Fac744e PDF

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE INGENIERA EN ALIMENTOS
Evaluacin de una biopelcula con bacterias

cido lcticas y nisina para la inhibicin de
Listeria monocytogenes en salmn ahumado
Tesis presentada como parte de

los requisitos para optar al grado
de Licenciado en Ciencias de los
Alimentos.
Anbal Andrs Concha Meyer
VALDIVIA CHILE
2008
PROFESOR PATROCINANTE:
Sra. Renate Schbitz Twele

__________________________
Tecnloga Mdica, M. Sc., Food Microbiology
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
Universidad Austral de Chile
PROFESORES INFORMANTES:
Sra. Carmen Brito Contreras

__________________________
Ingeniero en Alimentos, M. Sc. Food Science
Sr. Kong Shun Ah-Hen

__________________________
Ingeniero en Alimentos, Dipl.- Ing.; Dr.-Ing.
Este trabajo fue financiado por el Proyecto FONDEF D04i -1153. De acuerdo a lo
informado por el Honorable Consejo Universitario del 19 de Octubre del 2005 sobre los
derechos de propiedad intelectual, los resultados de esta tesis estn encriptados para
no interferir y alterar procesos de obtencin de patentes y otros derechos.
AGRADECIMIENTOS
Mis ms profundos agradecimientos a las personas que me apoyaron, acompaaron y

ayudaron a cumplir este gran objetivo de mi vida. En primer lugar quiero agradecer a
mis padres; Valeria Meyer Lafertte y Jaime Concha Neupert, por su categrico apoyo,
paciencia y amor durante toda mi etapa universitaria. A mis hermanos, a los cuales
amo, y que me han respaldado y tolerado a lo largo de mi vida. A mi polola y amigos
por su respaldo, compaa y cario.
Quiero dar un especial agradecimiento a mi profesora patrocinante Renate Schbitz,
quien sin lugar a dudas me brindo la posibilidad de realizar este trabajo entregndome
su ayuda, confianza, dedicacin y paciencia. Adems quiero dar las gracias a mis
profesores informantes Sra. Carmen Brito Contreras y el Sr. Kong Shun Ah-Hen, por el
apoyo acadmico.
No puedo dejar de expresar mi gratitud para con el personal de los laboratorios de
Fitopatologa y Bacteriologa del Instituto de Produccin y Sanidad Vegetal y el de
Microbiologa del Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, as como con mis
compaeros al momento de trabajar en este estudio y mis compaeros de carrera.
Por ltimo agradecer a Salmones Multiexport por facilitar el material fundamental para
el desarrollo de este estudio.
A todos...Gracias de corazn.
NDICE DE MATERIAS
Captulo
Pgina
INTRODUCCIN
REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1
Importancia de las bacterias cido lcticas en el control

de patgenos en alimentos
2.1.1
Tipos de bacterias acido lcticas estudiadas para el

control de patgenos
2.1.2
Bacterias del gnero Carnobacterium utilizadas en el

control de Listeria monocytogenes u otros patgenos
2.2
Productos orgnicos para el control de patgenos como

Listeria monocytogenes
2.3
Tipos de componentes y elaboracin de pelculas para

envasar alimentos
2.3.1
Estudio de pelculas a base de alginato y protenas
2.3.2
Envases activos con capacidad antimicrobiana
2.3.3
Utilizacin de pelculas para la inhibicin de Listeria

monocytogenes en alimentos
2.3.4
Uso de nisina en envases
MATERIAL Y MTODOS
10
3.1
Cepas bacterianas a encapsular
10
3.2
Propagacin de las cepas lcticas
10
3.3
Centrifugacin y obtencin del pellet celular de cepas BAL
10
3.4
Preparacin de las biopelculas con cepas BAL
11
3.5
Aspersin de las biopelculas con nisina
12
3.6
Inoculacin de salmn ahumado con L. monocytogenes y

envasado con pelculas con cepas BAL
13
3.7
Estudio de viabilidad de cepas lcticas al interior de la

biopelcula
14
3.8
Estudio de la viabilidad de L. monocytogenes en salmn

ahumado envasado con las biopelculas con cepas BAL
15
3.9
Estudio in vitro de la difusin de STB (sustancia tipo

bacteriocina) desde las biopelculas sobre un csped de
L. monocytogenes
15
ii
3.10
Estudio del pH y la actividad de agua (Aw) de las

biopelculas envasadas sobre salmn al vaco
16
3.11
Diseo experimental y anlisis estadstico
17
RESULTADOS Y DISCUSIN
18
4.1
Estudio de la difusin in vitro de la STB desde las

biopelculas sobre un csped de L. monocytogenes
18
4.2
Inhibicin de L. monocytogenes en salmn ahumado, por

efecto de envasado con biopelculas activadas con cepas
BAL
21
4.3
Viabilidad de las cepas lcticas al interior de la biopelcula

utilizada, durante el envasado del salmn ahumado
25
4.4
Valores de pH y Aw de las biopelculas en el tiempo
26
CONCLUSIONES
29
RESUMEN SUMMARY
30
BIBLIOGRAFA
32
ANEXO
39
iii
NDICE DE CUADROS
Cuadro
Pgina
Tratamientos segn los tipos de biopelculas
14
Tratamientos sometidos a determinacin de pH y Aw
16
rea de inhibicin (cm ) de las biopelculas almacenadas

a 4C, sobre un csped de L. monocytogenes Lm 4/00
20
Recuentos de L. monocytogenes sobre salmn ahumado

envasado en biopelculas con cepas lcticas y nisina,
almacenado a 4C
23
Recuentos microbianos de bacterias lcticas en las

biopelculas sobre salmn ahumado envasadas al vaco a
4C.
Valores de los parmetros pH y Aw segn tratamiento
26
26
iv
NDICE DE FIGURAS
Figura
Pgina
Esquema de propagacin de las cepas lcticas
10
Esquema de preparacin del homogeneizado de clulas
11
Esquema de elaboracin de las biopelculas de alginato

con clulas de BAL incorporadas
12
Cmara de flujo laminar vertical marca LABCONCO

Purifier Vertical Clean Bench
13
Envasadora al vaco marca MULTIVAC C100 utilizada

para envasar las muestras
14
Muestra de salmn envasada al vaco, cubierta con la

biopelcula
14
Esquema de preparacin
monocytogenes
Listeria
16
Medidor de Aw marca Lufft GmbH
17
Difusin de las STB desde las biopelculas sobre un

csped de L. monocytogenes, segn tratamiento
19
10
Trozos de biopelculas con halos de inhibicin sobre un

csped de L. monocytogenes, incubacin a 25C por 24h
19
11
Medias de reas de inhibicin de los trozos de

biopelculas,
almacenadas
a
4C,
sobre
L.
monocytogenes
21
12
Recuento de L. monocytogenes en salmn ahumado

envasado en biopelcula con cepas lcticas, almacenado
a 4 C
22
13
Recuentos de L. monocytogenes en salmn ahumado

envasado en biopelculas con distintos tratamientos de
cepas BAL, almacenado a 4C
24
14
Recuento bacterias lcticas en biopelcula almacenadas a

4C, segn tratamiento
25
15
Biopelcula de almidn, alginato y glicerol con cepas BAL

en su interior luego de secado a 25C por 16h
27
de
csped
de
NDICE DE ANEXOS
Anexo
Pgina
Dosificacin aspersores
40
Datos de la difusin de STB de las pelculas en csped de

Listeria monocytogenes in vitro
41
Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza

para los datos de la difusin de STB desde las pelculas
en csped de Listeria monocytogenes in vitro
42
Anlisis de varianza de las reas de inhibicin de difusin

de STB desde las pelculas en csped de Listeria
monocytogenes in vitro
43
Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para

difusin de STB desde pelculas en csped de L.
44
Datos de recuentos de Listeria monocytogenes en salmn

ahumado envasado en biopelcula antagonista al vaco
45

para datos de la viabilidad de Listeria monocytogenes en
salmn ahumado envasado con las pelculas con cepas
BAL
46
Anlisis de varianza para datos de la viabilidad de Listeria

monocytogenes en salmn ahumado envasado con las
pelculas con cepas BAL
47

viabilidad de Listeria monocytogenes en salmn ahumado
envasado con las pelculas con cepas BAL
48
10
Datos de recuentos de bacterias lcticas en biopelcula

envasada sobre salmn ahumado al vaco
49
11

para datos de la viabilidad de cepas lcticas al interior de
la biopelcula envasada sobre salmn ahumado al vaco
50
12
Anlisis de varianza para datos de la viabilidad de cepas

lcticas al interior de la biopelcula envasada sobre
salmn ahumado al vaco
51
13
Grfico de cajas y bigotes de recuentos microbianos de

bacterias lcticas en las biopelculas sobre salmn
ahumado envasado al vaco a 4C
52
14

la viabilidad de cepas lcticas al interior de la biopelcula
envasada sobre salmn ahumado al vaco
53
vi
15
Datos de medicin de pH y Aw en biopelculas
54
16
Anlisis de varianza para pH de la biopelcula segn

tratamiento
55
17
Anlisis de varianza para Aw de la biopelcula segn

tratamiento
56
1. INTRODUCCIN
La mayora de infecciones en humanos se producen por consumo de alimentos

contaminados. Listeriosis es la infeccin que produce la bacteria Listeria
monocytogenes y tiene lugar, generalmente durante el consumo de alimentos que
contienen esta bacteria. Algunos de los alimentos que pueden contenerla, son leche
cruda, queso elaborado con esta leche, carne cruda o mal cocinada, verduras crudas,
embutidos y salmn ahumado. Es por esta razn que resulta de vital importancia su
inhibicin en los denominados productos listos para el consumo (ready to eat foods).
Actualmente las metodologas ms usadas para el control de esta bacteria en
alimentos es mediante tratamientos trmicos, uso de sanitizantes y mediante estrictas
normas de calidad. La problemtica del salmn ahumado es que su procesamiento no
incluye tratamientos trmicos suficientes para eliminar esta bacteria.
El uso de envases en alimentos y el avance en esta materia han permitido a la industria
alimentaria asegurar a sus consumidores la entrega de un producto inocuo, que no sea
afectado en sus atributos sensoriales. Actualmente el desarrollo de envases se enfoca
hacia la elaboracin de sistemas inteligentes y bioactivos que sean capaces de
proteger al producto y adems ser menos contaminante para el medio ambiente. En
esto, las pelculas envolventes han variado y diversificado su funcin de envase. En
primera instancia, la funcin de stos fue restringir la prdida de humedad desde las
frutas hacia el ambiente o disminuir la absorcin de oxigeno por parte de la fruta, para
as disminuir la respiracin de sta. Hoy en da estos envases tienen el potencial de
disminuir la migracin de lpidos, mejorar la textura o proteger la integridad estructural
de los alimentos. Aditivos alimentarios, tales como saborizantes, agentes
antimicrobianos, colores y hasta microorganismos con propiedades antagonistas
pueden ser incorporados en pelculas para envase y as poder ser usados para
controlar la cantidad a liberar sobre un alimento.
Aunque es claro que estos envases tienen un gran potencial para aplicarlos sobre
alimentos, an no son ampliamente utilizados por la industria alimentaria.
Hiptesis:
Las bacterias cido lcticas bioatrapadas juntas con nisina, en una biopelcula en
base a alginato y aplicadas sobre salmn ahumado envasado al vaco, pueden
mantenerse viables y producir de manera efectiva bacteriocina durante un perodo
de 28 das, para ejercer una accin antagonista sobre Listeria monocytogenes.
Objetivo general:
Analizar el efecto de bacterias cido lcticas y nisina, bioatrapadas en una matriz

de alginato, sobre Listeria monocytogenes en salmn ahumado envasado al vaco.
Objetivos especficos:
Disear una biopelcula en base a alginato, almidn y glicerol que permita mantener
viables cepas de bacterias cido lcticas productoras de bacteriocina.
Estudiar el efecto in vitro sobre Listeria monocytogenes, de una combinacin de

dos cepas lcticas atrapadas en una biopelcula de alginato.
Evaluar el efecto antagonista de las cepas lcticas ms nisina, en una biopelcula,

sobre Listeria monocytogenes en salmn ahumado refrigerado.
Evaluar la durabilidad de la biopelcula almacenada a 4C, a travs del recuento de

