Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma

cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo
es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la
reduccin del tamao de los poros de la pared resultante del proceso de
lavado con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y
probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la
extraccin por el solvente del complejo.
, luego
se aade la solucin de lugol, que acta como mordiente, y se deja en contacto
por un 1 minuto. El yodo se combina con el cristal violeta y forma un compuesto
que precipita en el interior de la clula; este complejo puede extraerse fcilmente
usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta de las gram negativas, pero no se remueve fcilmente
de las gram positivas ya .que presentan una resistencia a la decoloracin; Las
clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando que
el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular, en
el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede
daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Una vez realizada la decoloracin se aade el colorante de
contraste, la safranina, safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de
contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
El por qu las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y
las gram negativas no, ha sido un tema muy controversial. Una de las
explicaciones que se dan, est relacionada con la naturaleza qumica de la pared
celular de las bacterias gram positivas que previenen la remocin del complejo con
el alcohol. Otra teora mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram
positivas, especficamente la capa gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al
encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los poros lo cual impide
la salida del complejo cristal violeta-lugol.
Se lleva a cabo despus la decoloracin. Algunos organismos (grampositivos) no
se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias
gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen

ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando

que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las
gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas
se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo,
como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las
clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen
azules.