UNIVERSIDAD CENTROAMERICANA

FACULTAD DE CIENCIAS, TECNOLOGA Y AMBIENTE

Laboratorio No. 5
Determinacin de la Concentracin de Ocratoxina en
una muestra de Caf Molido




Autores:
Karen Gonzlez
Francisco Valladares



Managua, Nicaragua
Noviembre, 2013



TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ................................................................................................................................. 1
1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 2
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 3
2.1 GENERAL ......................................................................................................................... 3
2.2 ESPECFICOS .................................................................................................................... 3
3. MARCO TEORICO ................................................................................................................... 4
3.1 Ocratoxina A ................................................................................................................... 4
3.2 Condiciones de crecimiento ............................................................................................. 4
3.3 Efectos en la salud............................................................................................................ 5
3.4 La ocratoxina en el caf .................................................................................................... 5
3.5 Determinacin de Ocratoxina ........................................................................................... 6
4. MARCO METODOLGICO ....................................................................................................... 7
4.1 Materiales ....................................................................................................................... 7
4.2 Procedimiento ................................................................................................................. 7
5. RESULTADOS ......................................................................................................................... 8
5.1 Determinacin de la Ocratoxina A en el caf ..................................................................... 8
6. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 9
7. LISTA DE REFERENCIAS ..........................................................................................................10
8. ANEXOS ...............................................................................................................................11
8.1 Anexo A ..........................................................................................................................11
8.2 Anexo B ..........................................................................................................................11


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RESUMEN


El presente laboratorio tuvo como objetivo general la determinacin de la
concentracin de ocratoxina en una muestra de caf molido. Para llevar a cabo esta
prctica se sigui un procedimiento de tres partes: la primera parte fue la extraccin
de la muestra para lo cual se pesaron 25g de caf molido y se colocaron en una
licuadora donde se agitaron con 50ml de metanol durante un minuto, seguidamente
se procedi a filtrar el lquido.
La segunda parte consisti en la dilucin del extracto para lo cual se tomaron 10 ml
del filtrado y se le agregaron 40 mL de PBS/2% Tween-20 Wash Buffer y se mezcl
bien.
La tercera y ltima parte consisti en la determinacin de la concentracin de
ocratoxina para lo cual se utiliz el fluormetro que dio una lectura de 36 ppb de
concentracin lo que comparado con los lmites permisibles demuestra que esa
muestra de caf molido no es apta para consumo humano.

















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1. INTRODUCCIN


La Ocratoxina A (OTA) (C20H18O6NCl) es una molcula formada por un anillo de 3,4-
dihidro metil isocumarina unido, por medio de su grupo carboxilo y a travs de un
enlace tipo amida, a una molcula de fenilalanina. Es muy estable, incolora, soluble
en disolventes orgnicos polares, poco soluble en agua, con caractersticas de cido
dbil y capaz de emitir fluorescencia al ser excitada con luz ultravioleta.
Detectada por primera vez en muestras de maz africanas, es considerada un
metabolito secundario txico producido por especies de hongos filamentosos
superiores de los gneros Penicillium y Aspergillus, capaces de crecer sobre una
amplia gama de sustratos orgnicos. Los cereales, en humanos, y los piensos, en
animales, constituyen las principales fuentes de exposicin alimentaria, aunque
tambin pueden encontrarse niveles notables de contaminacin en otros alimentos.
Los granos de caf verde, la carne y sus derivados, las uvas, el vino, las pasas e
higos secos, el chocolate, las legumbres, la cerveza y las especias, constituyen
fuentes dietticas a considerar slo en caso de altas ingestas.
Otras fuentes no convencionales de OTA son el t, las infusiones, el aceite de oliva
y los alimentos infantiles a base de cereales. Las prcticas agrcolas y las
condiciones medioambientales (humedad y temperatura) durante el
almacenamiento y el transporte afectan de forma directa a los niveles de OTA en
los alimentos. Asimismo, se ha demostrado que una alta actividad de agua favorece
la produccin de OTA en los alimentos. Adems de la OTA, existen otros tipos de
ocratoxinas como son la ocratoxina B (OTB) que se caracteriza por ser un derivado
no clorado de la OTA con carcter menos txico y la ocratoxina C (OTC) ster de la
OTA con escaso potencial txico, ambas productos de la hidrlisis de OTA y OTB,
respectivamente, que se caracterizan por carecer de toxicidad.













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2. OBJETIVOS


2.1 GENERAL

Determinar la concentracin de ocratoxina de una muestra de caf molido

2.2 ESPECFICOS

Desarrollar habilidades en la realizacin de una Prueba Ocra
TM
para la
medir la concentracin de ocratoxina.
Adquirir habilidad en la realizacin de una columna de cromatografa.





