bacterias lcticas, pH y Aw.
2. REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1
Importancia de las bacterias cido lcticas en el control de patgenos en
alimentos.
Las bacterias cido lcticas (BAL) proporcionan sabor, textura e incrementan el valor
nutricional de los alimentos como es el caso de productos fermentados tales como
yogurt, quesos madurados, productos crnicos y tambin en algunas hortalizas.
Adems, durante la ltima dcada muchas investigaciones han sido publicadas en el
uso de la biopreservacin, incluyendo estudios de la produccin y caracterizacin de
bacteriocinas de distintas BAL, los cuales han demostrado que la produccin de
bacteriocinas por parte de stas, reduce o inhibe el crecimiento de Listeria
monocytogenes en productos crnicos. (HOLZAPFEL et al., 1995; SCHILLINGER et
al., 1996; STILES, 1996; HUGAS, 1998; ENNAHAR et al., 1999; LCKE, 2000;
BUDDE, et al. 2003; JACOBSEN et al., 2003).
La actividad antimicrobiana de las bacteriocinas representa un gran potencial para la
industria alimentaria, ya que se pueden utilizar como conservadores biolgicos puros,
que en un momento dado podran reemplazar a los conservadores qumicos, esto
porque tienen la ventaja de ser protenas que al biodegradarse no forman compuestos
secundarios. Existen numerosas bacteriocinas producidas por las BAL y cada una tiene
espectros de inhibicin particulares. Esta caracterstica podra ser aprovechada en la
industria de los alimentos. Algunas bacteriocinas se podran utilizar en procesos que
requieren la inhibicin del crecimiento de bacterias indeseables especficas
estrechamente relacionadas al productor de la bacteriocina, y en otros casos se
podran aplicar para inhibir el crecimiento de microorganismos degradadores de
alimentos o de patgenos como estafilococos y/o listerias, respectivamente
(GONZLEZ-MARTNEZ et al., 2003).
Las bacterias cido lcticas adems de producir una cada en los niveles de pH,
favorecen la preservacin de alimentos mediante la produccin de sustancias
inhibidoras ms all de los cidos lctico, actico, alcohol y dixido de carbono,
incluyendo etanol, reuterina, dipptidos cclicos e hidroxicidos de cadena corta,
diacetil, perxido de hidrgeno, benzoato y antibiticos, adems de las ya
mencionadas bacteriocinas (GIBBS, 1987; KLAENHAMMER, 1988; DAESCHEL, 1989;
CAPLICE y FITZGERALD, 1999).
Tambin cabe tener en cuenta que algunos de estos microorganismos resultan
beneficiosos al inhibir el crecimiento de patgenos por el simple hecho de consumir los
recursos que stos necesitan para sobrevivir y multiplicarse. Las industrias de
alimentos que deseen prescindir del uso de conservantes para poder catalogar sus
productos como naturales, pueden utilizar bacterias acido lcticas, las cuales son
capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos indeseables a travs de sus
metabolitos (INDUSTRIA ALIMENTICIA, 2006). Tanto las BAL como algunos de sus
metabolitos desempean un papel importante en este fenmeno y presentan la ventaja
de ser reconocidos como ingredientes seguros (GRAS, generally recognized as safe,
sus siglas en ingls) por las entidades regulatorias de alimentos de Estados Unidos
(FDA), la Unin Europea y nuestro pas (MANZANARES, 1997; SILVA et al., 2002), sin
embargo, nisina es la nica bacteriocina incluida entre estos (CALO-MATA et al.,
2008).
2.1.1 Tipos de bacterias cido lcticas estudiadas para el control de patgenos.
Los gneros que caracterizan a las bacterias cido lcticas son Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium,
Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus y Weissella. Es este ltimo
gnero uno de los ms estudiados en la inhibicin de L. monocytogenes, siendo un
ejemplo de esto, el estudio realizado en GHALFI et al. (2006), donde se midi la
actividad antagonista contra el patgeno, por parte de la bacteriocina de Lactobacillus
curvatus en salmn ahumado almacenado a 4C. El objetivo del estudio fue evaluar y
comparar la efectividad de cuatro distintas aplicaciones de la bacteria y su bacteriocina
sobre la superficie del salmn, las cuales fueron:
rociar en forma spray las bacteriocinas parcialmente purificada

asperjar en forma spray un cultivo activo de bacterias productoras de
bacteriocinas
Rociar en forma spray las bacteriocinas absorbidas de las clulas productoras
Envasar en un film plstico revestido con bacteriocinas.
GHALFI et al. (2006), concluyeron que las bacteriocinas producidas por L. curvatus
eran capaces de inactivar a L. monocytogenes en el salmn ahumado congelado. La
inmovilizacin de la bacteriocina en el envase plstico o el uso de las clulas
productoras de la bacteriocina, proporcionaron una buena alternativa de proteccin y
prevencin por ms de 22 das de almacenamiento. Sin embargo, el uso de las
bacteriocina absorbidas de las clulas tuvo los mejores resultados logrando una
inhibicin ms acelerada y definitiva del patgeno, pero hay que tener en cuenta que
actualmente no es legal el uso de stas por si solas. Segn el estudio de KATIKOU et
al. (2005), Lactobacillus sakei es ms efectivo sobre trozos de carne de vacuno
envasados al vaco y almacenados, en comparacin con el resto de grupos de
microorganismos probados en sus experimentos, ya que L. sakei obtuvo recuentos
microbianos menores, atribuyndose este efecto al espectro ms amplio de inhibicin
de sta.
En otros estudios sobre bacterias cido lcticas para ser utilizadas como
biopreservantes, se aplic Leuconostoc carnosum en productos crnicos cocinados.
Segn JACOBSEN et al. (2003), se concluy que el mtodo ms eficiente para inhibir
Listeria en carne trozada envasada fue utilizando las clulas de L. carnosum
productoras de bacteriocinas. El mtodo usado que dio la reduccin ms alta de L.
monocytogenes fue utilizando inyectores para asperjar el cultivo protector en todas las
superficies de cada rebanada de carne. En las muestras controles, sin el cultivo se
observ un crecimiento de L. monocytogenes de 107 UFC/g, mientras que con el cultivo
por inyectores nunca super 10 UFC/g, durante 4 semanas de almacenamiento a 10C.
2.1.2 Bacterias del gnero Carnobacterium utilizadas en el control de Listeria

monocytogenes u otros patgenos. BRILLET et al. (2004), desarrollaron un
experimento con C. divergens, y dos cepas de C. piscicola para evaluar su actividad
sobre L. monocytogenes como preservantes alimentarios naturales sobre salmn
ahumado en fro almacenado a 4C. C. divergens demostr un mayor efecto inhibitorio,
pero C. piscicola tuvo tambin una capacidad inhibitoria, lo cual, segn los autores, las
hacen cepas promisorias en el uso como preservantes naturales contra bacterias
patgenas en alimentos.
Carnobacterium es aislado con frecuencia del salmn ahumado congelado durante el
almacenaje, y varios estudios han demostrado que estas bacterias no afectan la
calidad sensorial del producto (PALUDAN-MULLER et al., 1998; NILSSON et al., 1999
y STOHR et al., 2001). Segn los estudios realizado por VELZQUEZ (2006), la cepa
C. piscicola L103 present un efecto bacteriosttico sobre el crecimiento de L.
monocytogenes Lm4/00 a 2,0 C y a 4,6 C en salmn ahumado en fro envasado al
vaco. Adems, la calidad sensorial medida por el olor, firmeza y aceptacin general de
los filetes de salmn ahumado en fro, no se vio afectada negativamente por la
inoculacin con C. piscicola, durante 21 das de almacenamiento, a 2,0 C y a 4,6 C.
En algunos estudios, las bacterias lcticas han sido caracterizadas para obtener
mejores y ms rpidas tasas de crecimiento a temperaturas de refrigeracin y as
poder superar el crecimiento de L. monocytogenes, ya sea por el agotamiento de
nutrientes o aumento de la produccin de bacteriocinas. BUCHANAN y BAGI (1997),
sugieren que la inhibicin de L. monocytogenes por 2 cepas C. piscicola productoras
de bacteriocinas, con accin combinada, en un medio infusin de cerebro y sangre, se
deba al agotamiento de nutrientes en lugar de la produccin de bacteriocinas, ya que
C. piscicola es un microorganismo de rpido crecimiento y que puede producir
insuficiencia del nutriente esencial para el crecimiento de este patgeno. PILET et al.
(1995), informan una disminucin de concentracin de bacteriocinas durante la fase
estacionaria de crecimiento de C. divergens y C. piscicola en estudios de produccin
en caldo MRS. Estos autores atribuyen este fenmeno a una posible actividad
proteoltica de estas cepas.
En mayo de 2005 la cepa de la bacteria productora de bacteriocina C. malatromaticum
(C. piscicola), CB1, fue considerada por la FDA como GRAS y como inhibitoria de L.
monocytogenes en productos crnicos listos para el consumo (Noticia Nro. GRN
000159) (CALO-MATA et al., 2008).
2.2
Productos orgnicos para el control de patgenos como Listeria
monocytogenes.
La eficacia de los antimicrobianos alimentarios depende de muchos factores entre los
que se incluyen: el pH, capacidad amortiguadora del alimento, tiempo y temperatura de
almacenamiento del alimento. Segn RAYBAUDI-MASSILIA et al. (2006), el pH es el
factor que ms influye en la eficacia de la mayora de los agentes antimicrobianos para
alimentos. Muchas sustancias antimicrobianas aadidas a los alimentos corresponden
a cidos dbiles que son ms eficaces en forma no disociada. Esto es debido a que los
cidos dbiles son capaces de penetrar en la membrana citoplasmtica de los
microorganismos con mayor facilidad en forma protonada. En consecuencia, el valor de
pKa de estos compuestos es importante en la seleccin de sustancias especficas para
su accin conservante en alimentos. Un ejemplo de este efecto, es el caso de L. sakei

que segn KATIKOU et al. (2005), fue ms eficiente que L. curvatus en la produccin
de cidos orgnicos, esto segn los valores de pH obtenidos en sus estudios, lo cual
probablemente contribuy a su mejor funcionamiento como cultivo protector. El uso de
cidos orgnicos se restringe generalmente a alimentos con pH menor de 5,5, debido a
que la mayor parte de los cidos orgnicos tienen pKas de pH 3,0 a 5,0 (DAVIDSON,
2001).
2.3
Tipos de componentes y elaboracin de pelculas para envasar alimentos.
KROCHTA et al. (1994), clasifican los tipos de pelculas segn componentes y pueden
ser divididas en tres categoras: hidrocoloides, lpidos y compuestas.
Entre los hidrocoloides se encuentran protenas, derivados de celulosa, alginatos,
pectinas, almidones y otros polisacridos. Estos pueden ser usados en aplicaciones
donde el control de la migracin del vapor de agua no es un objetivo, pero s proveen
de una buena barrera para oxgeno, dixido de carbono y lpidos. Tienen propiedades
mecnicas que permiten proteger alimentos con estructuras frgiles. En el caso de
alimentos que requieren de una coccin previa al consumo, cuando son sometidos a
temperaturas altas, la pelcula se disuelve e idealmente no se alteran las propiedades
sensoriales del alimento.
Entre los lpidos se incluyen ceras, acilglicridos y cidos grasos. Las pelculas de este
tipo son usadas a menudo como barreras para el vapor de agua como es el caso del
uso de ceras en frutas y vegetales para retardar la respiracin y disminuir la prdida de
humedad.
Las pelculas compuestas pueden ser de doble capa, en las cuales una capa es un
hidrocoloide y la otra un lpido, o como un conglomerado en donde ambos se
encuentran intercalados en toda la pelcula. Esta combinacin potencia a la pelcula
mezclando las propiedades de envase de ambos componentes.
Se han desarrollado muchas tcnicas para la formacin de las pelculas de forma
directa en la superficie de alimentos o por separado. La coacervacin implica la
separacin de un material de revestimiento polimrico de una solucin mediante el
calentamiento, alteracin de pH, adicin de solventes o alterando el cambio en el
polmero involucrado. Esta tcnica es ampliamente usada para la encapsulacin por la
industria farmacutica. Para la aplicacin de las pelculas se pueden usar
procedimientos tales como inmersin, aspersin o formacin por separado de la
biopelcula. Cuando se combinan lpidos, protenas y polisacridos que pueden
interactuar fsica y/o qumicamente, se pueden obtener recubrimientos con mejores
propiedades. Sin embargo, la compatibilidad de los componentes es un punto
importante a considerar cuando se trata de una mezcla de biopolmeros, ya que se
puede alterar drsticamente el funcionamiento de los compuestos del recubrimiento
(DIAB et al., 2001).
Los recubrimientos elaborados a partir de polmeros naturales, tales como los
polisacridos (almidn y derivados de la celulosa, alginatos, pectinas, gelano,
carragenano, etc.), as como aquellos a base de protenas, muestran una baja
resistencia al agua y no poseen buenas propiedades de barrera, como consecuencia
de su naturaleza hidroflica (YANG y PAULSON., 2000). Para mejorar las propiedades

