NDICE:

1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE

LOS PROCARIOTAS
2

EFECTO DE LA TEMPERATURA

2.1

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

2.2
CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA
TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS
2.2.1

MICROORGANISMOS PSICRFILOS

2.2.2

MICROORGANISMOS MESFILOS

2.2.3

MICROORGANISMOS TERMFILOS

2.3

EFECTO LETAL DEL CALOR

2.3.1

CALOR HMEDO

2.3.2

CALOR SECO

2.4
EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS
BACTERIAS
3

LIOFILIZACION

EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS

EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS

5.1
CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y
BIOMOLCULAS
5.2
EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS
APLICACIONES
5.3

EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA

5.3.1
FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR
LA LUZ UV
5.3.2
MECANISMOS DE REPARACION DE LOS
FOTOPRODUCTOS

5.3.3
5.4

APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV

EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE

EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS

EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA

EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA

EFECTO DEL pH

1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS

FACTORES AMBIENTALES SOBRE
LOS PROCARIOTAS
Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas
procariticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e
inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de
millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones
ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de
adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados
ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas
preconcebidas de lo que es la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos
unicelulares viviendo cmodamente a pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en
salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes
presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos
consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En este captulo
veremos algunas de estas notables adaptaciones.
Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en
funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas
condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con
microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de
agentes fsicos y qumicos que
1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados
valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;
2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats
naturales;
3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la
fijacin de parmetros para:

a) la mutagnesis,
b) la esterilizacin y desinfeccin,
c) la quimioterapia.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor
ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie
bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir
entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos
que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la
hubiera) o de reproduccin.
Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente
manera:

Agentes fsicos (tema 13)

Agentes qumicos (tema 14)

Temperatura

Desinfectantes y antispticos

Desecacin

Quimioterpicos de sntesis

Radiaciones

Antibiticos

Ondas sonoras
Presin hidrosttica
Presin osmtica
pH

2 EFECTO DE LA TEMPERATURA
2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL
CRECIMIENTO

La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que

condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de
generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se
mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en
funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos
llamados temperaturas cardinales:

Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento;

Temperatura mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento;
Temperatura ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo).
El margen entre la temperatura mnima y la mxima se suele llamar margen de
crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.
La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la
fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de
nutrientes y el gradiente de protones.

Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando

proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones
metablicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha
temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a su mxima tasa posible.
A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se
produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura
mxima. Dicha temperatura refleja desnaturalizacin e inactivacin de protenas
enzimticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplsmica y a veces lisis
trmica de la bacteria.
Obsrvese en el grfico que la temperatura ptima est ms cerca de la mxima que de
la mnima.

2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN

LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES
EVOLUTIVAS
Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo
que una bacteria puede presentar una temperatura ptima superior a la temperatura
mxima de otra, o inferior a la temperatura mnima de una tercera. Segn el rango de
temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos
principales:

2.2.1

MICROORGANISMOS PSICRFILOS

Las psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C.

a) Las llamadas psicrfilas obligadas tienen temperatura ptima a 15-18C, como
por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente
aislada en aguas heladas de la Antrtida es lo que pudiramos llamar un
psicrfilo extremo: tiene su ptimo de crecimiento en 4C, y es incapaz de crecer
a 14C (se muere de calor!).
b) Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas)
presentan temperatura ptima en torno a los 20-30C y mximas a los 35C. Las
bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos
guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.
Ejemplos de medios permanentemente fros son la mayor parte de las aguas ocenicas
(cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan slo 12C por encima de cero) y las reas permanentemente heladas del rtico y de la
Antrtida. En los medios helados existen pequeas bolsas o microcavidades de agua
lquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy
caracterstico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir
color rojo a la nieve en algunas zonas de montaa a mitad de la estacin estival.

Las principales adaptaciones bioqumicas a medios fros exhibidas por estos

microorganismos psicrfilos son:
enzimas ms resistentes al fro;
sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;
los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos grasos
insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces);
ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitndose su
congelacin.
Los psicrotrofos (psicrfilos facultativos) son ms abundantes, ya que estn
adaptados a soportar grandes oscilaciones trmicas, y en verano pueden crecer a unos
30C-40C. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas
y hortalizas) que se guardan en frigorficos, alterando las cualidades organolpticas e
incluso, echndolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido).

2.2.2

MICROORGANISMOS MESFILOS

Los mesfilos presentan temperaturas ptimas a los 25-40C y mximas entre 35

y 47C. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patgenas) pertenecen a esta
categora. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y
tropicales, incluyendo los simbiontes y parsitos, pertenecen a esta categora.

