MTODOS Y TCNICAS EN SEPARACIN CELULAR (SORTING)

Las clulas se pueden fijar con formaldehdo al 1%, y entonces se pasa por un
citmetro, esto se hace para evitar que las clulas estn contaminadas por un virus.
Las clulas las podemos encontrar en dos estados morfolgicos: individualizadas o
formando tejidos.
Si individualizamos las clulas hay dos posibles tipos celulares: clulas adherentes y
clulas no adherentes. Las adherentes se caracterizan porque forman enlaces con las
placas.
La sangre y la linfa tienen clulas no adherentes.
Vamos a estudiar tcnicas de separacin celular: gradientes de densidad, elutriacin
centrfuga y sorting.
GRADIENTES DE DENSIDAD:
Necesitamos de una fuerza de aceleracin para que sean eficientes (centrfuga). La
gran ventaja es que podemos trabajar con un gran nmero de clulas.

Hay dos grandes tipos:

Medios de densidad constante: Se utiliza Ficoll-Hypaque; un polmero de bajo
peso molecular pero que tiene una densidad constante. Aglutina los eritrocitos
de tal manera que forma complejos.
Despus estamos 3 cuartos de hora en una centrfuga, y como consecuencia
este polmero de bajo peso molecular va a aglutinar los eritrocitos, que son los
ms pequeos, pero tras aglutinarse sern los ms densos y caern hacia abajo.
El segundo tipo celular que ser el ms denso sern los granulocitos, que
tambin precipitarn. Despus queda una banda intermedia, que es un halo
blanco en el que vamos a encontrar los linfocitos y los monocitos. Es la tcnica
ms utilizada para obtener linfocitos y monocitos en grandes nmeros.
Se trata de un gradiente en barrera porque solo hay un tipo de polmero y una
nica densidad.

Medios transformados: Vamos a tener varios polmeros con distintas

densidades. Cada clula se va a quedar entre las capas de diferentes
densidades. Esto se utiliza cuando queremos recuperar los .
o Continuos: Hace un gradiente de densidad real. Vamos a tener un
gradiente real de las densidades que queramos. En el fondo ambos
tienen la misma utilidad, la diferencia es que una mquina es capaz de
hacer un gradiente ms perfecto.

o Discontinuos: Usamos varios polmeros con distintas densidades o

concentraciones.
El ms utilizado es el gradiente en barrera o Ficoll, y despus el discontinuo.
ELUTRIACIN CENTRFUGA
Se usa en las donaciones de sangre, para inmensos nmeros de clulas, cuando se
trabaja con litros. Se coloca toda la sangre en un sistema que va a centrifugar, en una
cmara, donde la cmara va a girar, y a la vez va a haber un suministro de clulas. A
medida que se mete ms fuerza las clulas se van a separar por masa.
La ventaja es que se utiliza para litros de sangre.
SORTING
Separar las clulas de manera muy especfica mediada por fluorescencia, magnetismo,
centrifugacin o lisis. Permite el aislamiento especfico de las clulas y orgnulos de
inters.

Separacin celular mediante bolitas magnticas

Separacin celular mediante inmuno-rosetas
Separador celular mediante inmuno-fluorescencia. Sorter.

Separacin celular mediante bolitas magnticas

Pegamos una bolita magntica a un anticuerpo monoclonal, de tal manera que de
todas las clulas que tenemos buscaremos una en particular: CD4-T-contra una
determinada enfermedad. Echo un anticuerpo anti clulas T, despus otro anti CD4, y
lo siguiente que vamos a hacer es pasar todas las clulas por un imn, de tal manera
que las clulas que van a quedar retenidas en el imn van a ser las que hayan sido
marcadas con los anticuerpos, eluyendo las que no. Esto se llama sorting positivo,
porque lo que marcas es lo que retienes.
Lo normal es que se quieran las clulas sin marcar. El marcaje puede hacer que se
inicien funciones que no nos interesan como una apoptosis o una activacin; por lo
que muchos autores hacen un sorting negativo, es decir, marco todo lo que no quiero
y eluyo lo que quiero. As me quedo con las clulas que quiero pero sin haber influido
sobre ellas.
Separacin mediante inmunorosetas
Se utilizan dos tipos de anticuerpos: uno bivalente, que reconoce la glicoforina, una
protena presente en los eritrocitos; y utilizamos un segundo anticuerpo que por un
lado reconoce glicoforina y en su otro sitio de unin reconoce el antgeno que yo
quiera, por ejemplo clulas T-CD3. De esta manera, si echo los dos tipos de anticuerpo,
los eritrocitos se van a pegar entre s, porque los anticuerpos van a funcionar como