de barrera al vapor de agua de este tipo de recubrimientos se pueden incorporar
lpidos, que emulsificados en la solucin formadora de pelculas o formando una doble
capa sobre el producto, pueden ayudar a prevenir reacciones degradativas del tejido
como consecuencia de la prdida de humedad, as como las reacciones respiratorias
en los tejidos vegetales (GARCA et al., 2000; YANG y PAULSON., 2000 y ROJASGRA et al., 2006).
De esta manera se pueden formular pelculas comestibles combinando las ventajas de
los componentes hidrocoloides y de los componentes lipdicos, estos ltimos como
barrera al vapor de agua y los primeros como barrera selectiva al oxgeno y al dixido
de carbono, adems de proveer una matriz de soporte estructural (KESTER y
FENNEMA, 1986; BALDWIN et al., 1996).
2.3.1 Estudio de pelculas a base de alginato y protenas. Segn RHIM (2004),
debido a sus capacidades coloidales y capacidad de formar geles fuertes o polmeros
insolubles por reaccin con cationes metlicos multivalentes, los biopolmeros de
alginato son altamente apropiados para formar pelculas envasadoras o revestimientos
para alimentos, producindose esa interaccin al momento de formar la biopelcula. Ha
sido estudiada la incorporacin de agentes antioxidantes a pelculas usadas para
envolver frutas mnimamente procesadas (LEE et al., 2003; PREZ-GAGO et al.,
2004). Un ejemplo de esto es la investigacin realizada por ROJAS-GRA et al. (2006)
y TAPIA et al. (2005), que aplicaron revestimientos a base de alginato sobre manzanas
y papayas frescas y rebanadas, comprobando que los envases eran buenos
transportadores de agentes antioxidantes tales como cistena, glutatin y cidos ctrico
y ascrbico. MAIZURA et al. (2007), desarrollaron una pelcula a base de alginato y
almidn sago parcialmente hidrolizado (Metroxylon sagu) con aceite de citronella y
glicerol para estudiar sus propiedades fsicas, mecnicas y antimicrobianas. Los
resultados obtenidos demuestran que esta pelcula es efectiva en la inhibicin del
crecimiento de E.coli O157:H7, siendo mayor este efecto en presencia de glicerol. El
efecto en la plasticidad por parte del glicerol fue evidente y proporciona flexibilidad
como tambin fuerza mecnica a la pelcula.
RODRIGUES y HAN (2000), investigaron los materiales antimicrobianos producidos
por la incorporacin de lisozima, nisina y cido etilendiaminotetractico (EDTA) en
pelculas de protena aislada de suero. Las pelculas con lisozima o nisina fueron
efectivas en la inhibicin de Brochotrix thermosphacta, pero fall en reprimir a Listeria
monocytogenes. La incorporacin de EDTA a las pelculas mejor el efecto inhibitorio
sobre L. monocytogenes pero tuvo un efecto marginal solo sobre E. coli O157:H7. En
el caso de SEACHBOL et al. (2005), uno de los objetivos del estudio fue evaluar el
efecto antimicrobiano de pelculas a base de protena de suero con el sistema
lactoperoxidasa contra Salmonella enterica y E. coli 0157:H7 en medio de cultivo. Las
pelculas inhibieron completamente ambos patgenos cuando las clulas entraron en
contacto con stos, tanto si la inoculacin era sobre un medio de agar antes de colocar
las pelculas, como si est era sobre las pelculas.
2.3.2 Envases activos con capacidad antimicrobiana. En ROJAS y MARTIN
(2006), los agentes antimicrobianos incorporados en recubrimientos comestibles de
alginato-pur de manzana inhibieron efectivamente el crecimiento de L. innocua en
trozos de manzana, reduciendo en algunos casos el nmero de colonias hasta bajo el

lmite de deteccin (2,0 log UFC/g), as como tambin el crecimiento de
microorganismos aerobios psicrfilos, mohos y levaduras durante el almacenamiento.
Sin embargo, su incorporacin dentro de la formulacin caus efectos, en algunos
casos perjudiciales, sobre la vida til de los trozos de manzana recubiertos. La adicin
de vainilla, como agente antimicrobiano, caus menores efectos adversos en la fruta,
manteniendo la textura, el color y la calidad sensorial durante el almacenamiento,
aunque su efecto como barrera a la difusin de los gases fue menor. Por el contrario, el
aceite de hierba de limn, aunque funcion como barrera a los gases, caus un efecto
perjudicial en el color y la textura de los trozos de manzana repercutiendo directamente
en la calidad sensorial de los trozos de fruta. La incorporacin de aceite de organo en
la formulacin tuvo consecuencias negativas desde el punto de vista sensorial. Entre
los compuestos con capacidad antimicrobiana ms utilizados se encuentran los cidos
orgnicos y sus sales (cido srbico, propinico y benzoico), sulfitos, nitritos,
bacteriocinas (nisina y pediocinas), enzimas (lisozimas), entre otros (SUPPAKUL et al.,
2003).
Una de las tendencias ms recientes consiste en la incorporacin de compuestos de
origen natural, tales como el prpolis (KIM et al., 2001) o extractos de plantas tales
como canela, vainillina, clavo de olor, organo, cebolla, ajos, mostaza, semillas de
pomelo, entre otras, los cuales poseen propiedades antimicrobianas (BRODY et al.,
2001; SUPPAKUL et al., 2003). SKANDAMIS y NYCHAS (2000), sealaron que la
efectividad de los aceites esenciales aumenta cuando el pH del alimento es bajo.
RUPASINGHE et al. (2006), incorporaron 12 mM de vainillina dentro de una solucin
conteniendo NatureSealTM con el fin de extender la vida til de rodajas de manzana
conservadas en refrigeracin, observando una reduccin de la carga microbiana del
producto de hasta 66% durante las tres semanas de almacenamiento. Por su parte
LANCIOTTI et al. (1999), indicaron que la adicin de aceites esenciales proveniente de
ctricos a una mezcla de frutas troceadas (manzanas, peras, uvas, melocotn y kiwi)
era capaz de inhibir la proliferacin de microorganismos naturalmente presentes en
dichas frutas.
2.3.3 Utilizacin de pelculas para la inhibicin de Listeria monocytogenes en
alimentos. Un desarrollo comercial interesante son los agentes antimicrobianos a base
de Triclosan tales como Microsan, Sanitized y Ultra-Fresh. VERMEIREN et al.
(2002), reportaron que pelculas de polietileno de baja densidad que contenan 0,5 y
1,0% p/p de triclosan exhibieron actividad antimicrobiana en contra de S. aureus, L.
monocytogenes, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis y B. thermosphacta en un
ensayo de difusin sobre agar. La pelcula con 1,0% p/p de triclosan tuvo un fuerte
efecto antimicrobiano en condiciones simuladas de envasado al vaco in vitro sobre L.
monocytogenes. Sin embargo este no redujo efectivamente la descomposicin de la
bacteria ni el crecimiento del patgeno sobre pechugas de pollo en condiciones de
envasado al vaco y refrigerado a 7C.
Los objetivos en CAGRI et al. (2001), fueron desarrollar una pelcula comestible (pH
5,2) con protena aislada de soya y que contuviera cido p-aminobenzoico o cido
srbico, para inhibir el crecimiento de L. monocytogenes, E. coli O157:H7, y Salmonella
Typhimurium DT104, y evaluar la permeabilidad al vapor, fuerza de tensin y
porcentaje de elongacin al quiebre de la pelcula. La incorporacin de 0,5% a 1,0% de
acido srbico o cido p-aminobenzoico en la pelcula llev a inhibir a los patgenos en

agar tripticasa de soya + 0,6% de extracto de levadura a pH 5,2. La adicin de ambos
aditivos aument la permeabilidad al vapor y el porcentaje de elongacin al quiebre,
pero diminuy fuerza de tensin.
2.3.4 Uso de nisina en envases. COMA et al. (2001), estudiaron las propiedades
antimicrobianas y como barrera contra la humedad de pelculas a base de
hidroxipropilmetilcelulosa y cido graso (30-50 m de espesor) que contenan nisina
como antimicrobiano y probaron su eficacia en alimentos contra Listeria inocua y
Staphylococcus aureus. Se eligi el cido esterico como cido graso por su habilidad
para reducir la tasa de transmisin de vapor de agua. Sin embargo, este afect la
efectividad de la pelcula sobre los patgenos. Esto se explica por la interaccin
electroesttica entre la nisina catinica y el acido esterico aninico.
ESWARANANDAM et al. (2004), demostraron que pelculas comestibles de protena de
soya con cidos orgnicos y nisina poseen actividad antimicrobiana contra L.
monocytogenes, Salmonella gaminara y E. coli O157:H7 con reduccin de 2,8; 6,0 y
2,1 log UFC/ml respectivamente. El desarrollo de la resistencia microbiana en contra de
la actividad de la nisina aument en determinadas condiciones de refrigeracin, cuando
la temperatura de almacenamiento aument por encima de 4C. El estudio realizado
por THEIVENDRAN et al. (2006), demostr que a 4C y 10C la actividad antilistrica
de nisina (10.000 UI) combinada tanto con extracto de t verde como extracto de
semilla de uva, en una pelcula de protena de soya sobre salchicha de pavo, fue
significativamente mayor que la accin de estos 3 aditivos por separado contra L.
monocytogenes. La combinacin reprimi el crecimiento del patgeno
aproximadamente en 2,8 y 2,3 log UFC/ml a 4C y 10C respectivamente al da 28.
10
3. MATERIAL Y MTODO
3.1
Cepas bacterianas a encapsular
Las cepas utilizadas en este estudio corresponden a BAL-B, aislada de salmn
ahumado (Cepario ICYTAL/UACH) y BAL-A, aislada de carne al vaco (SCHBITZ et
al., 1999), como tambin L. monocytogenes Lm4/00, aislada de salmn ahumado
(Cepario ICYTAL/UACH). Estas cepas fueron mantenidas en congelacin a -18C en
Caldo Soya Tripticasa (ST), con glicerol al 1% como crioprotector. Tambin se utiliz
nisina en su presentacin comercial (NISAPLIN, Danisco).
3.2
Propagacin de las cepas lcticas

Para la propagacin de BAL-A y BAL-B, las cepas se inocularon en una
concentracin de 1% en caldo D-MRS (SCHILLINGER et al., 1993), desde el
stock de cepas congeladas e incubadas a 25C por 24h.
A las 24h, ambas cepas se inocularon en forma separada en una concentracin
al 1% en dos matraces con un volumen de 100 mL de caldo D-MRS cada uno,
incubados a 25 2C por 24h, con agitacin a 180 rpm (agitador orbital
Barnstead/Lab Line MaxQ 4000) (LAMA, 2002).
En la FIGURA 1 se presenta un esquema del procedimiento.
FIGURA 1. Esquema de propagacin de las cepas lcticas.

3.3
Centrifugacin y obtencin del pellet celular de cepas BAL
Finalizado el tiempo de cultivo, las cepas se centrifugaron a 7.690 x g (9000 RPM) a
4C durante 15 min (Centrfuga Hettich Universal 320R), para la obtencin del pellet
celular, a partir del cual se prepar el inculo de alta concentracin bacteriana, para la
11
formacin de la biopelcula. Posteriormente se retir el sobrenadante de los tubos y fue

reemplazado por 5 mL de buffer fosfato Na2HPO4 + NaH2PO4 0,05 M pH 7,0. Se realiz
una segunda centrifugacin bajo las mismas condiciones, por 5 min. El sobrenadante
fue reemplazado por 2 ml del mismo buffer, para la resuspensin del pellet. El pellet
resuspendido fue adicionado a 100 mL de caldo D-MRS, para formar el
homogeneizado. En la Figura 2 se esquematiza el resumen de este procedimiento.
FIGURA 2. Esquema de preparacin del homogeneizado de clulas.

