Prctica 1:

Separacin de pigmentos
foliares. Anatoma foliar

Extraccin y separacin de pigmentos

foliares
En esta prctica vamos a separar pigmentos foliares, de esta manera
podremos clasificar la planta y mediante la cromatografa podremos saber
qu tipos de pigmentos tiene. El principal objetivo es saber distinguir si la
planta posee carotenos, clorofila y antocianina dependiendo de los
colores obtenidos. Posteriormente lo someteremos a una lmpara
incandescente y observaremos su fluorescencia.
Procedimiento y resultados
1. Homogenizar el tejido vegetal en un mortero con 20 ml de etanol al
95%, aadindole una pizca deCO3Ca para neutralizar los tejidos
cidos y prevenir la prdida parcial de Mg2+ de las clorofilas.
2. Filtrar a travs de papel de filtro en un embudo. La solucin
resultante contiene una mezcla de pigmentos (clorofila a y b,
diversos carotenoides, etc) y numerosas molculas incoloras
solubles en etanol.

3. Para realizar la cromatografa en papel, tomar una pequea fraccin

del extracto y ponerlo en la placa Petri. Depositar sobre ella un
trozo de papel de filtro en forma de "V" tumbada. Esperar a la
separacin de los pigmentos por cromatografa.

Xantofilas
Carotenoides
Clorofila a
Clorofila B

4. Tomar 5 ml del extracto y ponerlo en un tubo de ensayo limpio.

Aadir 5 ml de ter de petrleo, agitar para mezclarlo bien y
esperar a que se produzca la separacin de dos fases de distinto
color.

Fase etrea (Clorofilas)

Carotenoides

5. Ayudndonos de la pipeta Pasteur, recoger la capa superior (fase

etrea) que contiene las clorofilas y poner en un nuevo tubo de
ensayo. En la capa inferior (etanol) han quedado los carotenoides.

6. Aadir 5 ml de metanol acuoso al 92% v/v y mezclar. Esperar a la

separacin de dos fases, una superior de un tono ms intenso y que
corresponde a la clorofila a, mientras que en la inferior permanece
la clorofila b.

Clorofila a
Clorofila b

En el foco de luz comprobamos cual de los tubos de ensayo presenta color

rojizo, y vemos que el que tiene clorofila a (1 tubo) es el que desprende
cierto color rojizo.

Cuestiones
Por qu las plantas son verdes?

Porque contienen clorofila. La clorofila es verde porque es capaz de

absorber la luz violeta, roja y azul, y reflejar la verde.
Por qu se produce la distribucin cromatogrfica obtenida
de los pigmentos?
Se produce debido a que aquellos que tienen una mayor afinidad con el
etanol tienden a ascender con mayor velocidad que los dems. El grosor
de las bandas depende de la cantidad del pigmento en la disolucin.

A qu se debe el fraccionamiento de los pigmentos en los

distintos disolventes orgnicos?
Es debido a la distintas polaridad y afinidad de los distintos disolventes
orgnicos con los pigmentos.

Cmo explicaras el resultado obtenido en el experimento de

fluorescencia?
Se produce a que la clorofila cuando es expuesta a la lmpara absorbe rojo
y azul que no puede transmitirlo para realizar la fotosntesis y por tanto lo
desprende en color rojizo.

Qu te sugieren estas imgenes?

Imagen 1
Esta imagen es una representa una molcula de clorofila. La estructura de
las molculas de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina y una
cadena larga llamada fitol. El fitol es una cadena hidrocarbonada con
carcter hidrfobo. La cadena del fitol sirve para anclar la molcula de
clorofila en la estructura anfiptica de los complejos moleculares en que
residen las clorofilas. El color verde de la clorofila es debido a la absorcin
de luz realizada por aquellas molculas que contienen dobles enlaces.
Imagen 2

Esta imagen corresponde a la de un cloroplasto. A ste le est llegando la

luz solar siendo absorbida por la clorofila que la refleja en forma de
radiacin verde.
Imagen 3.
En esta imagen vemos como los pigmentos de clorofila (a y b) y carotenos
tienen una mayor absorbancia de la radiacin de onda corta que de la
radiacin de onda larga.

Qu ocurrira si iluminas a una planta nicamente con luz

monocromtica de longitud de onda 525 nm. ?
Que la planta no absorbera a penas nada de luz y emitira su color verde
habitual.