2.2.3

MICROORGANISMOS TERMFILOS

Las nicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65C son todas
procariotas. Los termfilos presentan ptimos a 50-75C y mximos entre 80 y 113C.
Dentro de esta categora se suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas),
que pueden llegar a presentar ptimos cercanos a los 100C, y que taxonmicamente
pertenecen al dominio de las Archaea.
Los hbitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima
de 45-50C) estn restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente
relacionadas con fenmenos volcnicos:
fuentes termales volcnicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japn, Nueva Zelanda e
Islandia);
fuentes termales submarinas: los llamados humeros (fumarolas hidrotermales)
asociados a las grandes dorsales ocenicas);

fumarolas
Los materiales en fermentacin como acmulos de abono (compost) y ensilados
pueden alcanzar 65C.
Como ejemplo clsico, muy conocido por documentales de divulgacin, recordemos que en el
famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentracin mundial de
fuentes volcnicas, con giseres que emiten a ms de 100oC, siendo esta temperatura bastante
constante, con oscilaciones de +/- 1 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullicin. El
riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente
de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas
diversas temperaturas. All fue donde T.D. Brock descubri la eubacteria termfila Thermus
aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se est recurriendo a usar la polimerasa
de una arquea hipertermfila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100C.

Los hipertermfilos, con ptimos por encima de los 80C son de hecho incapaces
de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus,
Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros
termales submarinos tiene su ptimo nada menos que a 105C y puede llegar a
aguantar 113C, y parece que detiene su metabolismo (por fro) a la agradable
temperatura de 90C (!).
Las termfilas facultativas pueden crecer a menos de 37C, como p. ej. la
eubacteria Thermus aquaticus.
Se han aislado bacterias termfilas en medios artificiales, como calentadores de
agua domsticos e industriales.
Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas
vegetativas bacterianas son:
enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy
hidrfobo;
ribosomas termorresistentes;
membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms
fuertes.
En Arqueas hipertermfilas los lpidos son muy especiales: en vez de basarse en
steres de cidos grasos con el glicerol, se trata de teres de hidrocarburos unidos al

glicerol (el enlace ter es ms resistente). Algunas, adems, en vez de la tpica bicapa
lpdica, exhiben una monocapa bioqumica de C40-bifitanil-tetrateres (resultado de
unirse cola con cola dos C20-fitanil-diteres), que condicionan una extrema
resistencia a agentes ambientales. (repasar tema 6).

2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR

Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se
dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las
bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un
medio idneo. La muerte por calor es una funcin exponencial de primer orden:
dN/dt = -KTN
O sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor
supone la muerte de una fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada
momento.
La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la
muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura
esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la
membrana).
Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de
una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados:
tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las
bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura;
tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la
densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D);
punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un
tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

Ejemplos
punto trmico mortal

Especies

55oC

Escherichia coli

60oC

Mycobacterium tuberculosis

120oC

endosporas de especies muy resistentes de Bacillus.

Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias,

como en las de fabricacin de conservas, centrales lecheras, etc.
Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la
temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento trmico, lograremos
inactivacin parcial de la poblacin microbiana (es decir, queda una fraccin de
clulas viables) o bien esterilizacin (=inactivacin total).
En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con
un agente fsico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o qumico (como
veremos en el captulo 14) que acarrea la eliminacin de toda forma de vida en l. Una
vez estril, el material sigue estril indefinidamente con tal de que est encerrado en un

compartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente
exterior.
Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden
lograr por calor hmedo o por calor seco.
La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de
protenas y a la fusin de lpidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces
dbiles, sobre todo los puentes de hidrgeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces
se rompen ms fcilmente por calor hmedo (en atmsfera saturada de vapor de agua),
debido a que las molculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrgeno.

2.3.1

CALOR HMEDO

Por lo tanto, la inactivacin por calor hmedo requiere menores temperaturas

que la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de
inactivacin total por calor hmedo:

Microorganismo

condiciones

La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, levaduras y

hongos

80oC , 5-10 min

Bacilo tuberculoso

58oC , 30 min

Bacilo tuberculoso

59oC , 20 min

Bacilo tuberculoso

65oC , 2 min

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis

60oC , 60 min

La mayora de esporas de bacterias patgenas

100oC , pocos min

esporas del patgeno Clostridium botulinum

100oC , 5,5 horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos

100oC , muchas horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos

120oC , 15 minutos

Veamos los mtodos principales de lograr esterilizacin de materiales por calor

hmedo:
Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar
muestras por calor hmedo a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua (sin
que sta hierva), debido a que el tratamiento se efecta en un compartimento estanco
saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosfrica. (El
funcionamiento del autoclave ser oportunamente explicado en clases prcticas). Los
parmetros de esterilizacin suelen ser: temperatura 121C y 10-15 min. Como se puede
deducir, estos parmetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies
saprofitas (ver ltima lnea de la tabla anterior), que son las formas de vida que ms
aguantan el calor sin perder viabilidad.
(Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear
condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes
de lquido, habr que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min, ya que el centro del
recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura de
esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a
115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto,
en estas ocasiones, el tiempo tambin es mayor: 30 min).
La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor
latente del agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las muestras a
esterilizar) se calienten rpidamente por condensacin de agua en su superficie.
Tindalizacin (nombre en honor de John Tyndall): Es un mtodo de esterilizacin
fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a ms de 100C. Consiste en
someter el material a varios ciclos (normalmente 3 4) de dos fases sucesivas cada uno:
a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100C,
durante 1 2 horas;
b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37C durante 24
horas.
Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra,
pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las
fases de tipo b) se produce la germinacin de las esporas activadas en la respectiva fase
anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirn las clulas vegetativas procedentes de la
germinacin en la fase anterior; y as sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos
ciclos no queda ningun microrganismo en la muestra.
Como se puede ver, este mtodo es bastante engorroso y consumidor de tiempo,
por lo que en los ltimos aos ha sido reemplazado por otro mtodo de esterilizacin,
aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilizacin por filtracin. Consiste
de hacer pasar una solucin a travs de una membrana o filtro de un tipo de material
(normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamao inferior al de
cualquier clula bacteriana (dimetro de poro =0,22 m).
Aplicaciones principales del calor hmedo:

1. En la prctica cotidiana del laboratorio de microbiologa, en la esterilizacin de

medios de cultivo y soluciones.
2. En la esterilizacin de material quirrgico.
3. En la esterilizacin o inactivacin parcial, en las industrias alimentarias (conservas,
leche y derivados).
a) En la industria lctea se emplean como mtodos de esterilizacin la llamada
uperizacin. La uperizacin o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de
calor hmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos
segundos (p. ej.: 135-150C durante 1-2 seg).
b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar
eliminar los posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla, y
que son ms sensibles al calor que los saprfitos inofensivos. Con esta
inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche logramos que sta
se conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y
nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto:
i.

La pasteurizacin (en honor a Pasteur, que la introdujo en los aos

1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se
enfra y envasa rpidamente.

ii.

La pasteurizacin instantnea (tambin conocida por sus siglas en

ingls HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72C
durante slo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfra
rpidamente. Esta tcnica es la ms usada actualmente, ya que:
mata ms rpidamente;
mata mejor organismos ms resistentes;
altera menos el sabor;
acta en flujos continuos (y permite procesar grandes volmenes de
leche).

Tras la pasteurizacin, el nmero de bacterias viables desciende un 97-99%. Los

potenciales patgenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo
tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados fcilmente. La pasteurizacin
tambin se emplea para la preparacin de vacunas a base de microorganismos
inactivados por el calor.

2.3.2

CALOR SECO

Como ya dijimos, la esterilizacin por calor seco necesita recurrir a mayores

temperaturas que la efectuada por el calor hmedo, ya que al no existir agua, la rotura
de puentes de hidrgeno y la desnaturalizacin de protenas, as como la fusin de
membranas, se efectan a mayores energas. Otros efectos del calor seco son los daos
por oxidacin y el provocar un aumento de la concentracin de electrolitos.
Aplicaciones del calor seco:
1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170C durante 2-3
horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor:
material de vidrio y metlico, aceites y jaleas, etc.
2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metlicas de siembra, con las que se
inoculan las bacterias.
3. Incineracin de materiales de desecho.

2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS

SOBRE LAS BACTERIAS
Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mnima) no son tiles para
la esterilizacin, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelacin
(p. ej., especies patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras
muchas es, sobre todo, bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o
psicrotrofos.
Los efectos de someter una suspensin bacteriana a temperaturas menores de
0C dependen de:
el medio donde estn suspendidas las bacterias;
el modo en que se realice la congelacin y una ulterior descongelacin.
Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelacin del
medio, el citoplasma queda en sobrefusin (sin congelar) entre -1 y -10C. Pero como
la tensin de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una
tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:
por prdida de agua de la clula (cuando la congelacin se efecta lentamente), o bien
por cristalizacin de agua en el interior (cuando la congelacin se realiza
rpidamente).

En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que

supone que la solucin del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitacin de
sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentracin de
electrolitos provocan la desnaturalizacin de protenas y daos a la membrana; otro
efecto de menor importancia es el dao mecnico a la pared celular y a la membrana
provocado por los cristales de hielo.
En general, el enfriamiento rpido es ms lesivo que el lento, existiendo una
velocidad ptima. Cuando una bacteria se enfra rpidamente a -35C se producen
cristales de hielo que provocan daos cuando la muestra se descongela.
Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la
descongelacin, y el nmero de ciclos de congelacin-descongelacin. La
descongelacin lenta es ms letal que la rpida, ya que aumenta el volumen de cristales
de hielo.
Aplicaciones de la congelacin:
La congelacin se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas
durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de
maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cmo se
efecta tanto la congelacin como la descongelacin. Una vez congeladas, las bacterias
supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la
temperatura se mantenga por debajo del punto eutctico:
en nieve carbnica (CO2 slido), a -78C;
en nitrgeno lquido, a -180C.
Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante
largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno lquido es
que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay mtodos
menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos
periodos de tiempo.
Para preservar an mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a aadir a
la suspensin ciertas sustancias, como por ejemplo:
Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificacin
amorfa y vtrea, en lugar de la cristalizacin, evitando as la formacin de zonas
intracelulares con alta concentracin de sales: glicerina, sacarosa, lactosa,
dimetilsulfxido (DMSO).
Materiales ricos en protena: leche, suero, extracto de carne.