3.4
Preparacin de las biopelculas con cepas BAL
Para la preparacin de las biopelculas se utiliz una formulacin que consisti en una
mezcla de alginato (Quimsa) al 2%, almidn soluble (Merck) al 8% y glicerol (Winkler)
al 10%. Las concentraciones citadas corresponden a las finales de la biopelcula.
En la preparacin de la biopelcula, se mezclaron el almidn y alginato en forma de
polvo y posteriormente se agreg el agua destilada, mezclando con agitacin de una
bagueta hasta obtener una mezcla viscosa. Luego se agreg el glicerol y se mezcl
eliminando los grumos. Finalmente se mezcl en un agitador magntico, durante unos
15 min. El proceso de preparacin de las biopelculas se llev a cabo a temperatura
ambiente. La mezcla se esteriliz a 100C durante 5 min. en autoclave (Tempra
Technology, Inc.). A esta base posteriormente, se adicion el caldo D-MRS
conteniendo el pellet de las cepas de BAL-A y BAL-B mezcladas (3.3). Adicionalmente
se elaboraron biopelculas control, sin las cepas BAL. En la FIGURA 3 se presenta el
esquema de la preparacin de las pelculas.
12
FIGURA 3. Esquema de elaboracin de las biopelculas de alginato con clulas de

BAL incorporadas.
Mezclados todos los elementos, se deposit con ayuda de una jeringa previamente
esterilizada una cantidad de 15 ml de la mezcla sobre placas Petri de 15 cm de
dimetro. Para polimerizar el homogeneizado se aplic en cada placa, 20mL de
Gluconato de Calcio (SIGMA ALDRICH) 0.5M previamente esterilizado a 121C por
15min. Se dej actuar por 15min y posteriormente se retir el excedente de la
sustancia coagulante (ALVAREZ, 2007). Las biopelculas sobre placas Petri se secaron
en estufa a 25C durante 16 h, obtenindose un espesor final de 0,19mm, medido con
un pie de metro digital (Mitutoyo).
3.5
Aspersin de las biopelculas con nisina
Para la preparacin de nisina se diluyeron 100mg de Nisaplin (Danisco) en 10 mL de
HCl 0,02N, obteniendo una concentracin de 1,0 x 104 UI/mL con un pH cercano a 2,0.
El pH se ajust a 3,0 con NaOH 0,5N. La solucin se esteriliz por filtracin (filtro de
0,22 m, Millipore, USA) (SCHMIDT, 2007). A partir de 1mL de la solucin madre de
nisina (1,0x104 UI/mL) se diluy en 99mL de agua desionizada estril para lograr
100mL con una concentracin final de 100 UI/mL (CUTTER y SIRAGUSA, 1997). Esta
solucin se asperj en un volumen de 2,5 mL sobre la cara de la biopelcula en
contacto con el salmn, dejando que se absorbiera por 5 min.
13
NOTA: La cantidad aplicada se cuantific asperjando 4 veces sobre una placa Petri de
15cm de dimetro y con la ayuda de una micropipeta (1000L) se midi la cantidad
asperjada en la superficie. Esta cuantificacin se llev a cabo de igual forma para el
aspersor de L. monocytogenes y se realiz en quintuplicado para obtener un valor
promedio equivalente (ANEXO 1).
3.6
Inoculacin de salmn ahumado con L. monocytogenes y envasado con
biopelculas con cepas BAL
Se cortaron trozos de salmn de 4,0 x 4,0 cm los cuales fueron inoculados con una
solucin de L. monocytogenes con una concentracin inicial de 106 UFC/mL. Esta
solucin se obtuvo de la dilucin de 1 mL del cultivo en caldo soya tripticasa (ST), con
18h de incubacin a 25C, en 99 mL de buffer fosfato Na2HPO4 + NaH2PO4 0,05 M, pH
7,0. El inculo se coloc en un frasco estril (Figura A en ANEXO 1) y se asperjaron
0,5 mL a cada cara del trozo de salmn, dejando absorber durante 5 min por lado,
cuidando cubrir la totalidad del rea con la aspersin. El procedimiento se realiz en
una cmara de flujo laminar vertical LABCONCO (FIGURA 4), para evitar la
contaminacin del ambiente. El trabajo se realiz con guantes para la proteccin
personal. Posteriormente los trozos de salmn fueron envueltos en las biopelculas,
segn cada tipo de tratamiento y colocados en bolsas para envasado al vaco. El
envasado se realiz en la mquina envasadora MULTIVAC C100 (FIGURA 5), con un
tiempo de sellado de 1,3 s por cada bolsa y una presin final de sellado de 12 a 16
mbar.
FIGURA 4. Cmara de flujo laminar vertical marca LABCONCO Purifier Vertical

Clean Bench.
14
FIGURA 5. Envasadora al vaco marca MULTIVAC C100 utilizada para envasar las
muestras.
En la FIGURA 6 se aprecia las muestras envasadas. Las muestras fueron incubadas a
4C, y los muestreos a los 0, 7, 14, 21 y 28 das.
FIGURA 6. Muestra de salmn envasada al vaco, cubierta con la biopelcula.

CUADRO 1. Tratamientos segn los tipos de biopelculas
Tratamiento
Tipo de Biopelcula
L. monocytogenes
Biopelcula sin cepas lcticas antagonista
Nisina
Biopelcula asperjada con nisina (100 UI)
Cepas A+B
Biopelcula con cepas lcticas BAL A y BAL B
Cepas A+B+Nisina
Biopelcula con cepas lcticas BAL A y BAL B, asperjada con
nisina (100 UI) en una de las caras
* 3 repeticiones por tratamiento, cada una con 3 observaciones.
3.7
Estudio de viabilidad de cepas lcticas al interior de la biopelcula

La viabilidad se determin mediante la siembra en placa y se aplic solo a dos
tratamientos: BAL A + BAL B y BAL A + BAL B + Nisina.
15
Antes de la homogeneizacin de la biopelcula, se realiz un lavado a los trozos

de 0,1 g en 100 mL de buffer fosfato KH2PO4 (APHA, 1992), por 5 min, en un
agitador Stuart Orbital Shaker SSL1 a 150 RPM, con el objetivo de eliminar
las bacterias propias de la flora del salmn adheridas.
Posteriormente el trozo se deposit en una bolsa de Stomacher (Masticator IUL
Instruments), a la cual se agregaron 10 mL del mismo buffer (dilucin 10-1),
moliendo el trozo en forma manual y posteriormente se homogeneiz en
Stomacher durante 30 min a 250 compresiones por minuto, con el objetivo de
destruir por completo la biopelcula.
Se sembraron 3 diluciones del homogeneizado en placas con agar D-MRS para
ambas cepas, que fueron incubadas a 25 1C por 48h.
Se hicieron recuentos a las biopelculas almacenadas a los 0, 7, 14, 21 y 28
das a 4C.
3.8
Estudio de la viabilidad de L. monocytogenes en salmn ahumado
envasado con las biopelculas con cepas BAL
En el tiempo cero y cada 7 das se realiz el recuento de L. monocytogenes a
los trozos de salmn ahumado, para la evaluar la actividad antagonista de las
cepas BAL sobre Listeria en el salmn, mediante la tcnica de siembra en
placas con agar Oxford (Merck).
Para realizar el recuento se extrajo el trozo de salmn y se deposit en una
bolsa Stomacher, adicionando 90 ml de buffer fosfato KH2PO4 pH 7,0 (dilucin
10-1) (APHA, 1992). El homogeneizado se realiz en equipo Stomacher.
A partir de la dilucin 10-1 se realizaron las diluciones decimales necesarias
para obtener un recuento entre 20 y 200 colonias y la incubacin de las placas
se realiz a 25 1C por 48h.
3.9
Estudio in vitro de la difusin de la STB (sustancia tipo bacteriocina)
desde las biopelculas sobre un csped de L. monocytogenes
En paralelo a las pruebas descritas previamente, se estudi la difusin, para lo
cual slo se utilizaron los tratamientos BAL A + BAL B y de cada cepa por
separado. Las biopelculas utilizadas fueron preparadas segn lo descrito
anteriormente (punto 3.5) y conservadas a 4C en placas Petri (15 cm de
dimetro).
A partir de estas biopelculas almacenadas, se sac con ayuda de un
sacabocados de 8 mm de dimetro, trozos de biopelcula que fueron
sumergidos durante 20 seg en alcohol al 70%, posteriormente en agua
destilada estril por 10 seg, para luego retirar el exceso de agua mediante papel
filtro estril y finalmente depositarlos sobre una placa Petri con agar ST. Este
procedimiento de higienizacin se realiz para eliminar las clulas de la cepa
BAL adheridas a la superficie, las cuales al estar presentes, dificultaran la
interpretacin de los resultados. Se colocaron 4 trozos de biopelcula por placa.
Las placas fueron incubadas a 4C por 3 das para dejar difundir la STB desde
los trozos. Una vez cumplido el tiempo se aplic un csped de L.
monocytogenes sobre el agar.
El csped se prepar con un cultivo de L. monocytogenes Lm4/00, previamente
incubado a 25C por 18h en caldo ST, siendo 100 L de este mezclados con 10
mL de buffer (APHA, 1992), para obtener 700 L y agregarlos a 7mL de agar
16
ST semislido (0.75% agar) y esta mezcla posteriormente se utilice como tapiz

bacteriano sobre la placa con agar ST.
En la FIGURA 7 se ejemplifica la obtencin del csped.
FIGURA 7. Esquema de preparacin de csped de Listeria monocytogenes.
El csped en placa se sec bajo la campana de flujo laminar.

Se aplic una gota de 20L con STB de la cepa BAL A sobre el csped como
control de sensibilidad de L. monocytogenes.
Se realizaron 5 repeticiones por cada tratamiento, los cuales fueron BAL A sola,
BAL B sola, y BAL A + BAL B.
Las placas se incubaron a 25C por 24h.
Para la medicin del los halos de inhibicin, se uso un pie de metro digital
(Mitutoyo), realizando 3 mediciones de dimetro por trozo y obteniendo un
promedio.
3.10 Estudio del pH y la actividad de agua (Aw) de las biopelculas envasadas

sobre salmn al vaco
Se midieron los valores de pH y Aw de las biopelculas sin envasar y sobre
salmn al vaco con sus respectivos tratamientos (CUADRO 2).
CUADRO 2. Tratamientos sometidos a determinacin de pH y Aw.
Serie
Tratamiento
X
Biopelcula (3.5) sin envasar.
J
Salmn cubierto con biopelcula envasado al vaco y almacenado a 4C por
24h.
Y
Salmn cubierto con biopelcula envasado al vaco y almacenado a 4C por 2
semanas.
Para la determinacin de pH se prepar una mezcla de 3g de pelcula con 3mL

de agua desionizada, la cual se homogeneizo en forma manual. Para
17
determinar el valor de pH se utiliz un pHmetro con electrodo (Hanna

Instruments HI9321 PH, USA).
La Aw de las biopelculas se midi con un equipo Lufft GmbH (FIGURA 8).
Previamente se calibr a 20C con una solucin saturada de cloruro de bario
hasta alcanzar un valor de 0,9 y posterior a esto, se depositaron las muestras,
que constaron cada una de 3 trozos de 15mm de dimetro sobre una placa
Petri chica (50mm dimetro) y se dejaron a 20C por 2h hasta que se realiz la
lectura.
FIGURA 8. Medidor de Aw marca Lufft GmbH.
Los valores se obtuvieron en cuadruplicado.
3.11 Diseo experimental y anlisis estadstico

Los diseos experimentales en este estudio correspondieron, para el caso de la
difusin in vitro de STB sobre un csped de L. monocytogenes, de tres tratamientos por
cuatro das y la variable de respuesta fue el rea de inhibicin (cm2). Para la inhibicin
del crecimiento de L. monocytogenes en la superficie de salmn ahumado por parte de
las biopelculas, fueron cuatro tratamientos por cinco das y la variable de respuesta fue
el recuento de L. monocytogenes en el salmn (Log UFC/cm2). Para el desarrollo de
las BAL al interior de las biopelculas, fueron dos tratamientos por cinco das y la
variable de respuesta fue el recuento de BAL en la biopelcula (Log UFC/cm2).
Los datos obtenidos fueron analizados estadsticamente mediante un Anlisis de
Varianza Simple con un nivel de confianza de 95%, previamente analizada la presencia
de una distribucin normal por contraste de curtosis o asimetra, y homogeneidad de
varianza por contraste de Cochran para validar el anlisis. En el caso de existir
diferencias significativas se aplic la prueba comparacin mltiple de Tukey. Se utiliz
el software Statgraphics Plus 5.1 (Statistical Corp.).
18
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
A continuacin se detallan los resultados obtenidos en el estudio, de manera

secuencial, en relacin a los experimentos realizados, desde el estudio de difusin de
STB desde las biopelculas en csped de L. monocytogenes in vitro, la viabilidad de L.
monocytogenes en salmn ahumado envasado con las biopelculas con cepas BAL y
viabilidad de stas al interior de la biopelcula.
Previo a los ensayos se evalu el procedimiento ms adecuado para la elaboracin de

las biopelculas. La investigacin se bas en el estudio de ALVAREZ (2007),
modificando la concentracin final en los componentes de la biopelcula obteniendo la
siguiente formulacin: alginato (2%), almidn (8%), glicerol (10%). Con ello se obtuvo
una biopelcula ms homognea que en el procedimiento anterior y sin grumos,
facilitando su formacin durante el proceso de elaboracin. Tambin se modificaron las
condiciones de esterilizacin de la mezcla pre-homogeneizada (almidn, alginato,
glicerol y agua), de 100C a 10 psi durante 5 min a un tratamiento de 100C a 4,4 psi
por 5 min en autoclave (Tempra Technology, Inc.). De esta forma las propiedades
reolgicas de la mezcla no se vieron afectadas, sobre todo la viscosidad, lo que
simplific la tarea de formar la biopelcula. Finalmente se aument el tiempo de secado
de 12h a 16h, a 25C, lo cual mejor la textura, obtenindose una biopelcula con
menor humedad, con una mayor resistencia a la traccin y una mejor calidad esttica.
Una vez obtenido el protocolo definitivo de elaboracin, se procedi a probar la
efectividad en contra de L. monocytogenes, realizando las pruebas in vitro y sobre
salmn.
4.1
Estudio de difusin in vitro de la STB desde las biopelculas sobre un
csped de L. monocytogenes
Para probar la aptitud antimicrobiana de la biopelcula se realiz el estudio de difusin
de la STB desde sta y se evalu su efecto sobre L. monocytogenes. Para la prueba se
evaluaron los tratamientos de la biopelcula con las cepas BAL-A, BAL-B y BAL A+B.
En la FIGURA 9 se observan las reas de inhibicin para cada tratamiento a lo largo
del tiempo de almacenamiento. Se aprecia claramente una prdida en la efectividad de
inhibicin de L. monocytogenes en el tiempo, sin embargo el efecto inhibitorio se
mantuvo incluso hasta el final de experimento. Ello indica una viabilidad adecuada de
las cepas BAL y por ende la difusin de la STB, a lo largo del tiempo hasta los 20 das.
En la FIGURA 10 se aprecia una placa con trozos de muestras y sus respectivos halos
de inhibicin sobre un csped de L. monocytogenes.
19
rea de Inhibicin (cm^2)
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
0
10
15
20
Das
BAL B
BAL A
BAL A+B
FIGURA 9. Difusin de las STB desde las biopelculas sobre un csped de L.

