiene
dinmica de orden cero.
Mtodos cinticos:
Suponen la realizacin de varias mediciones de absorbancia. Pueden ser de dos tipos: puntos
mltiples (los ms usuales) y vigilancia continuada; ambos tipos pueden utilizar tcnicas
colorimtricas o ultravioletas. Los mtodos cinticos permiten conocer si la reaccin progresa o no
en forma lineal y, por tanto, tiene dinmica de orden cero.
-Mtodo cintico de puntos mltiples colorimtrico:
El enzima de la muestra acta sobre un sustrato presente en el reactivo para ejercer
su accin biolgica; como consecuencia de ello se forma un producto que interacciona con
un indicador tambin presente en el reactivo. El resultado final es la formacin de un
cromgeno (compuesto coloreado) que puede llevarse al espectrofotmetro y leerse a una
longitud de onda visible.
Tras la mezcla muestra-reactivo y el periodo de incubacin pertinente, se hacen
varias lecturas a intervalos regulares de tiempo, se calcula la media de las diferencias de
absorbancia por intervalo de tiempo (E/T o A/T) y se multiplica por un factor
suministrado por el fabricante del reactivo y calculado segn la siguiente frmula:

1
V
F = 1.000
b
v

=Coeficiente de extincin molar

b=Ancho de cubeta
V=Volumen de la mezcla reactiva
v=Volumen de muestra

-Mtodo cintico de puntos mltiples ultravioleta:

Se basa en que las formas reducidas de los coenzimas que participan en las
reacciones enzimticas (NADH, NADPH) absorben luz UV a 340 nm, mientras que las
formas oxidadas de estos coenzimas (NAD+, NADP+) no lo hacen. El enzima de la muestra
acta sobre el sustrato presente en el reactivo, producindose una reaccin en la que
participa el coenzima (tambin presente en el reactivo); dependiendo de que se utilice la
forma reducida o la oxidada del coenzima, la absorbancia (que se mide a intervalos
regulares de tiempo tras la incubacin) ir disminuyendo (NADHNAD +;

NADPHNADP+) o aumentando (NAD+NADH; NADP+NADPH). Tras anotar las

absorbancias, se calcula la media de las diferencias por intervalo de tiempo (E/T o A/T) y
se multiplica por un factor suministrado por el fabricante del reactivo de acuerdo a la misma
frmula del apartado anterior.
-Mtodo de vigilancia continuada:
Exige utilizar un fotmetro dotado de un sistema de registro continuo que va
trazando el progreso de la reaccin a lo largo de un periodo de tiempo; la pendiente de la
porcin lineal de dicha reaccin se utiliza para calcular la actividad enzimtica. Cualquier
desviacin de la linealidad se observa de inmediato en la grfica de registro.
8. Los enzimas como reactivos:
Adems de utilizar los enzimas como indicadores del estado de los tejidos y rganos que los
producen, estos catalizadores tienen otras funciones tiles en el laboratorio, emplendose como
reactivos en la determinacin de otros analitos.
Como los enzimas slo catalizan determinadas reacciones, su uso como reactivos da
especificidad a estos procedimientos analticos, ya que as se eliminan las interferencias de otras
sustancias que comnmente alteran los resultados de procedimientos no enzimticos.
En estos casos, a diferencia de cuando los estamos determinando, los enzimas deben aportarse
en exceso para que la reaccin se efecte en su totalidad y no quede ninguna molcula del sustrato a
determinar sin reaccionar.