Glosario:
Pigmento: Un pigmento es una sustancia que refleja un color de luz
diferente al color de la luz absorbida.
Cloroplasto: Los cloroplastos son los orgnulos celulares que en los
organismos eucariontes fotosintetizadores se ocupan de la fotosntesis. Cromoplasto. Los cromoplastos son un tipo de plastos, orgnulos propios
de la clula vegetal, que almacenan los pigmentos a los que se deben los
colores, anaranjados o rojos, de flores, races o frutos.
Cromoplasto: Son un tipo de plastos, orgnulos propios de la clula
vegetal, que almacenan los pigmentos a los que se deben los colores,
anaranjados o rojos, de flores, races o frutos.
Carotenoides: Los carotenoides son pigmentos orgnicos del grupo de
los
isoprenoides. Su color, que vara desde amarillo plido, pasando por
anaranjado, hasta rojo oscuro, se encuentra directamente relacionado con
su estructura.

Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que se

hallan
en las vacuolas de las clulas vegetales y que otorgan el color rojo,
prpura o azul a las hojas, flores y frutos.
Cromatografa: Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de
retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes
de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de
dichos componentes.
Espectro de absorcin: muestra la fraccin de la radiacin
electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango
de frecuencias.
Fluorescencia: es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a
las sustancias que son capaces de absorber energa en forma de
radiaciones electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en
forma de radiacin electromagntica de longitud de onda diferente.

Observacin de la anatoma foliar

Relacin con el metabolismo fotosinttico
Materiales.
Hojas de plantas C3 , C4 y CAM
Portas y cubres
Bistur
Microscopio
Agua destilada

Procedimiento experimental.

1. Realizar cortes transversales de tres tipos de hojas, intentado hacer

dichos cortes lo ms finos posibles para una optima observacin a

travs del microscopio. Para cortar la hoja de la planta C4 se
utilizar un trozo apical del tallo, en el que se encuentran varias
hojas enrolladas (hojas amplexicaules), o se doblarn las hojas en
varias partes para incrementar la superficie de corte.

2. Una vez realizados los cortes sern montados en el porta con una

gota de agua, se coloca el cubre y se realizar la observacin.

Resultados.

Observacin CAM:

Epidermis

Clornquima

Haz vascular

Estas plantas tienen dos carboxilaciones separadas temporalmente:

Fijacin nocturna de CO2. Esta primera fase se da en la noche, cuando

tienen los estomas abiertos. A travs de ellos la planta capta
CO2 atmosfrico y la fosfoenolpiruvatocarboxilasa lo incorpora por
carboxilacin al fosfoenolpiruvato que se transforma
en oxalacetato, se desprende un grupo forfato; el oxaloacetato
formado de la prefijacin de CO2 es reducido en el citosol a malato
mediante la NAD-malato deshidrogenasa, el malato es bombeado con
gasto de energa a las vacuolas, donde se va acumulando como cido
mlico y es almacenado, provocando que el contenido vacuolar sea
muy cido (cerca de pH 3) durante la noche.

Con la salida del sol, los estomas se cierran previniendo la prdida

de agua e impidiendo la adquisicin de CO2. El cido mlico sale de la

vacuola y se descarboxila liberando el CO2 y cido pirvico el cual es

devuelto al ciclo tras ser fosforilado con ATP, produciendo nuevamente
fosfoenolpiruvato. Ya que los estomas estn cerrados, el CO2 liberado
internamente no puede escapar de la hoja y en lugar de esto es
reducido a carbohidrato por la operacin del ciclo C3 PCR. La
concentracin elevada en el interior de CO2 suprime efectivamente la
oxigenacin-fotorrepiratoria de la ribulosa 1-5 bifosfato y favorece la
carboxilacin.3
Este mecanismo de concentracin de CO2 permite disminuir la
probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de la RuBisCO por lo que
la eficiencia fotosinttica es mayor. Las plantas CAM suelen ser crasas (no
todas) y relegadas a ambientes secos (tambin existen CAM acuticas);
esto es debido a su bajo rendimiento total fotosinttico (ya que la
absorcin de dixido de carbono est limitado a la cantidad de MA que se
puede almacenar en la vacuola) por lo que son malas competidoras con
las plantas C3 o C4. Existen plantas CAM constitutivas o adaptativas (estas
ltimas slo tienen metabolismo cido de crasulceas bajo estrs hdrico,
etc.).
Estas plantas resuelven el problema de prdida de agua durante la
fotosntesis al abrir sus estomas solo durante la noche cuando la
temperatura es menor y la humedad del ambiente es comparativamente
alta