monocytogenes, segn tratamiento.
FIGURA 10. Trozos de biopelculas con halos de inhibicin sobre un csped de L.

monocytogenes, incubacin a 25C por 24h.
El anlisis estadstico de los datos (ANEXO 2, 3, 4 y 5) arroj que en los tres
tratamientos se inhibi el desarrollo de L. monocytogenes, presentndose diferencias
significativas entre stos en el da 0 y 10 (CUADRO 3).
20
CUADRO 3. rea de inhibicin (cm2) de las biopelculas almacenadas a 4C, sobre un

csped de L. monocytogenes Lm4/00.
Tratamiento
Da 0
Da 5
Da 10
Da 20
4,88
0,12*
Aa**
3,77
0,22
Ba
3,50
0,25
Ca
2,61
0,12 Da
BAL-B
5,67 0,17 Ab
3,82 0,20 Ba 3,66 0,21 Bab 2,52 0,12 Ca
BAL-A
5,54 0,11 Ab
3,95 0,19 Ba 3,84 0,21 Bb 2,63 0,25 Ca
BAL A+B
* Valores corresponden al promedio de 12 mediciones.
** Valores seguidos de letras maysculas distintas representan diferencias estadsticamente
significativas (p<0,05) entre datos de una misma lnea (entre Das) y letras minsculas distintas
representan diferencias estadsticamente significativas (p<0,05), entre datos de una misma
columna (entre Tratamientos).
La disminucin del efecto inhibitorio a lo largo del tiempo, se puede asociar a que las
bacterias, al interior de la biopelcula, entraron a la fase estacionaria de su crecimiento
y por ende la produccin de bacteriocina disminuy. Este resultado es comparable con
lo obtenido por LAMA (2002), donde la produccin de bacteriocina por parte de una
cepa BAL del gnero Carnobacterium, se redujo despus de 38h de incubacin a 25C
en caldo B.M, mientras que la curva de crecimiento de la BAL se encontraba en la fase
estacionaria.
La disminucin en los halos de inhibicin fue significativa para el caso de los
tratamientos BAL-A y BAL A+B entre el da 0 y el da 5, para luego volver a disminuir
significativamente entre el da 10 y el da 20 (CUADRO 3 y FIGURA 9), en cambio para
el tratamiento BAL-B la reduccin observada entre todos los das fue significativa hasta
el fin del tiempo de almacenaje (CUADRO 3 y FIGURA 9). Otros motivos de esta
disminucin en la difusin de bacteriocina en el tiempo, pueden ser la falta de
nutrientes para la BAL al interior de la pelcula, con una menor liberacin de
metabolitos al exterior de la clula, como as tambin la presencia de diferentes sales
de sodio y calcio en la composicin de la pelcula, que segn lo informado en
OKEEFFE e HILL (2000), afectan negativamente la produccin de bacteriocinas por
parte de las BAL. As tambin en el estudio de HIMMELBLOOM et al. (2000), se
encuentra que en presencia de concentraciones de NaCl sobre el 10% se afecta
negativamente a las cepas productoras de bacteriocinas.
Se puede observar que al da cero existieron diferencias significativas por parte de
BAL-B con relacin a los otros dos tratamientos (CUADRO 3). Esta inhibicin inicial
menor podra atribuirse a un menor desarrollo de esta cepa al interior de la biopelcula,
sin embargo, al da 20 los tres tratamientos no presentaron diferencias significativas
entre si. Esto concuerda con lo estudiado por ALVAREZ (2007), quin observ que la
misma cepa BAL-B tuvo el menor efecto en la difusin de STB sobre L. monocytogenes
in vitro a las 72h. Con respecto al mismo autor, cabe destacar que en ese estudio se
realiz la prueba slo hasta las 72h, mientras que en este trabajo se asegur la
difusin de STB por parte de las cepas hasta el da 20.
Entre BAL A y BAL A+B no existieron diferencias significativas a lo largo del tiempo de
almacenamiento. La FIGURA 11 compara las medias y las desviaciones de los
tratamientos, donde se puede apreciar claramente que los tiempos iniciales de cada
tratamiento, presentan la mayor rea de inhibicin, para luego disminuir el efecto en el
tiempo.
21
FIGURA 11. Medias de reas de inhibicin de los trozos de biopelculas,

almacenadas a 4C, sobre L. monocytogenes.
Segn IVANOVA (2002), la inmovilizacin de la BAL Enterococcus faecium A2000 en
matrices de alginato de calcio result en el aument de la produccin de bacteriocinas
por parte de esta cepa, lo que permiti comprobar que la utilizacin de BAL inmersa en
una matriz como biopelcula, resulta ms efectivo que la aplicacin directa de stas.
4.2
Inhibicin de L. monocytogenes en salmn ahumado, por efecto de
envasado con biopelculas activadas con cepas BAL
Una vez corroborado el efecto inhibitorio de las biopelculas con cepas BAL in vitro, se
realiz el estudio de la inhibicin de L. monocytogenes en salmn ahumado envasado.
En la FIGURA 12 se presenta el efecto inhibitorio contra L. monocytogenes por parte
de las diferentes cepas y nisina en las biopelculas. Se puede observar en el grfico la
actividad antimicrobiana de los tratamientos en comparacin con el control positivo
(Listeria+), siendo los tratamientos A+B y A+B+N los que presentaron un efecto
bacteriosttico sobre L. monocytogenes. El uso de nisina (100 UI) mostr una
reduccin inicial, pero el patgeno a lo largo del tiempo de almacenamiento se volvi
resistente a su accin y comenz nuevamente a multiplicarse. Esto concuerda con el
estudio de GROWER et al. (2004), quienes sealan que, para maximizar la efectividad
del film con nisina sobre L. monocytogenes, la nisina debe liberarse y permanecer
efectiva por el perodo de tiempo completo, porque cualquier lapso sin liberacin puede
permitir al patgeno crecer y volverse resistente. En el mismo estudio se trabaj con
22
concentraciones mayores de nisina (nunca sobrepasando el nivel aceptado por la FDA

en alimentos 10.000 UI/g) y se obtuvo un efecto ms extendido en el tiempo, lo que
indica que a mayores concentraciones de nisina es ms prolongada la inhibicin.
Log (UFC/cm2)
La aplicacin de nisina por aspersin concuerda con la metodologa de MAURIELLO et

al. (2004), donde fue utilizada la bacteriocina de Lactobacillus curvatus 32Y sobre una
biopelcula de polietileno, demostrndose su efectividad sobre L. monocytogenes V7
mediante antagonismo sobre agar. As tambin diversos autores reportan acerca de la
efectividad de biopelculas antimicrobianas, activadas por efecto de nisina sola, en
combinacin con otros preservantes o quelantes y utilizando diversos mtodos de
activacin. (SIRAGUSA et al., 1999; SCANNELL et al., 2000; COMA et al., 2001;
CUTTER et al., 2001). El uso de nisina como antagonista en biopelculas a base de
protena y polisacridos es aplicado contra distintos patgenos, por ejemplo en contra
de Salmonella en carne de aves (NATRAJAN y SHELDON, 2000), obtenindose una
buena inhibicin del patgeno.
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
0
14
Das
21
Tratamiento A+B
Tratamiento A+B+N
Tratamiento (+) L.m
Tratamiento Nisina
28
FIGURA 12. Recuento de L. monocytogenes (Log UFC/cm2) en salmn ahumado

envasado en biopelcula con cepas lcticas y nisina, almacenado a 4
C.
El anlisis estadstico de los datos (ANEXO 6, 7, 8 y 9) entreg que los tres
tratamientos antagonistas inhibieron el desarrollo de L. monocytogenes en salmn,
presentando diferencias significativas con el control positivo a lo largo del experimento,
exceptuando el tiempo cero del tratamiento A+B+N. En el CUADRO 4, se aprecia que
L. monocytogenes se desarroll en el control positivo durante los 28 das de
almacenamiento, pero fue inhibida en presencia de las cepas BAL (FIGURA 12). La
inoculacin inicial fue de Log 4,0 UFC/cm2 y el patgeno alcanz recuentos de Log 6,4
UFC/cm2 despus de 28 das a 4 C (CUADRO 4). Este resultado coincide con lo
estudiado por JANES et al. (2002), donde se encontr que a temperatura de
refrigeracin (4C), y a un nivel de inoculacin inicial sobre pollo listo para el consumo
de Log 6,8 UFC/g, L. monocytogenes se desarroll hasta Log 9,6 UFC/g al da 24.
23
CUADRO 4. Recuentos de L. monocytogenes (Log UFC/cm2) sobre salmn ahumado

envasado en biopelculas con cepas lcticas y nisina, almacenado a
4C.
Tratamiento
Da 0
Da 7
Da 14
Da 21
Da 28
3,21 0,03* Aa** 3,02 0,09 Aa 2,94 0,29 Aa
3,09 0,15 Aa
3,35 0,16 Aa
BAL A+B
BAL
3,42 0,16 Aab
3,27 0,18 Aa 3,03 0,37 Aa 3,57 0,39 Aab 2,66 0,36 Bb
A+B+Nisina
3,03 0,09 Aa
3,34 0,02 Aa 3,35 0,26 Aa
4,02 0,02 Bb
5,41 0,01 Cc
Nisina
Control (+)
3,99 0,10 Ab
4,82 0,04 Bb 5,85 0,11 Cb
5,87 0,05 Cc
6,38 0,01 Cd
L.m
Los tratamientos con BAL y nisina presentaron una inhibicin inicial de L.