Protenas purificadas (p. ej., la albmina).

Determinadas macromolculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.
La suspensin bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas
sustancia entre -25 a -30C, en congelador. Si se hace con nitrgeno lquido, la
conservacin puede ser de varios aos.

3 LIOFILIZACION
La liofilizacin es la desecacin al vaco de una muestra previamente congelada.
Aplicada a bacterias, es uno de los mtodos que mantiene por ms tiempo la viabilidad
bacteriana (varios aos). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o
suero (vase epgrafe anterior), se congela sobre nieve carbnica (-78C), y se conecta a
una bomba de vaco, que provoca la desecacin. La eliminacin de toda el agua sobre la
muestra congelada aumenta la viabilidad de sta, que se guarda en ampollas cerradas de
vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos
aos despus.

4 EFECTO DE LA DESECACION
SOBRE LAS BACTERIAS
La desecacin al aire (sin vaco) mata a las clulas vegetativas bacterianas, pero
no a las endosporas. La sensibilidad a la desecacin vara de una especie a otra.
Ejemplos:
Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en
ausencia de luz), de ah que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de
enfermos.
En cambio, el vibrin colrico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de
slo dos horas.
Las causas de la muerte son, principalmente:
el aumento de concentracin intracelular de sales, lo que conlleva efectos txicos y
desnaturalizantes de protenas;
daos por oxidacin.

La mayor eficacia de la desecacin al aire se logra con 50% de humedad relativa.

5 EFECTO DE LAS RADIACIONES

SOBRE LAS BACTERIAS
5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE
RADIACIONES Y BIOMOLCULAS
Se puede definir la radiacin como la propagacin de energa por el espacio. Los
principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:

radiacin electromagntica

(longitudes de onda, en nm)

radiacin infrarroja (IR)

800-106

radiacin visible

380-800

ultravioleta (UV)

13,6-380

rayos X

0.14-13.6

rayos

0.001-0.14

rayos csmicos

< 0.001

Los efectos derivados de la absorcin de radiacin dependen de:

la energa de la radiacin absorbida;
la naturaleza del material.

1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los
rayos (estos ltimos se emiten como resultado de la desintegracin de radioistopos).
Un fotn de gran energa incide sobre un tomo, provocando la expulsin de un electrn
de gran energa (fotoelectrn), y quedando el tomo en forma ionizada (cargado
positivamente). El electrn expulsado suele tener energa suficiente para originar una
nueva ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa, etc... producindose una
cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energa, hasta que sta se disipa
en el material: el ltimo electrn de la cadena es captado por otro tomo o molcula,
que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones
(uno positivo y otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentar
reorganizaciones electrnicas ulteriores, que dan pie a cambios qumicos en el sistema
que se haba sometido a la irradiacin.
2) Si la energa es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del tomo o
molcula pasan transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energtico superior
(entonces se habla de que el tomo o molcula estn excitados), pero enseguida dicho
electrn vuelve al estado energtico inicial. En su regreso a su nivel energtico previo,
el electrn puede dar origen a una variedad de fenmenos:
fluorescencia: emisin de energa a una longitud de onda mayor que la del fotn
incidente;
fotosensibilizacin: la energa se transfiere a otra molcula;
reacciones fotoqumicas: se origina un cambio qumico;
emisin de calor: la energa simplemente se disipa en colisiones entre molculas.
La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoqumicas, aparte de
calor. Pero la radiacin infrarroja slo conduce a disipacin de calor, si bien ciertas
bacterias fotosintticas anoxignicas pueden aprovechar el infrarrojo para la
fotosntesis.

5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONES

IONIZANTES Y SUS APLICACIONES
Aunque la unidad de radiacin emitida es el roentgen (R), a efectos biolgicos se
usan parmetros que miden la energa absorbida por el sistema: las unidades son el rad
(100 erg/g) y el gigaray (1Gy = 100 rads).
En general, los microorganismos son ms resistentes a las radiaciones ionizantes
que los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reduccin decimal (D10) para las
endosporas de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las clulas
vegetativas de la bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre especfico) es

