INTRODUCCION

III MARCO TEORICO

TECNICA DE ENRREQUESIMIENTO DEL CULTIVO

Para mejorar las posiblidades de aislar algunos tipos de bacterias pocos
frcuentes fisiolgicamente como puede proceder de la siembra en placa, al
enrrequecimiento del cultivo este mtodo para aislar m.o fue introducido por los
eminentes bacterilogos beijrinca.,
TECNICA DE DISOLUCIONES EN SERIE
Si el organismo q se trata de aislar en un cultivo mixto se encuentra en mayor
numero que los dems organismos la mezcla, puede ser posile obtenerlo en
cultivo puro despus de efectuar una serie de disoluciones en tubos de medio
apropiado. La disoluciones mas avanzadas de la muestra solo contendrn una
especie
Tcnica de aislamiento de una sola celua
En este procediento se utiliza asociado al microscopio, un instrumento especial
micromanipulador que permite tomar un solo organismo de una prepraracion de
gota en gotapendiente. Mediante en micromanipulador, el operador puede
digerir dentro de la gota pendiente el movimiento de un micropipeta(un tubito
sumamente pequeo).

AISLAMIENTO DE CULTIVO PUROS POR LA TECNICA DE

ENRREQUECIEMIENTO
El estudio de los microorganismos en estos hbitats exige que se conozcan los
microorganismos especficos presentes. Para lograr esto es necesario aplicar
tcnicas que ayuden a desenmaraar las poblaciones mixtas y complejas de
microorganismos, o cultivos mixtos, y obtener cultivos puros de especies
distintas y separadas. Un cultivo puro est formado de poblaciones de clulas
derivadas de una sola clula.
El estudio de los microorganismos requiere la utilizacin de una serie de
tcnicas que permitan su aislamiento y su crecimiento bajo condiciones
controladas. A continuacin vamos a hacer un breve repaso de las principales
tcnicas que se emplean en el estudio de los microorganismos.

MTODOS PARA AISLAR UN CULTIVO PURO

Tcnica de siembra por estras en placa y tcnica de siembra por difusin en

placa: Se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un medio de
cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estras o
por difusin. Esta operacin hace posible adelgazar la muestra de tal
manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas
de otras.

Tcnica de la placa vertida: El principio de la tcnica de la placa vertida es

la dilucin (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y
enfriado. Se necesita hacer diluciones en ms de un tubo para obtener
colonias bien aisladas.

Tcnica del enriquecimiento del cultivo: Para mejorar las posibilidades de

aislamiento de algunos tipos fisiolgicos poco frecuentes de bacterias, los
procedimientos de siembra en placa debern de estar precedidos del
desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El principio de
esto, es procurar un ambiente de cultivo diseado que pueda favorecer el
desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no
sea adecuado para las dems. Los medios de enriquecimiento se usan
generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra
en muy pequeas cantidades.

Tcnica de aislamiento de una sola clula: Para poder obtener un solo

microorganismo de una preparacin en gota suspendida, se necesita el
micromanipulador. Este aparato permite al operador controlar una
micropipeta o microcnula (aguja muy fina) dentro de una gota pendiente de
tal manera que se pueda tomar una sola clula y pasarla a un medio de
cultivo.

MTODOS DE PPRESERVACIN: No todas las especies responden de

manera similar, lo que significa que lo que se ha aprendido para un cultivo
puede no ser aplicable para otro. Las tcnicas en uso son:

Resiembra peridica a medios frescos: Los cultivos de bacterias se pueden

mantener en tubos de medio en los que han sido cultivados mediante pasos
peridicos a medios frescos. Los intervalos en que se hace la resiembra
varan con el tipo de microorganismos. Se deben determinar tres cosas
antes de manejarlo: el medio de cultivo apropiado para usarlo con cada
cultivo, la temperatura propia para mantener los cultivos, y el tiempo que se
necesita para hacer las resiembras.

Preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral: Muchas bacterias

se preservan bien cubriendo el agar en que estn creciendo con aceite
mineral estril. El aceite deber cubrir ms o menos 1.5cm del pico del agar
inclinado. Algunas especies se han conservado durante 15 o 20 aos.

Preservacin de cultivos por secado rpido en congelacin (Liofilizacin):

Es el procedimiento ms eficaz para la preservacin de cultivos por ms de
20 aos. En este procedimiento las clulas se secan rpidamente, mientras
son congeladas, mediante las siguientes etapas: la suspensin de clulas
se pone en pequeos frascos que se sumergen en una mezcla de hielo
seco y alcohol (-78C). Los frascos se conectan inmediatamente a una lnea
de alto vaco, y una vez que se termin el secado cada frasco se sella bajo
condiciones de vaco.

Almacenamiento a temperaturas muy bajas: En este procedimiento las

clulas se congelan con un agente protector (glicerol o dimetil sulfxido).
Los especimenes congelados se guardan en refrigeradores con nitrgeno
lquido.

MEDIOS DE CULTIVO.-

PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON

Esta prueba realiza para la determinacin del metabolismo oxidativo o
fermentativo de los carbohidratos
MEDIO DE CULTIVO
Medio base de Hugh y Leifson

Triptona
Extracto de levadura
Prpura de Bromocresol
Agar
Agua destilada

1,0
0,04
2,0
1000,0

10,0 g
g
g
g
mL

Ajuste el pH a 7,2. Esterilice a 121C (15 libras de presin) por 15 minutos.