monocytogenes, lo cual indica que la biopelcula tuvo un efecto antimicrobiano
inmediato. Se pudo apreciar que la nisina (100 UI), inicialmente inhibi de forma ms
efectiva al patgeno, logrando una reduccin de Log 1,0 UFC/cm2, en el caso de los
tratamientos A+B y A+B+N se logr una reduccin de Log 0,8 y 0,6 UFC/cm2
respectivamente. Sin embargo, el anlisis estadstico no arroj diferencias significativas
entre ellos (CUADRO 4). Segn MONTVILLE et al. (1995), el dao que causan las
bajas temperaturas a la pared celular de L. monocytogenes, hacen ms accesible la
membrana citoplasmtica para las molculas de nisina y tambin en este caso para las
bacteriocinas de las cepas BAL, incrementando la habilidad de stas para poder formar
poros en la membrana, lo que da como resultado la muerte del patgeno debido al
agotamiento de la fuerza entre los protones y fuga de iones de la clula, lo que se
demuestra en este experimento con la disminucin de los valores de los recuentos de
L. monocotogenes para los tratamientos con cepas BAL y nisina.
Con posterioridad al da 14, la nisina sola perdi efectividad, observndose diferencias
significativas (p<0,05) en relacin a los das anteriores, por tanto no hay un efecto
bacteriosttico a lo largo del tiempo, debido a la resistencia al efecto inhibitorio que
demostr L. monocytogenes con un aumento en su crecimiento en los das finales del
experimento. Tambin hubo diferencias significativas (p<0,05) al da 28 por parte del
tratamiento nisina con los A+B y A+B+N (CUADRO 4 y FIGURA 12).
Cabe destacar que segn la industria procesadora de salmn, la vida til en
condiciones de refrigeracin del salmn ahumado en fro es de 20 das, al lograr en
este estudio inhibir a L. monocytogenes en un tiempo superior, se logra mayor
proteccin para el consumidor. Otro factor a considerar, fue la baja concentracin de
nisina utilizada (100 UI), para asegurar la viabilidad de las cepas lcticas al interior de
la biopelcula, ya que segn SCHMIDT (2007), se observ que a esa concentracin,
nisina no inhiba el desarrollo de stas cepas.
En el tratamiento de nisina asperjado sobre la biopelcula con cepas BAL tambin se
trabaj con una concentracin de 100 UI, observndose un efecto sinrgico inhibitorio
entre ambos, a lo largo del tiempo. En diversos estudios se han obtenido buenos
24
resultados de sinergia entre nisina y diferentes compuestos orgnicos. Un ejemplo es

el estudio de JANES et al. (2002), donde se informa sobre el efecto sinrgico e
inhibidor de biopelculas a base de protena de maz y propilenglicol, con aditivos como
propionato de calcio, etanol y nisina (1.000 UI), probando que la biopelcula con nisina
y propionato de calcio fue la ms efectiva contra L. monocytogenes, por reprimir su
crecimiento en Log 5,0 UFC/g por 24 das a 8C, adems de reducirla a niveles no
detectables a 4C.
En la FIGURA 13, en el grfico de cajas y bigotes se aprecian las diferencias en la
distribucin de datos entre los 3 tratamientos con las sustancias antimicrobianas y el
control positivo, donde destaca la distancia entre los puntos de este ltimo respecto a
los dems resultados. Se puede apreciar un sector del grfico el cual muestra el efecto
bacteriosttico de algunos tratamientos frente al crecimiento del patgeno, siendo los
tratamientos 14 y 15 (Nisina Tiempo 21 y 28) los que escapan de este sector.
FIGURA 13. Recuentos de L. monocytogenes en salmn ahumado envasado en

biopelculas con distintos tratamientos de cepas BAL, almacenado a
4C.
Al da 28, el tratamiento A+B y A+B+N mostraron diferencias significativas (p<0,05)
entre si, atribuyendo esto al efecto sinrgico entre nisina y las cepas BAL sobre el
patgeno. Cabe sealar que para ese da, el recuento de BAL al interior de las
biopelculas A+B+N, present un aumento en comparacin con las A+B, pero no fue
significativo (FIGURA 14 y CUADRO 5).
25
Para el caso del tratamiento A+B, no existieron diferencias significativas en el tiempo

(CUADRO 4 y FIGURA 12) as como para el tratamiento A+B+N que tambin present
una inhibicin sostenida hasta el da 21, asocindose este efecto al crecimiento de las
cepas lcticas al interior de las biopelculas de ambos tratamiento y que adems no
presentaron diferencias significativas (p<0,05) entre ellos (FIGURA 14 y CUADRO 5).
Este efecto bacteriosttico observado por parte de las cepas Carnobacterium de la
biopelcula sobre L. monocytogenes en el salmn, concuerda con lo observado en
BRILLET (2004), donde 3 diferentes cepas de Carnobacterium demostraron una
actividad inhibitoria sobre 57 diferentes cepas de L. monocytogenes sobre salmn
ahumado.
4.3
Viabilidad de las cepas lcticas al interior de la biopelcula utilizada,
durante el envasado del salmn ahumado
En la FIGURA 14 se presentan los resultados obtenidos de los recuentos de cepas
BAL, destacando inicialmente la capacidad de la biopelcula de mantener las cepas
viables en su interior. Las biopelculas usadas en esta prueba fueron las mismas con
las que se cubrieron los salmones inoculados (Punto 4.2).
Log (UFC/cm2)
9,0
8,5
8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
0
14
21
28
Das
Tratamiento A+B
Tratamiento A+B+N
FIGURA 14. Recuento bacterias lcticas (Log UFC/cm2)

almacenadas a 4C, segn tratamiento
en
biopelcula
El anlisis estadstico de los datos (ANEXO 10, 11, 12, y 14) demostr que las BAL de
las biopelculas lograron permanecer viables en el tiempo y que no se presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos, a lo largo del experimento. Para el
tratamiento A+B no existieron diferencias significativas entre los das del experimento
observndose un crecimiento parejo de las cepas (CUADRO 5). Por su parte el
tratamiento A+B+N solo present diferencias significativas (p<0,05) entre los das 0 y 7,
donde se experimento una reduccin microbiana, asociando esto a la accin de la
26
nisina sobre las cepas, y el da 28 donde existi un aumento en el recuento de BAL

ligado a las condiciones favorables para el desarrollo microbiano.
CUADRO 5. Recuentos microbianos de bacterias lcticas (Log UFC/cm2) en las
biopelculas sobre salmn ahumado envasadas al vaco a 4C.
Da 0
Da 7
Da 14
Da 21
Da 28
6,98 0,33* Aa** 7,24 0,41 Aa 7,21 0,06 Aa
7,80 0,12 Aa
7,65 0,07 Aa
BAL A+B
BAL
7,38 0,70 ABa 6,81 0,09 Aa 7,62 0,16 ABa 7,72 0,33 ABa 8,21 0,76 Ba
A+B+Nisina
Tratamiento
En los tratamientos A+B y A+B+N, las BAL se mantuvieron viables y la diferencia inicial
entre ambas no fue significativa. No se observ un efecto negativo de la nisina sobre
las BAL, lo cual indica que sta permiti dar las condiciones, que mantuvieron a las
BAL viables en su interior, logrando as una vida til superior a 28 das.
Para el da 28 del tratamiento A+B+N hubo un aumento no significativo de los
recuentos BAL (CUADRO 5 y FIGURA 14), al mismo tiempo existi reduccin
significativa de L. monocytogenes (CUADRO 4 y FIGURA 12), lo cual podra deberse a
la permeabilidad de nutrientes y humedad desde el salmn al interior de la biopelcula,
sumado al efecto de la aspersin de nisina diluida en agua desionizada sobre las
biopelculas.
En el ANEXO 13, un grfico de cajas y bigotes compara las medias y sus desviaciones
segn tratamientos. Se puede apreciar el ajuste de valores en torno a un rango no muy
amplio, lo que demuestra que no existen grandes diferencias entre ambos tratamientos
y por ende ambos lograron buenas condiciones para el desarrollo microbiano al interior
de las biopelculas.
4.4
Valores de pH y Aw de las biopelculas en el tiempo
Con la finalidad de producir biopelculas con caractersticas estandarizadas se obtuvo
informacin de algunos de sus parmetros fisicoqumicos, como los valores de pH y Aw
(actividad de agua). En el CUADRO 6 se presentan los resultados obtenidos. El
anlisis estadstico de los datos (ANEXO 15, 16 y 17) entreg diferencias significativas
entre los tratamientos para pH, pero no para Aw.
CUADRO 6. Valores de los parmetros pH y Aw segn tratamiento.
Tratamiento*
pH
Aw
X
4,36** 0,035 a***
0,9125 0,012 a
J
5,58 0,112 b
0,9250 0,006 a
Y
5,45 0,077 b
0,9275 0,005 a
* X corresponde al tiempo 0 pelcula sin envasar, J corresponde a 1 da de la pelcula envasada
sobre salmn a 4C e Y corresponde a 2 semanas de la pelcula envasada sobre salmn a 4C.
** Valores corresponden al promedio de 4 mediciones.
*** Valores seguidos de letras minsculas distintas representan diferencias estadsticamente
significativas (p<0,05), entre datos de una misma columna.
27
Al comparar el pH de las biopelculas entre los tratamientos se observa que aumenta

significativamente al tomar contacto con el salmn por un da, para mantenerse sin
diferencias significativas hasta dos semanas despus (CUADRO 6). Esto se explica por
el pH tpico del salmn ahumado, cercano a pH 6,0 (BRILLET et al., 2004), condicin
que favorece el desarrollo de la flora del salmn y de las cepas BAL en las biopelculas.
En cuanto a la Aw se puede resaltar que se mantuvo alta en la biopelcula, lo que
favorece las condiciones de desarrollo microbiano al interior de sta. Segn PALUDANMULLER et al. (1998), dentro de las condiciones de preservacin normalmente usadas
en salmn ahumado, el Aw se encuentra en el rango de 0,93 a 0,96. Se puede apreciar
que existe un aumento mnimo de Aw en la biopelcula al momento de tomar contacto
con el salmn, pero que result no ser significativo (p>0,05) (CUADRO 6). La Aw se
redujo hasta 0,9125 en el secado, evitando as la caracterstica propia del almidn en
biopelculas, de absorber agua desde el salmn (ROMERO-BASTIDA y BELLOPREZ, 2006). Esta absorcin de agua puede afectar la textura del salmn
produciendo efectos indeseados como prdida de firmeza que afectaran la calidad
organolptica.
FIGURA 15. Biopelcula de almidn, alginato y glicerol con cepas BAL en su

interior luego de secado a 25C por 16h.
El aspecto de las pelculas se puede apreciar en la FIGURA 15, caracterizado por su
color blanquecino, espesor (0,19 mm) mayor que el de una hoja de papel o un envase
plstico, de textura blanda perceptible por el tacto, pero no delicada ni fcil de romper,
hmeda al tacto, muy adhesiva al momento de tomar contacto con el salmn, lo que
ayud en el envasado al vaco. Mientras mayor fue el tiempo de conservacin (4C) en
contacto con el salmn, menos firme fue su textura y por ende al abrir el sello plstico
de vaco, la biopelcula tendi a romperse al tener contacto con las manos. A pesar de
su color blanco, no opac el color propio del salmn ahumado al momento de ser
envasado al vaco. Es importante resaltar que en el estudio de WINKLER (2008), con
un grupo de panelistas entrenados, se concluy que las biopelculas con las mismas
cepas BAL-A y BAL-B utilizadas en esta investigacin, no afectaron la calidad sensorial
del salmn ahumado que cubrieron.
28
Luego de este estudio, se puede mencionar que la aplicacin industrial de este tipo de
envase es factible y asegurara tanto al productor como al consumidor, un producto de
buena calidad gracias a la utilizacin biotecnologa y no de compuestos qumicos
contaminates, que pueden ser dainos para la salud humana y el medio ambiente.
29
5. CONCLUSIONES
Se estableci un protocolo de elaboracin de la biopelcula en base a alginato y

almidn, logrando estandarizar su produccin.
Se obtuvo un efecto inhibitorio in vitro sobre L. monocytogenes mediante una

combinacin de dos cepas lcticas atrapadas en una biopelcula durante 20
das, por la produccin y difusin de una STB.
Las BAL al interior de las biopelculas que cubrieron el salmn envasado al

vaco, se mantuvieron viables durante 28 das a 4C, sin reducciones
significativas en los recuentos (p>0,05).
Se mantuvo una accin antagonista durante 28 das en refrigeracin, sobre

L. monocytogenes inoculada sobre salmn ahumado envasado al vaco,
utilizando BAL bioatrapadas en una matriz de alginato y nisina.
El pH de la pelcula vari significativamente al tomar contacto con el salmn