de 2.200 Gy. Otras especies ms normales poseen una dosis de reduccin decimal en
torno a 200-600 Gy. Compara estos datos con el valor de slo 10 Gy como dosis letal
para humanos.
Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos y
los radioistopos, como el Co60 o el Cs137.
Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como
indirectos, as como mutagnicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de
radiacin, mientras que los letales indirectos y mutagnicos se consiguen a menores
dosis.
1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiacin ionizante sobre alguna
molcula esencial para la vida, que es el ADN (ya que obviamente es absolutamente
esencial y suministra una sola copia de la mayora de los genes bacterianos). Los daos
al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas
cadenas, que no puedan repararse.
2. Efecto mutagnico: deriva de la produccin de daos menores al ADN que pueden
repararse por mecanismos propensos a error.
3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el ms importante, y deriva de la
radiolisis del agua, que genera hidrgeno naciente (H) y radical hidroxilo (OH). El
radical hidroxilo reacciona fcilmente con macromolculas, sobre todo con ADN,
provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si,
adems, la bacteria est expuesta al oxgeno mientras se la est irradiando, el efecto
es an ms intenso, debido a que el O2 reacciona con los radicales libres, originando
cadenas de reacciones de autooxidacin, muy destructivas, y promoviendo la
formacin de perxidos y epxidos, asimismo letales.
H + O2 HO2
2 HO2 H2O2 + O2
Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilizacin de:
material farmacutico (antibiticos, hormonas, etc);
material mdico-quirrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas
desechables, agujas, bistures, catteres, prtesis, etc);
alimentos envasados (aunque en algunos pases an sigue abierta la polmica por
parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento).

5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONES

ULTRAVIOLETA
La radiacin UV tiene un efecto letal y mutagnico, que depende de su longitud
de onda. Ello se debe a la absorcin selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas
molculas biolgicas:
Las protenas tienen dos picos (es decir, mximos) de absorcin: uno a 280 nm,
debido a los aminocidos aromticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los
enlaces peptdicos.
El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y
5 de las bases pricas y pirimidnicas.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios qumicos en
las molculas absorbentes, de modo que aparecen molculas alteradas denominadas
genricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivacin de
macromolculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos
para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.
Las consecuencias de inactivar protenas o ARN no se dejan sentir a efectos de
letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromolculas, y
se pueden volver a sintetizar. En cambio, la inactivacin del nico cromosoma de la
bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagnicos secundarios. Por lo tanto,
el espectro de accin biolgica de la luz UV equivale al de absorcin del UV por el
ADN (260 nm).

5.3.1
UV

FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ

Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente

de alteraciones en las bases pirimidnicas (citosina, timina):
a) dmeros de pirimidina (anillo ciclobutano)
b) fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
c) hidratos de pirimidina
Los dmeros de pirimidina son los fotoproductos ms importantes en las clulas
vegetativas bacterianas. El principal es el dmero de timina (T-T), aunque tambin se
producen T-C y C-C. Como se puede observar, se trata de aductos (uniones) entre dos
pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creacin de un anillo de
ciclobutano. Su efecto principal es la distorsin local de la configuracin de la doble
hlice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su

vez, provoca una interferencia en los procesos de replicacin y transcripcin, y

secundariamente en el crecimiento y la respiracin.
A dosis muy altas de rayos UV se forman tambin dmeros entre pirimidinas de
las dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que
igualmente afectan a la replicacin y a la transcripcin, aunque este tipo de daos
reviste menos significacin biolgica.
El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el
captulo 9, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratacin,
pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.
Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas
dosis de luz UV. Tienen efecto mutagnico (no letal), favoreciendo la aparicin de
transiciones T=A a CG.

5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOS

FOTOPRODUCTOS
Debido al carcter esencial del ADN como molcula central informativa de los
seres vivos, la evolucin ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para
enfrentarse con los posibles daos ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales
mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar as:
1) Mecanismos prerreplicativos:
a) reparacin fotoenzimtica o fotorreactivacin, que permite la reparacin directa
del dao en s
b) reparacin por escisin y resntesis
2) Mecanismos posreplicativos:
a) reparacin por recombinacin
b) reparacin inducible de emergencia (SOS)

A) Reparacin fotoenzimtica
Se debe a la actuacin de una enzima denominada fotoliasa o enzima
fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas
reparan directamente los dmeros de pirimidina, en una reaccin que requiere luz
visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos
prostticos coloreados (cromforos):
flavina reducida (FADH2)