Dispense en tubos 9 mL por tubo.

Agregue la solucin de glucosa al 10%

esterilizada por filtracin
En el caso de los cocos gram positivos su forma de metabolizar la glucosa
es una caracterstica importante para su identificacin, por eso en este
caso el glcido aadido al medio base es la glucosa
PROCEDIMIENTO
Para cada microorganismo a identificar,se inoculan por puncin dos tubos
de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina
estrilpara crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35C hasta por
14 das.

MEDIO SIN INOCULAR

METABOLISMO FERMENTATIVO

METABOLISMO OXIDATIVO

AGAR SS
USO
El Agar Salmonella Shigella , tambin conocido como Agar SS, es utilizado
para el aislamiento de especies

de Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas y de alimentos.

EXPLICACION
El Agar Salmonella Shigela es una modificacin del Agar Desoxicolato y Citrato
descrito por Leifson. El
Agar Salmonella Shigella tiene un desempeo superior a otros medios para el
aislamiento de especies de
Salmonella y Shigella. Ewing y Bruner encontraron que el Agar SS tiene la
ventaja de que puede ser
utilizado con inculos grandes de muestras clnicas en las que se pretende
poner de manifiesto la
presencia de especies de Salmonella y Shigella caudill reporta resultados muy
satisfactorios con el uso del
Agar SS para el aislamiento de Shigella hormaeche y col. usaron el Agar SS
junto con otros medios para
el aislamiento de Shigella como el agente causal de diarreas infantiles.
En este medio las sales biliares No. 3 y el verde brillante actan como
inhibidores de bacilos Gram
positivos, de la mayora de bacilos coliformes y del swarming en Proteus spp.,
mientras que permiten el
crecimiento de Salmonella spp. El tiosulfato de sodio y el citrato frico permiten
la deteccin de la
produccin de H2S. La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos, el rojo
neutro y el verde brillante
actan como indicadores de pH y el agar es agregado como agente
solidificante.
FORMULA
Mtodo:
Suspender 60 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin
suave hasta su completa
disolucin y hervir durante un minuto. Enfriar a una temperatura entre 45-50 C
y vaciar en placas Petri
estriles. No esterilizar en autoclave.
Procedimiento:
1. Recolectar las muestras en contenedores estriles o con hisopos estriles
transportados en un
medio de transporte.
2. Sembrar las muestras por el mtodo de la estra para obtener colonias
aisladas,
3. Incubar las placas a 35-37 C durante 24 a 48 horas y examinar el
crecimiento.
Algunas cepas de Siguella spp. son inhibidas en este medio por lo que es
recomendable utilizar
medios adicionales.
Las enterobacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de
fermentar la lactosa . Las

especies de Salmonella y Shigella son no fermentadoras de la lactosa y forman

colonias incoloras en el
Agar SS. Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de
hidrgeno desarrollan colonias con
centro obscuro.
Los coloformes son parcialmente inhibidos. E. Coli produce colonias de color
rosa a rojo y pueden
presentar una zona de precipitado. Las colonias de Enterobacter aerogenes son
cremosas de color rosa.
Citrobacter y Proteus spp. Pueden crecer produciendo colonias con centros de
color gris o negro debido a
la produccin de H2 S. Enterobacter faecalis es parcialmente inhibido
presentando colonias incoloras.

AGAR XLD http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20XLD.pdf

Uso

El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el aislamiento y
diferenciacin de
bacilos entricos Gram negativos, especialmente del gnero Shigella y Providencia.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Agar_XLD.pdf

El Agar XLD fue desarrollado por Taylor para incrementar la eficiencia en el aislamiento e identificacin de
patgenos entricos, particularmente de Shigella. Los patgenos son diferenciados no slo de los no
patgenos fermentadores de lactosa, sino tambin de varios no patgenos no fermentadores de la lactosa
o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de grmenes exigentes ya que otros
medios contienen inhibidores excesivamente txicos. El Agar XLD est incluido en la USP para los mtodos
de lmite microbiano y las pruebas de presencia-ausencia de Salmonella
En este medio el extracto de levadura provee la fuente de nitrgeno, carbono, vitaminas y cofactores. La
xilosa, lactosa y sacarosa son los carbohidratos fermentables. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico son
adicionados para ver la produccin de H2S. El rojo de fenol acta como indicador. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmtico y el agar es adicionado como agente solidificante.

http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8783

REVISION BIBLIOGRAFICA

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/leifson.p
df

http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20XLD.pdf

http://www.bioygeo.info/pdf/19_Microorganismos_interes_y_estudio.pdf

http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20SALMONELLA%20SHIGELLA.pdf

http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/65.htm

Microbiologa de alimentos y sus procesos de elaboracin . John T. NICKERSON.

ANTHONY J. SINSKEY. EDITORIAL ACRRIBIA. 1972. Zaragoza. Espaa

AHMED. E, YOUSEF 2006, microbiologia de los alimentos manual de laboratorio
editorial acribia .s.a Zaragoza Espaa
MICHAEL J PELCZAR,JR, Cultivos puros y caracteres de crecimiento, ..