(aument de 4,36 a 5,58), mientras que la Aw no present variaciones
significativas (de 0,9125 a 0,9275) durante dos semanas de envasado sobre
salmn ahumado.
30
6. RESUMEN
El objetivo general del presente trabajo fue, analizar el efecto de dos cepas de
bacterias cido lcticas (BAL) ms nisina, bioatrapadas en una matriz de
alginato, sobre Listeria monocytogenes en salmn ahumado envasado al vaco. Se
elabor una biopelcula con las cepas lcticas BAL-A y BAL-B incorporadas en la
matriz y/o asperjadas con nisina (Nisaplin, Danisco 100 UI/mL), dependiendo del
tratamiento. Se control la viabilidad de las BAL en las biopelculas y su actividad
mediante la tcnica de antagonismo en placa. Para comprobar la efectividad de las
biopelculas sobre salmn, las cuales cubrieron trozos de 4,0 x 4,0cm, inoculados con
Listeria monocytogenes 4/00, en una concentracin final de 106 UFC/cm2, se
envasaron al vaco y se almacenaron a 4,0 C. Los recuentos para comprobar la
inhibicin de L. monocytogenes se realizaron a los das 0, 7, 14, 21 y 28, sobre agar
OXA.
Los resultados mostraron que en la prueba in vitro las dos cepas BAL y su combinacin
presentaron una efectiva difusin de la sustancia tipo bacteriocina (STB) inhibiendo a L.
monocytogenes en el csped despus de 20 das de almacenamiento, obtenindose
reas de inhibicin de hasta 5,7 cm2, con trozos de 8 mm de dimetro. Sobre el
salmn, el patgeno fue inmediatamente inhibido, al tomar contacto con las pelculas
con la combinacin de las cepas ms nisina. Despus de 28 das de almacenamiento
los trozos de salmn envasados en la pelcula slo con nisina, presentaron un
desarrollo del patgeno de 5,4 Log UFC/cm2. Por su parte el tratamiento con ambas
cepas lcticas tuvo un efecto bacteriosttico sobre el patgeno, impidiendo su
desarrollo en el tiempo. El tratamiento que mezcl ambas cepas con nisina asperjada
inhibi de mejor forma al patgeno, obteniendo un recuento de Log 2,7 UFC/cm2 para
el da 28, demostrando que existi un efecto sinrgico entre ambos. Los resultados
permiten concluir que el uso de stas biopelculas sobre salmn inhiben a L.
monocytogenes incluso por 28 das en condiciones de refrigeracin.
31
SUMMARY
The overall objective of this study was to asses the effect of two strains of lactic acid
bacteria (LAB) with nisin, trapped into an alginate matrix, against Listeria
monocytogenes on vacuum packaged smoked salmon. A film was formulated
containing the strains LAB-A and LAB-B, with or without sprayed nisin (Nisaplin,
Danisco) (100 UI/mL). The viability of the LAB in the films and their antagonistic activity
was controlled by the plate technique. To check the activity from the films on salmon,
pieces of 4,0 x 4,0cm inoculated with L. monocytogenes 4/00 in a final concentration of
106 UFC/cm2, were covered with the film containing LAB strain and storage was at 4C.
L. monocytogenes counts were done at 0, 7, 14, 21 and 28 days, on OXA agar to check
for the inhibition of the pathogen.
The results showed that the in vitro study of both strains separately and their
combination, presented an effective diffusion of the bacteriocin-like substance (BLS)
inhibiting L. monocytogenes even after 20 days of production of the films, with inhibition
zones of 5,7 cm2 (film pieces of 8 mm diameter). On salmon, the pathogen was
inhibited inmediately, when the films came in contact with the LAB and nisin containing
film. After 28 days of storage the salmon pieces packaged with the film with nisin alone,
showed a growth of L. monocytogenes of 5,4 Log UFC/cm2. On the other hand the
treatment with both LAB strains had a bacteriostatic effect over the pathogen,
preventing its growth along the time. The treatment which combined both strains and
nisin, had a better inhibiting effect, with counts of Log 2,7 UFC/cm2 on day 28, proving
an synergic effect between both. The results obtained demonstrate that the use of these
films on salmon, inhibit L. monocytogenes even after 28 days of storage under
refrigerated conditions.
32
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39
8. ANEXO
40
ANEXO 1
Dosificacin aspersores
Aspersor
Listeria
Desv.
monocytogenes Rep1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Rep 5 Estndar Promedio
Cantidad (L)
500
540
500
480
480
24,49
500
Figura A
Desv.
Aspersor Nisina Rep1 Rep 2 Rep 3 Rep 4 Rep 5 Estndar Promedio
Cantidad (L)
2550 2480
2560
2460
2450
51,47
2500
Figura B
41
ANEXO 2
Datos de la difusin de STB de las pelculas en csped de Listeria
Resumen resultados por tratamiento
BAL B
Tiempo (das) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12
0
5
10
20
4,72 5,06 4,78 4,83 4,86 4,79 4,89 5,00 5,03 5,07 4,78 4,84
4,13 3,72 3,92 3,28 3,64 3,99 3,89 3,66 3,92 3,73 3,58 3,78
3,22 3,31 3,60 4,07 3,18 3,32 3,69 3,51 3,66 3,63 3,42 3,46
2,54 2,54 2,65 2,78 2,53 2,51 2,54 2,67 2,62 2,76 2,81 2,47
Promedio Desv.
2
(cm ) estndar
4,89
3,77
3,51
2,62
0,12
0,22
0,25
0,12
BAL A
0
5
10
20
5,57 5,36 6,10 5,59 5,71 5,66 5,70 5,66 5,64 5,72 5,61 5,75
4,06 3,99 4,11 3,74 3,72 3,98 3,54 3,57 3,90 3,77 3,91 3,57
3,66 3,72 3,48 3,87 3,42 4,00 3,39 3,42 4,00 3,66 3,66 3,66
2,56 2,56 2,60 2,58 2,67 2,37 2,56 2,35 2,33 2,68 2,56 2,45
Promedio Desv.
2
(cm ) Estndar
5,67
3,82
3,66
2,52
0,17
0,20
0,21
0,12
BAL A+B
0
5
10
20
5,37 5,73 5,66 5,62 5,70 5,54 5,45 5,53 5,55 5,45 5,41 5,58
4,01 4,07 4,12 4,15 3,91 3,65 3,82 3,65 3,92 4,16 4,18 3,87
4,17 3,66 4,25 3,53 3,69 3,74 4,03 3,75 3,78 3,84 3,84 3,84
2,23 2,62 2,20 2,87 2,94 2,79 2,79 2,74 2,34 2,75 2,59 2,80
Promedio Desv.
(cm2) Estndar
5,55
3,96
3,84
2,64
0,11
0,19
0,21
0,25
42
ANEXO 3
Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza para los datos de la
difusin de STB desde las pelculas en csped de Listeria monocytogenes in
vitro
A) Test para la Normalidad
Contraste de Asimetra
Puntuacin Z para asimetra = 1,39365
P-valor = 0,163421
Como tanto el valor Z para asimetra como su p-valor se encuentran dentro del
intervalo [-2,2], se puede aceptar que los datos presentan una distribucin normal. En
el grfico se aprecia la distribucin normal de los datos.
porcentaje acumulado
Grfico de Probabilidad Normal

99,9
99
95
80
50
20
5
1
0,1
2,2
3,2
4,2
5,2
6,2
Area de Halo de inhibicin _cm2_

Distribucin de datos rea de Halo de inhibicin (cm2) alrededor de la recta de
probabilidad normal.
B) Homogeneidad de Varianza
Contraste de Varianza
Contraste C de Cochran: 0,148766
P-valor = 0,51237
Como P-valor > 0.05, se acepta la hiptesis de que las varianzas presentan igualdad
para un nivel de confianza del 95,0%.
43
ANEXO 4
Anlisis de varianza de las reas de inhibicin de difusin de STB desde las
pelculas en csped de Listeria monocytogenes in vitro
Tabla ANOVA para rea de Halo de inhibicin _cm2_ segn Tratamientos 2
Anlisis de la Varianza
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Sumas de cuad. Gl Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos
146,404
11
13,3095
378,69
0,0000
Intra grupos
4,63928
132
0,0351461
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
151,044
143
Mtodo de Tukey para diferencias significativas
Contraste Mltiple de Rango para rea de Halo de inhibicin _cm2_ segn
Tratamientos 2
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Mtodo: 95,0 porcentaje HSD de Tukey
Tratamientos 2
Frec.
Media
Grupos homogneos
-----------------------------------------------------------------------------------------------------8
12
2,5225
X
4
12
2,61833
X
12
12
2,63833
X
3
12
3,50583
X
7
12
3,66167
XX
2
12
3,77
XX
6
12
3,82167
XX
11
12
3,84333
XX
10
12
3,95917
X
1
12
4,8875
X
9
12
5,54917
X
5
12
5,6725
X
44
ANEXO 5
Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para difusin de STB desde
pelculas en csped de Listeria monocytogenes in vitro
*
ns
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
2
*
*
*
*
ns
ns
*
*
ns
ns
*
3
*
*
*
*
*
ns
*
*
*
*
*
4
*
*
*
*
*
*
ns
*
*
*
ns
5
*
*
*
*
*
*
*
ns
*
*
*
6
*
ns
*
*
*
ns
*
*
ns
ns
*
7
*
ns
ns
*
*
ns
*
*
*
ns
*
8
*
*
*
ns
*
*
*
*
*
*
ns
9
*
*
*
*
ns
*
*
*
*
*
*
indica Diferencia Significativa

indica No Diferencia Significativa
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Significado
BAL B Tpo 0
BAL B Tpo 5
BAL B Tpo 10
BAL B Tpo 20
BAL A Tpo 0
BAL A Tpo 5
BAL A Tpo 10
BAL A Tpo 20
BAL A+B Tpo 0
BAL A+B Tpo 5
BAL A+B Tpo 10
BAL A+B Tpo 20
10
*
ns
*
*
*
ns
*
*
*
ns
*
11
*
ns
*
*
*
ns
ns
*
*
ns
*
12
*
*
*
ns
*
*
*
ns
*
*
*
-
45
ANEXO 6
Datos de recuentos de Listeria monocytogenes en salmn ahumado envasado en
biopelcula antagonista al vaco
A+B
Tiempo
(das)
0
7
14
21
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
1,6E+03
9,4E+02
4,1E+02
1,8E+03
1,5E+03
LOG
Rep. 1
3,20
2,97
2,61
3,26
3,17
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
1,8E+03
1,3E+03
1,4E+03
1,1E+03
2,7E+03
LOG
Rep. 2
3,25
3,13
3,14
3,04
3,42
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
1,5E+03
9,1E+02
1,2E+03
9,4E+02
2,9E+03
LOG
Rep. 3
3,19
2,96
3,09
2,97
3,47
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
1,6E+03
1,1E+03
1,0E+03
1,3E+03
2,4E+03
3,21
3,02
2,94
3,09
3,35
Desv.
estndar
0,03
0,09
0,29
0,15
0,16
A+B+N
Tiempo
(das)
0
7
14
22
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
3,6E+03
1,2E+03
1,7E+03
2,0E+03
8,4E+02
LOG
Rep. 1
3,55
3,06
3,22
3,30
2,93
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
LOG
Rep. 2
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
3,1E+03
2,3E+03
1,8E+03
2,5E+03
1,8E+02
3,49
3,36
3,27
3,40
2,25
1,8E+03
2,5E+03
4,1E+02
1,1E+04
6,3E+02
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
LOG
Rep. 2
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
9,7E+02
2,3E+03
2,2E+03
1,1E+04
2,5E+05
2,99
3,36
3,34
4,04
5,40
9,4E+02
2,2E+03
1,3E+03
1,1E+04
2,6E+05
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
LOG
Rep. 2
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
1,3E+04
6,2E+04
9,4E+05
7,6E+05
2,5E+06
4,10
4,79
5,97
5,88
6,40
8,1E+03
6,3E+04
6,9E+05
6,6E+05
2,4E+06
LOG
Rep. 3
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
3,24
3,39
2,61
4,03
2,80
2,8E+03
2,0E+03
1,3E+03
5,0E+03
5,5E+02
3,43
3,27
3,03
3,58
2,66
LOG
Rep. 3
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
1,1E+03
2,2E+03
2,5E+03
1,1E+04
2,6E+05
3,03
3,34
3,35
4,02
5,41
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
9,9E+03
6,6E+04
7,3E+05
7,5E+05
2,4E+06
3,99
4,82
5,85
5,87
6,38
Desv.
estndar
0,16
0,18
0,37
0,39
0,36
Nisina
Tiempo
(das)
0
7
14
21
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
1,3E+03
2,1E+03
4,1E+03
1,0E+04
2,7E+05
LOG
Rep. 1
3,13
3,33
3,61
4,00
5,43
2,97
3,33
3,10
4,03
5,42
Desv.
estndar
0,09
0,02
0,26
0,02
0,01
L+
Tiempo
(das)
0
7
15
21
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
9,2E+03
7,3E+04
5,6E+05
8,3E+05
2,3E+06
LOG
Rep. 1
3,96
4,87
5,75
5,92
6,37
LOG
Rep. 3
3,91
4,80
5,84
5,82
6,39
Desv.
estndar
0,10
0,04
0,11
0,05
0,01
46
ANEXO 7
Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza para datos de la
viabilidad de Listeria monocytogenes en salmn ahumado envasado con las
pelculas con cepas BAL
Contraste de Curtosis
Puntuacin Z para curtosis = -0,245312
P-valor = 0,80621
Como tanto el valor Z para curtosis como su p-valor se encuentran dentro del intervalo
[-2,2], se puede aceptar que los datos presentan una distribucin normal. En el grfico
se puede apreciar la distribucin normal de los valores.