puentes. La proporcin de eritrocitos es muy alta por lo que forman puentes, y de vez
en cuando habr un anticuerpo que reconozca un eritrocito y la clula que quiero pero
que no se unir a lo que no me interesa, despus con un gradiente de densidad separo
lo que no quiero de lo que precipito.
La ventaja es que es un sistema especfico frente al gradiente de densidad, y es el ms
barato.
Sorter
Es un sistema muy sofisticado que me permite tener una precisin de una sola clula.
La pureza de las bolitas magnticas o del roseteo no llega al 95%, por lo que ganamos
mucho en pureza, llegando al 100% o 99%.
Es un tipo de citmetro que tiene el flujo laminar abierto. El flujo laminar va hacia
abajo, est en el aire, y mediante un vibrador piezoelctrico va a empezar a vibrar el
flujo. Las clulas estn en el fluido, como consecuencia el fluido se rompe en gotas, y
en ellas se van a quedar las clulas. Se producen las gotas que se desee (90.000
gotas/s, 70.000, etc). Estas gotas se las carga elctricamente con diferenciales de
carga.
Son crticas las sales del tampn fosfato. El agua destilada es capaz de lisar cualquier
clula, por lo que no podremos utilizar sta para separar las clulas. A continuacin las
clulas que han sido cargadas se pasan por unas placas que tienen una diferencia de
potencial de unos 6000 voltios. Se produce un campo magntico de tal manera que las
clulas que hayan sido cargadas positivamente se dirigirn hacia la placa negativa, y
viceversa. Tendremos unos tubos que recogern las clulas, las que no queramos irn
por el centro al tanque de desecho.
Time delay: retraso entre que se ve la clula y decidimos que vamos a sortearlo?
Vamos a asignar diferenciales de carga a las gotas, es decir, todas las gotas no van a
tener la misma carga, unas tendrs mas que otras. Con esto vamos a poder separar en
cuatro tubos a la vez. Tambin evitamos un posible problema, ya que dos clulas que
tuvieran la misma carga se repeleran. Asignando distintos valores de carga se evita la
repulsin. Podemos separar cuatro poblacioens distintas de forma simultnea.
Podemos sortear 1, 2 o 3 gotas, lo mejor es usar 2 o 3. As nos aseguramos que en esas
tres gotas est la celula que queramos. El modo ms preciso es separar una sola gota,
pero tienen un inconveniente, el recovery (recuperacin). La pureza es del 100% pero
el recovery va a ser muy bajo, tendremos muy pocas clulas. En cambio cuando
usamos 3 gotas podemos tener un sistema algo ms impreciso, bajando al 99.8 o
99.9% de pureza, pero el recovery ser mximo.
Hay que calcular el tiempo que tarda desde que se reconoce el lser hasta que se
genera la primera gota, porque esa gota es el modo de decisin, es la que va a ser
separada y la que tendr la carga. Ese retraso desde que se pasa por delante del laser y

se decide si se quiere o no recibe el nombre de time delay. Las clulas que se carguen
sern separadas y las que no queramos no.
Cuando tenemos varios lseres se complica. Es muy importante que los lseres estn
sincronizados unos con los otros. La distancia entre ellos es tambin el tiempo que
existen entre cada uno de los lseres, que debe ser calculado. Al final tenemos
informacin de una clula que ha pasado por 4 lseres. Si nos equivocamos en el
tiempo que tarda la clula en recorrer un espacio, separaremos otra que ya haya
pasado o que va a llegar despus.
Si quiero mxima pureza con mnimo nmero de clulas que no queremos: Si de tres
gotas hay una que quiero y otra que no, si acepto tendr una pureza menor pero un
mayor recovery. Si aborto esas clulas tendremos mxima pureza con mnimo
recovery.