una pterina.
Mecanismo
1) La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el
dmero de pirimidina, y se une a l, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2) La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz (=300-500), se
excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dmero de pirimidina,
rompindolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
Aunque se sabe que el segundo cromforo (la pterina) favorece la reparacin, no
est claro cul es su papel exacto.
No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la
fotorreparacin est muy extendida entre eucariotas.
B) Reparacin por escisin-resntesis
La distorsin en la doble hlice provocada por el dmero es reconocida por un
complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como
correndonucleasa o escinucleasa. El dao se repara indirectamente (es decir, no se
acta sobre el propio fotoproducto), sino que las bases daadas se eliminan (se
escinden) formando parte de un oligonucletido, y el hueco resultante se rellena por
resntesis reparadora de ADN.
Mecanismo:
1) Un complejo formado por dos subunidades de la protena UvrA y una de la UvrB
(Uvr[A2B]) se une cerca del dmero de pirimidina, usando la energa de la hidrlisis
del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hlice.
2) Se une la protena UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr[A2BC], es decir,
la correndonucleasa, unido a la cadena daada del ADN, cerca del dmero.
3) La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dmero: corta el
8 enlace fosfodister a la izquierda del dmero (o sea, hacia el lado 5') respecto de
la localizacin del dmero y corta el 4 o 5 enlace fosfodister a la derecha (en
direccin 3' del dmero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12
nucletidos de longitud, que incluye al dmero de pirimidina, al mismo tiempo que
se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipptidos constituyentes.
4) Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora
por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD),
que llevan a la sntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en
sentido 5' 3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador
(primer) el extremo 3'-OH que se haba generado en la fase anterior.

5) Finalmente, la actuacin de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneracin del enlace

fosfodister del lado 5').
C) Reparacin por recombinacin
Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente
replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que est usando como molde, con un
dmero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y salta unos 1000 nucletidos ms
adelante para seguir la replicacin. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos
1000 nucletidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar
por el mecanismo de reparacin por recombinacin general, recurriendo a la protena
RecA, que verifica una recombinacin con la hebra parental homloga intacta.
Mecanismo:
1) Numerosas unidades de protena RecA recubren la zona de cadena sencilla de la
mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
2) La protena RecA promueve emparejamiento homlogo de la cadena sencilla a la
que recubre con la doble cadena hermana intacta.
3) Se produce un intercambio recproco de cadenas.
4) El extremo 3'-OH libre de la cadena daada (que merced al intercambio recproco
est ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hlice
hermana) sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo
usando como molde la cadena complementaria intacta del dplex.
5) Ligacin e isomerizacin espontneas, que produce la llamada estructura de
Holliday, una figura en X donde hay dos sobrecruzamientos (crossing-over)
que mantienen unidos entre s a los dos duplex.
6) Resolucin de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual
genera dos dobles hlices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos
dplex lleva el dmero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque
parte de ella contien ADN de nueva sntesis.
Como se puede ver, el mecanismo de reparacin por recombinacin no repara
por s mismo la lesin en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando
que se detenga la replicacin del cromosoma. Al final del proceso el dmero como tal
sigue sin reparar, pero ahora tendr una oportunidad de ser reparado por algn otro
mecanismo, como el de escisin-resntesis.
D) Reparacin de emergencia (SOS) propensa a error
Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados
agentes qumicos que daan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la
replicacin, puede ocurrir que los sistemas de reparacin que hemos visto hasta ahora
no sean suficientes para reparar todos los daos; en estas circunstancias se pone en
marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia,

ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la clula, a costa de acumular mutaciones

con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos tambin propenso a error).
Descripcin del sistema en una clula normal (no sometida a daos al ADN):
El gen lexA posee un nivel basal de expresin, de modo que codifica la protena
LexA, que acta como represor sobre su propio gen (represin autgena), as como
sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represin no es total, sino que se da un
nivel basal de produccin de los polipptidos correspondientes a estos genes. As, por
ejemplo, el nivel de protena RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de
recombinacin, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeos daos
en el ADN.
Descripcin del sistema en una clula severamente daada:
Una clula seriamente afectada por un agente que daa el ADN o interfiere con
su replicacin poseer zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin
reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una seal de situacin de emergencia
para la protena RecA: dicha protena se une a esas regiones de c.s., de modo que
adquiere una actividad proteasa muy especfica (para distinguir esta actividad, usamos
la nomenclatura RecA*). La protena RecA* (activada como proteasa) induce la
proteolisis del represor LexA (rompindolo entre dos aminocidos concretos hacia la
mitad de la molcula). Por lo tanto, ya no hay suficiente protena LexA intacta como
para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes
(llamados genricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo
que:
Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la
reparacin por recombinacin;
Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone mejorar la
reparacin por escisin-resntesis;
Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagnesis.
Pero por qu aumenta la mutagnesis? El mecanismo exacto no est claro. Se sabe
que en esta situacin de emergencia algunos dmeros de pirimidina son procesados
con la intervencin de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay
una sntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introduccin de
bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparacin propenso a error).
De esta manera, la clula salvara su integridad en esta situacin lmite, pero a
costa de adquirir frecuentes mutaciones. (Es mejor sobrevivir aunque sea con unas
cuantas mutaciones a morirse!).

5.3.3

APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV

La luz UV se puede producir artificialmente en lmparas de vapor de mercurio

de baja presin, que emiten el 90% de su radiacin a 254 nm. La unidad de energa de
radiacin se mide en watts/(segcm2).
Por ejemplo, una lmpara de 15 watios emite una energa de 38wattscm-2seg-1, a
una muestra situada a 1 metro de la lmpara.