99,9
99
95
80
50
20
5
1
0,1
2,2
3,2
4,2
5,2
6,2
7,2
Recuento Microbiano Listeria mon

Distribucin de datos Recuento Microbiano Listeria monocytogenes alrededor de la
recta de probabilidad normal.
B) Test para Homogeneidad de Varianza
Contraste C de Cochran: 0,215432
P-valor = 0,199073
47
ANEXO 8
Anlisis de varianza para datos de la viabilidad de Listeria monocytogenes en
salmn ahumado envasado con las pelculas con cepas BAL
Tabla ANOVA para Recuento Microbiano Listeria monocytogenes segn Tratamiento
(1-20)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos
73,6639
19
3,87705
106,65
0,0000
Intra grupos
1,45413
40
0,0363533
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
75,118
59
Contraste Mltiple de Rango para Recuento Microbiano Listeria monocytogenes segn
Tratamiento (1-20)
Nivel
Frec.
Media
Grupos homogneos
-----------------------------------------------------------------------------------------------------10
3
2,66
X
3
3
2,94667
XX
2
3
3,02
XXX
11
3
3,03
XXX
8
3
3,03333
XXX
4
3
3,09
XXX
1
3
3,21333
XXX
7
3
3,27
XX
12
3
3,34
XX
13
3
3,35
XX
5
3
3,35333
XX
6
3
3,42667
XXX
9
3
3,57667
XXX
16
3
3,99
XX
14
3
4,02333
X
17
3
4,82
X
15
3
5,41667
X
18
3
5,85333
XX
19
3
5,87333
XX
20
3
6,38667
X
48
ANEXO 9
Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para viabilidad de Listeria
monocytogenes en salmn ahumado envasado con las pelculas con cepas BAL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
*
ns
1
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
2
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
3
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
4
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
5
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
6
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
ns
*
*
ns
*
*
*
*
7
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
8
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
9
ns
ns
*
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
ns
ns
*
ns
*
*
*
*
10
ns
ns
ns
ns
*
*
*
ns
*
ns
*
*
*
*
*
*
*
*
11
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
12
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
13
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
*
*
*
*
*
*
*
14
*
*
*
*
*
*
*
*
ns
*
*
*
*
*
ns
*
*
*
*
15
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ns
ns
*
16
*
*
*
*
*
ns
*
*
ns
*
*
*
*
ns
*
*
*
*
*
17
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
18
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ns
*
*
ns
ns
19
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ns
*
*
ns
ns

Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Significado
A+B Tpo 0
A+B Tpo 7
A+B Tpo 14
A+B Tpo 21
A+B Tpo 28
A+B+N Tpo 0
A+B+N Tpo 7
A+B+N Tpo 14
A+B+N Tpo 21
A+B+N Tpo 28
Tratamiento
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Significado
Nisina Tpo 0
Nisina Tpo 7
Nisina Tpo 14
Nisina Tpo 21
Nisina Tpo 28
L+ Tpo 0
L+ Tpo 7
L+ Tpo 14
L+ Tpo 21
L+ Tpo 28
20
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ns
ns
-
49
ANEXO 10
Datos de recuentos de bacterias lcticas en biopelcula envasada sobre salmn
ahumado al vaco
A+B
Tiempo
(das)
0
7
14
21
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
1,3E+07
3,3E+07
5,0E+07
5,4E+07
4,7E+07
LOG
Rep. 1
7,10
7,52
7,70
7,73
7,67
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
1,7E+07
5,9E+06
6,0E+07
8,8E+07
3,8E+07
LOG
Rep. 2
7,24
6,77
7,78
7,94
7,58
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
4,1E+06
2,8E+07
4,7E+07
5,3E+07
5,2E+07
LOG
Rep. 3
6,61
7,45
7,67
7,73
7,71
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
1,1E+07
2,3E+07
5,2E+07
6,5E+07
4,6E+07
6,98
7,25
7,72
7,80
7,66
Promedio
(ufc/cm^2)
LOG
Promedio
5,8E+07
6,6E+06
4,4E+07
6,3E+07
4,5E+08
7,38
6,81
7,62
7,72
8,22
Desv.
estndar
0,33
0,41
0,06
0,12
0,07
A+B+N
Tiempo
(das)
0
7
14
22
28
Repeticin
1
(ufc/cm^2)
1,6E+08
8,1E+06
5,3E+07
7,2E+07
7,2E+07
LOG
Rep. 1
8,19
6,91
7,72
7,86
7,86
Repeticin
2
(ufc/cm^2)
LOG
Rep. 2
Repeticin
3
(ufc/cm^2)
1,1E+07
5,6E+06
2,8E+07
2,2E+07
5,1E+07
7,03
6,75
7,44
7,35
7,70
8,4E+06
5,9E+06
5,2E+07
9,4E+07
1,2E+09
LOG
Rep. 3
6,93
6,77
7,71
7,97
9,09
Desv.
estndar
0,70
0,09
0,16
0,33
0,76
50
ANEXO 11
Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza para datos de la
viabilidad de cepas lcticas al interior de la biopelcula envasada sobre salmn
ahumado al vaco
Contraste de Curtosis
Puntuacin Z para curtosis = 1,76211
P-valor = 0,0780496
Como tanto el valor Z para curtosis como su p-valor se encuentran dentro del intervalo
[-2,2], se puede aceptar que los datos para Recuento Microbiano de Bacterias Lcticas
presentan una distribucin normal. En el grfico se aprecia la distribucin normal de los
datos.

99,9
99
95
80
50
20
5
1
0,1
6,6
7,1
7,6
8,1
8,6
9,1
Recuento Microbiano Bacterias L

Distribucin de datos Recuento Microbiano Bacterias Lcticas alrededor de la recta de
probabilidad normal.
B) Test para Homogeneidad de Varianza
Contraste C de Cochran: 0,38188 P-valor = 0,131705
51
ANEXO 12
Anlisis de Varianza para datos de la viabilidad de cepas lcticas al interior de la
biopelcula envasada sobre salmn ahumado al vaco
Tabla ANOVA para Recuento Microbiano Bacterias Lcticas segn Tratamiento (1-20)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Sumas de cuad. Gl
Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos
4,67679 9
0,519643
3,43
0,0104
Intra grupos
3,02933 20
0,151467
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
7,70612
29
Contraste Mltiple de Rango para Recuento Microbiano Bacterias Lcticas segn
Tratamiento (1-20)
Nivel
Frec.
Media
Grupos homogneos
-----------------------------------------------------------------------------------------------------7
3
6,81
X
1
3
6,98333
X
2
3
7,24667
XX
6
3
7,38333
XX
8
3
7,62333
XX
5
3
7,65333
XX
3
3
7,71667
XX
9
3
7,72667
XX
4
3
7,8
XX
10
3
8,21667
X
52
ANEXO 13
Grfico de cajas y bigotes de recuentos microbianos de bacterias lcticas en las
biopelculas sobre salmn ahumado envasado al vaco a 4C
53
ANEXO 14
Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para la viabilidad de cepas
lcticas al interior de la biopelcula envasada sobre salmn ahumado al vaco
1
1
2
ns
3
ns
4
ns
5
ns
6
ns
7
ns
8
ns
9
ns
10 *
*
ns
2
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
3
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
4
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
5
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
6
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
7
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
*
8
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns

Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Significado
A+B Tpo 0
A+B Tpo 7
A+B Tpo 14
A+B Tpo 21
A+B Tpo 28
A+B+N Tpo 0
A+B+N Tpo 7
A+B+N Tpo 14
A+B+N Tpo 21
A+B+N Tpo 28
9
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
10
*
ns
ns
ns
ns
ns
*
ns
ns
-
54
ANEXO 15
Datos de medicin de pH y Aw en biopelculas
pH
Repeticin
1
Repeticin
2
Repeticin
3
Repeticin
4
Desv. Estndar
Promedio
X
J
Y
4,36
5,56
5,42
4,39
5,74
5,57
4,31
5,48
5,4
4,38
5,54
5,44
0,035
0,112
0,076
4,36
5,58
5,45
Aw
Repeticin
1
Repeticin
2
Repeticin
3
Repeticin
4
Desv. Estndar
Promedio
X
J
Y
0,915
0,92
0,93
0,92
0,93
0,92
0,92
0,93
0,93
0,895
0,92
0,93
0,012
0,005
0,005
0,9125
0,925
0,9275
Serie
X
J
Y
Tratamiento
Tiempo 0 pelcula lista no envasada con salmn
Tiempo 1 da a 4C pelcula lista envasada con salmn
Tiempo 2 semanas a 4C pelcula lista envasada con salmn
55
ANEXO 16
Anlisis de varianza para pH de la biopelcula segn tratamiento
Tabla ANOVA
---------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
---------------------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos
3,61055 2 1,80528
275,03
0,0000
Intra grupos
0,059075 9
0,00656389
---------------------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
3,66963 11
Contraste Mltiple de Rango
Frec. Media
Grupos homogneos
-----------------------------------------------------------------------------------------------------X
4
4,36
X
Y
4
5,4575
X
J
4
5,58
X
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Lmites
-----------------------------------------------------------------------------------------------------X-J
*-1,22
0,159931
X-Y
*-1,0975
0,159931
J-Y
0,1225
0,159931
-----------------------------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
56
ANEXO 17
Anlisis de Varianza para Aw de la biopelcula segn tratamiento
Tabla ANOVA
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos
0,000516667
2
0,000258333
3,88
0,0611
Intra grupos
0,0006
9
0,0000666667
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,00111667 11
Contraste Mltiple de Rango
Frec. Media
Grupos homogneos
-----------------------------------------------------------------------------------------------------X
4
0,9125
X
J
4
0,925
X
Y
4
0,9275
X
-----------------------------------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Lmites
-----------------------------------------------------------------------------------------------------X-J
-0,0125
0,0161178
X-Y
-0,015
0,0161178
J-Y
-0,0025
0,0161178
-----------------------------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

Evaluacin de una biopelcula con bacterias

Tesis presentada como parte de

Anbal Andrs Concha Meyer

Sra. Renate Schbitz Twele

Sra. Carmen Brito Contreras

Sr. Kong Shun Ah-Hen

Mis ms profundos agradecimientos a las personas que me apoyaron, acompaaron y

Importancia de las bacterias cido lcticas en el control

Tipos de bacterias acido lcticas estudiadas para el

Bacterias del gnero Carnobacterium utilizadas en el

Productos orgnicos para el control de patgenos como

Tipos de componentes y elaboracin de pelculas para

Estudio de pelculas a base de alginato y protenas

Envases activos con capacidad antimicrobiana

Utilizacin de pelculas para la inhibicin de Listeria

Uso de nisina en envases

Cepas bacterianas a encapsular

Propagacin de las cepas lcticas

Centrifugacin y obtencin del pellet celular de cepas BAL

Preparacin de las biopelculas con cepas BAL

Aspersin de las biopelculas con nisina

Inoculacin de salmn ahumado con L. monocytogenes y

Estudio de viabilidad de cepas lcticas al interior de la

Estudio de la viabilidad de L. monocytogenes en salmn

Estudio in vitro de la difusin de STB (sustancia tipo

Estudio del pH y la actividad de agua (Aw) de las

Diseo experimental y anlisis estadstico

Estudio de la difusin in vitro de la STB desde las

Inhibicin de L. monocytogenes en salmn ahumado, por

Viabilidad de las cepas lcticas al interior de la biopelcula

Valores de pH y Aw de las biopelculas en el tiempo

Tratamientos segn los tipos de biopelculas

Tratamientos sometidos a determinacin de pH y Aw

rea de inhibicin (cm ) de las biopelculas almacenadas

Recuentos de L. monocytogenes sobre salmn ahumado

Recuentos microbianos de bacterias lcticas en las

Esquema de propagacin de las cepas lcticas

Esquema de preparacin del homogeneizado de clulas

Esquema de elaboracin de las biopelculas de alginato

Cmara de flujo laminar vertical marca LABCONCO

Envasadora al vaco marca MULTIVAC C100 utilizada

Muestra de salmn envasada al vaco, cubierta con la

Medidor de Aw marca Lufft GmbH

Difusin de las STB desde las biopelculas sobre un

Trozos de biopelculas con halos de inhibicin sobre un

Medias de reas de inhibicin de los trozos de

Recuento de L. monocytogenes en salmn ahumado

Recuentos de L. monocytogenes en salmn ahumado

Recuento bacterias lcticas en biopelcula almacenadas a

Biopelcula de almidn, alginato y glicerol con cepas BAL

Datos de la difusin de STB de las pelculas en csped de

Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza

Anlisis de varianza de las reas de inhibicin de difusin

Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para

Datos de recuentos de Listeria monocytogenes en salmn

Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza

Anlisis de varianza para datos de la viabilidad de Listeria

Tabla de diferencias significativas entre tratamientos para

Datos de recuentos de bacterias lcticas en biopelcula

Anlisis de la distribucin y homogeneidad de varianza

Anlisis de varianza para datos de la viabilidad de cepas