Observacin C3
Epidermis

Mesfilo

Las plantas denominadas C3 en el haz encontramos una capa de clulas

aplanadas que conforman la cutcula, tiene una funcin protectora, por el
envs, entre estas clulas se sitan las clulas guardia que dejan espacios,
los estomas por donde ingresa y salen fluidos como el CO2, una fila de
clulas vegetales alargadas conforman el parnquima en empalizada, cada
una de las clulas que conforman el parnquima se encarga de realizar
fotosntesis.
El metabolismo C3 es una serie de reacciones en las cuales participan gran
cantidad de molculas y enzimas para finalmente obtener los
carbohidratos necesarios para la nutricin y algunos compuestos de
desecho.
El ciclo de Calvin es tambin llamado ciclo C3, ya que aqu por medio del
ATP y NADPH formado en la primera etapa de la fotosntesis (fase
lumnica), es utilizado para la fijacin del CO2, en un compuesto de tres
tomos de carbono, el 3-Fosfoglicerato, proceso el cual ocurre en una
segunda etapa de la fotosntesis, denominada fase oscura. En esta
reaccin bioqumica toma gran relevancia una enzima rubisco que
combina una molcula de CO2 con el material de partida, un azcar de

cinco carbonos llamado RIbulosa-1,5-bifosfato, obteniendo as dos

molculas de 3-fosfoglicerato.

Observaciones C4:

Clulas buliformes

Haz vascular

Vaina mestomtica

Clornquima

El proceso de metabolismo consiste en la captacin del dixido de

carbono en las clulas del mesfilo de la planta pero el CO2, en vez de
utilizarse inmediatamente en el ciclo de Calvin, reacciona con el
fosfoenolpiruvato (PEP) gracias a la catlisis de la enzima
fosfoenolpiruvato carboxilasa. El producto final de la reaccin entre el PEP
y el CO2 es el oxalacetato, que posteriormente se convierte en malato. El
malato se transporta hacia las clulas de la vaina, donde es
descarboxilado, produciendo el CO2 necesario para el ciclo de Calvin,
adems de piruvato. Este ltimo pasa nuevamente al mesfilo donde se
transforma por medio de ATP en fosfoenolpiruvato, para quedar
nuevamente disponible para el ciclo.
La ventaja de este proceso radica en el hecho de que al estar la rubisco
encerrada en las clulas de la vaina se le impide la posibilidad de que
reaccione con oxgeno en situaciones en las cuales la concentracin de
CO2 sea muy baja, por lo cual se reduce considerablemente la prdida de
energa y de CO2 a travs de la fotorrespiracin. Incluso las molculas de
dixido de carbono generadas por la fotorrespiracin se reutilizan a travs
del PEP, que captura aquellas en el mesfilo para que ingresen al ciclo de
Calvin.

Qu te sugieren estas imgenes?

Imagen 1
Es una planta de tipo CAM. Las cuales son ms eficientes.
Imagen 2
Es una planta de tipo C4 y son las ms productivas.
Imagen 3
Es una planta de tipo C3, son las ms abundantes y estn en climas
hmedos y templados.
Imagen 4
Es una planta de tipo C4, son las ms productivas.

Qu ventajas ofrece cada metabolismo?

Las tipo CAM son ms eficientes, las C4 son las ms productivas y las C3
son las ms abundantes.

Glosario
Metabolismo: es el conjunto de reacciones bioqumicas y procesos
fsicoqumicos que ocurren en una clula y en el organismo.
Fotosntesis: es la conversin de materia inorgnica en materia orgnica
gracias a la energa que aporta la luz.
Parnquima: tejido vegetal constituido por clulas de forma
aproximadamente esfrica o cbica y con espacios de separacin.
Clulas del haz: cara superior de la hoja, normalmente ms brillante y lisa,
y con nervadura menos patente que en la cara inferior o envs.
Clulas de la vaina: ensanchamiento del pecolo o de la hoja que envuelve
el tallo.

Metabolismo cido de Crasulceas (CAM): el nombre de metabolismo

cido hace referencia a la acumulacin de cidos orgnicos durante la
noche por las plantas que poseen este mecanismo de fijacin de carbono.
Esta va metablica es semejante a la va C4, sin embargo en la va CAM la
separacin de los dos carboxilaciones no es espacial, como ocurre en las
plantas C4, sino temporal.
Carboxilacin: este mecanismo de concentracin de dixido de carbono
permite disminuir la probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de
la rubisco por lo que la eficiencia fotosinttica es mayor.
Descarboxilacin: es la reaccin qumica en la cual un grupo carboxilo es
eliminado de un compuesto en forma de dixido de carbono (CO2).

David Martnez Requena

Grupo 2