La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La

dosis letal para clulas vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 wattcm-2, pero las
endosporas requieren 10 veces ms dosis.
El uso prctico de la luz UV como agente esterilizante est limitado, ya que
tiene poco poder penetrante: no entra en objetos slidos, y adems se ve apantallada
por el cristal y penetra poco en los lquidos. Su aplicacin concreta ms frecuente es en
el control de infecciones por va area: lmparas de desinfeccin en salas de hospitales y
de laboratorios de investigacin. En Microbiologa se emplea la luz UV como agente
mutagnico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes
correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases
genticas).

5.4

EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE

A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energa, y adems, sus cuantos no

tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sera de esperar, en principio, que
este tipo de radiacin tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz
visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenmeno de sensibilizacin
fotodinmica.
La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposicin a pleno sol) es capaz de
matar las bacterias, debido a que ciertas molculas de stas (riboflavinas, porfirinas,
citocromos) absorben la energa de los cuantos y se excitan durante 10-6-10-8 seg, tras lo
cual reemiten la energa a otras molculas, originando fotooxidaciones en residuos His
y Trp de las protenas y en las bases de los cidos nucleicos. Tambin se puede generar
oxgeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la
clula con rapidez.
As pues, la moraleja prctica es: no dejarse los cultivos bacterianos expuestos a
la luz solar, sino que habrn de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias
fototrofas).
Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintticas, y las que se propagan va area)
poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos
fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energa del oxgeno singlete y la
reenvan al estado basal, no excitado).

6 EFECTOS DE LAS ONDAS

SONORAS

Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias
entre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitan las
ondas supersnicas (hasta los 200 Kc/seg) y las ultrasnicas (desde 200 hasta 2000
Kc/seg). Estos tipos de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las
ultrasnicas) tienen el efecto de desintegrar las clulas.
El fundamento de esta accin es el siguiente: el paso del sonido a travs de un
lquido produce cambios de presin alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que
a grandes frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m
de dimetro (fenmeno de cavitacin). Dichas cavidades van aumentando de tamao y
terminan colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta
1000 atmsferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son:
la clula se desintegra;
si existe oxgeno en el lquido de suspensin, se forman perxidos (como el H2O2);
despolimerizacin de macromolculas;
cortes en ambas hebras del ADN.
Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones
sonoras. En general, son ms sensibles las Gram-negativas y ms resistentes las Grampositivas. Sin embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad
de que sobrevivan algunos individuos, por lo que este mtodo no tiene utilidad para la
esterilizacin.
El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada
sonicacin o disrupcin ultrasnica de clulas para obtener extractos celulares, en
investigaciones bioqumicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador
de ultrasonidos o sonicador, que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100
Kc/seg.

7 EFECTO DE LA PRESION
HIDROSTATICA
La mayor parte de las especies bacterianas de hbitats continentales no pueden
crecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2).
Ello se debe a los siguientes efectos adversos:
aumento de la viscosidad del citoplasma;

disminucin de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos;

interferencia en la divisin celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin
produccin de tabique transversal (crecimiento sin divisin celular).
Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas
presiones (barotolerantes y barfilas, respectivamente):
Bacterias barotolerantes: Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas
500 atmsferas. Su hbitat son las aguas ocenicas, entre los 2000 y los 4000 metros
de profundidad.
Bacterias barfilas: Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos
distinguir entre barfilas moderadas (facultativas) y barfilas extremas (obligadas):
Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presin
atmosfrica, aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas. Habitan profundidades
entre los 5000 y 7000 metros.
Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas presiones (por
encima de 600-700 atmsferas), y son incapaces de crecer a presin atmosfrica.
Se han llegado a aislar a ms de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas
profundidades la temperatura del agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente
crifilas. Este tipo de bacterias est empezando a ser investigado actualmente, y su
manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cmaras especiales presurizadas
que suministran las altas presiones que requieren.
Aplicacin prctica de las altas presiones a bacterias barosensibles:
La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente
como prensa francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes
presiones y brusca descompresiones, lo que logra la rotura mecnica de las bacterias,
con objeto (al igual que la sonicacin) de obtener extractos libres de clulas.

8 EFECTOS DE LA PRESIN
OSMTICA
(Repasa en el captulo 11 el concepto de potencial de agua o actividad de agua, aw)

Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias

pueden vivir en medios tanto hipotnicos como hipertnicos, debido a la proteccin de
una pared celular rgida y a la membrana citoplsmica semipermeable.
Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad
ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua al
interior. La presin de turgor es relativamente constante porque la membrana
citoplsmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presin de turgor
permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentracin de solutos
en su entorno (dentro de ciertos lmites). Pero esto plantea una pregunta (que
intentaremos responder a continuacin): cmo logra la bacteria ajustar su
osmolaridad interna a esos cambios exteriores?
A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que
ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la
membrana citoplsmica tienda a sufrir una presin de turgor excesiva.
B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma).
Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la
osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del
ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la
concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado
genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles
mecanismos:
bombeando iones al interior;
sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.
1) En el caso de los iones, el in bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema
de antiporte K+/H+.
2) Como ejemplos de sntesis de solutos orgnicos compatibles y osmticamente
activos tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa. En levaduras es frecuente
que el soluto compatible sea un poliol (sorbitol, manitol, etc.).
Ahora bien, si el medio es muy hipertnico, estos mecanismos ya son incapaces de
evitar la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retraccin de la
membrana citoplsmica. La prdida de agua puede suponer la deshidratacin del
citoplasma, lo que conlleva la detencin del crecimiento.
En Gram-positivas se produce una plasmolisis autntica (retraccin de la

membrana citoplsmica respecto de la pared rgida suprayacente)

En Gram-negativas no existe autntica plasmolisis, ya que la pared celular y la
membrana citoplsmica se retraen al mismo tiempo. Las bacteria entricas crecen
lentamente por encima de 0.65M de NaCl.
3) Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la mxima
terica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores.
La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usndolos como solutos
compatibles. Ejemplos de osmoprotectores exgenos que pueden ser bombeados al
interior celular:
Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus)
Betana (glicnbetana), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y
en algunas Gram-positivas).
Colina (en Escherichia coli).
Ectona en enterobacterias.
Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero
mejora si al medio se aade 1mM de prolina. Un mtodo normal de aislar
S.aureus es comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en
presencia de prolina.
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertnicos, y en
general se llaman osmfilos. Entre los osmfilos podemos distinguir los sacarfilos y
los halfilos.
Uno de los mejores ejemplos de microorganismos sacarfilos no es una bacteria, sino
las levaduras, que viven en jugos vegetales, nctares, zumos, etc. Utilizan como
solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.
Entre los organismos halfilos, podemos distinguir los halfilos moderados y los
halfilos extremos o hiperhalfilos.
Halfilos moderados: suelen ser bacterias marinas (ej.: Vibrio fischeri) que viven
en 3.5% de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o

menores de sales. Los halfilos moderados tienen requerimientos concretos de una

aw equivalente a la de agua de mar, as como concentraciones determinadas de iones
Na+. El papel jugado por este Na+ es:
mantenimiento de los sistemas de membrana citoplsmica y transporte;
estabilizacin de la pared celular;
requerimiento por parte de muchas enzimas.
Halfilos extremos (hiperhalfilos), representados paradigmticamente por las
arqueas del gnero Halobacterium, que viven en (y de hecho requieren)
concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto
compatible el K+, concentrndolo a partir del medio donde viven, hasta que el
citoplasma queda prcticamente saturado con l (4 a 7 M). Esta gran concentracin
de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas,
enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas
requieren altas concentraciones de cloruro sdico.
Dejando aparte las bacterias halfilas, hay algunas bacterias halotolerantes
(como por ejemplo, Staphylococcus aureus), pero la inmensa mayora de los procariotas
viven a valores de actividad de agua de 0.98. Por ello, un mtodo que ya se conoca
empricamente en la antigedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o
salarlos, o aadirles grandes cantidades de azcar (como en las mermeladas).

EFECTO DEL pH

La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio,

manteniendo al mismo tiempo su pH interno ptimo prcticamente constante.
Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH
interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden
clasificar en:
Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8).
Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.

Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.

La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas
modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por
ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el
medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminacin de aminocidos. Por otro
lado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren pHs ligeramente cidos (en
torno a 4-5).
Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o menos amplio
de pH (alrededor de un ptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la
membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae
rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir.
Uno de los mecanismos que, al menos en neutrfilos parece controlar el pH
interior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH cidos, el interior celular puede quedar
en principio ms alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y
saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un
potencial de membrana para establecer una fuerza protn motriz que les suministre
energa.
Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium
inducen una respuesta de tolerancia a cidos, consistente en ATPasas translocadoras de
protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir
las protenas desnaturalizadas.
Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo (acidfilos
extremos u obligados): Algunas eubacterias del gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T.
ferrooxidans) y las arqueas de los gneros Sulfolobus, Thermoplasma y Ferroplasma
tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta
cido sulfrico. (Sulfolobus es un Secciones un termoacidfilo). De hecho, estas
bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus
membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Una arquea
sorprendentemente acidfila es Picrophilus oshimae, cuyo pH ptimo es nada menos
que 0.7 (aparte de que es una termfila que necesita temperaturas de ms de 60C).
Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a 10-11. Por
ejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hbitats tpicos son suelos
carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son tambin halfilos, como
Natronobacterim gregoryi). Estos organsimos tienen gran inters industrial, porque de
ellos se obtienen enzimas hidrolticas como proteasas y lipasas que se usan como
aditivos en detergentes.

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