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3. MARCO TEORICO


En este captulo se abordan los conceptos tericos necesarios para sustentar los
resultados que se obtengan en esta investigacin. Se presentan las principales
caractersticas de la ocratoxina, sus efectos en el ambiente y a la salud humana as
como el concepto de fluormetro.

3.1 Ocratoxina A

La Ocratoxina pertenece al grupo de las micotoxinas, toxinas producidas por hongos
que contaminan los cereales y otros alimentos de origen vegetal, pudiendo provocar
al ser humano a largo plazo una toxicidad crnica al consumir dichos alimentos
contaminados con altas concentraciones (Fundacin Vasca para la seguridad
alimentaria , 2013).
La Ocratoxina (C20H18O6NCl) es una molcula formada por un anillo de 3,4- dihidro
metil isocumarina unido por medio de su grupo carboxilo y travs de un enlace tipo
amida, a una molcula de fenilalanina. Es muy estable, incolora, soluble en
disolventes orgnicos polares, poco soluble en agua, con caractersticas de cido
dbil y capaz de emitir fluorescencia al ser excitada con luz ultravioleta (Fundacin
Vasca para la seguridad alimentaria , 2013).
Existen varios tipos de ocratoxinas, pero la ocratoxina A es la ms frecuente en
alimentos, y la que presenta mayor toxicidad. La ocratoxina A est clasificada como
posiblemente cancergena para el ser humano por sus propiedades
carcinognicas, mutagnicas, teratognicas siendo especficamente nefrotxica e
inmunotxica (Fundacin Vasca para la seguridad alimentaria , 2013).
3.2 Condiciones de crecimiento

La ocratoxina es una micotoxina producida por hongos del gnero Asper- gillus,
principalmente de la especie Aspergillus ochraceus, aunque tambin puede ser
producida por hongos de Penicillium verrucosum. Pueden formarse tanto en el
cultivo del alimento en campo, principalmente cereales (trigo, maz, cebada y arroz),
como durante la recoleccin, transporte, almacenamiento y secado por inadecuadas
prcticas de higiene y manipulacin de los cereales (rea de Toxicologa.
Universidad de la Laguna, 2011).
Dichos hongos requieren ciertas condiciones favorables para su crecimiento y
produccin de ocratoxinas, generalmente, altas temperaturas y elevada actividad
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de agua (en el ambiente y en el suelo). Asimismo, los daos fsicos a las cosechas
(por golpes, ataques de insectos, roedores, aves, etc.) favorecen la proliferacin de
hongos y su consecuente produccin de ocratoxinas. Particularmente, la ocratoxina
A es muy estable, y resistente a altas temperaturas y acidez (rea de Toxicologa.
Universidad de la Laguna, 2011).
3.3 Efectos en la salud

El rgano ms vulnerable a los efectos de la ocratoxina A es el rin, la ocratoxina
crecen de forma natural en determinados productos vegetales, en la propia planta y
durante su almacenamiento y transporte bajo condiciones especficas de humedad
y temperatura (Ministerio de Salud de Chile, 2011).
Esta micotoxina ha demostrado tener propiedades carcinognicas, negrotxicas,
teratgenas e inmunotxicas en todos los animales de experimentacin analizados
hasta ahora. Tambin se ha encontrado en carne de cerdo y sus vsceras,
procedente de animales que se han contaminado a travs de la alimentacin animal.
La exposicin humana se ha confirmado con la deteccin de esta micotoxina en
muestras de sangre y de orina (Ministerio de Salud de Chile, 2011).
Los efectos de la ocratoxina son principalmente teratgenos e immunotxicos, y su
toxicidad se centra especialmente en el rin (el rgano ms vulnerable a esta
micotoxina), tal y como confirman las investigaciones realizadas hasta el momento
en animales, que han vinculado su poder carcinognico en la aparicin de tumores
renales. A pesar de todo, los expertos admiten que no existen datos que avalen una
relacin directa en humanos. La evaluacin que ha realizado la Agencia
Internacional de Investigacin del Cncer (IARC), basada en datos de estudios de
animales, concluye que esta toxina debe considerarse en la clasificacin de riesgo
2B y definirse como posible carcingeno en humanos (Ministerio de Salud de
Chile, 2011).

3. 4 La ocratoxina en el caf

La presencia de ocratoxina A en el caf se descubri apenas en 1988. Poco
despus, la Unin Europea puso en marcha un programa de armonizacin de los
reglamentos sobre la presencia de micotoxinas en los alimentos, que comprenda
establecer la concentracin mxima de ocratoxina en el caf. Un estudio encargado
por la Federacin Europea del Caf (ECF) -que representa a los importadores de
caf verde, la torrefaccin y la produccin de caf instantneo- revel que el lmite
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establecido para la ocratoxina es de 5 partes por mil millones (ppb). (Organizacin
de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, 2006).
La presencia de Ocratoxina A en caf ha suscitado un especial inters, desde su
primer estudio en muestras de caf verde en grano y sobre todo en la deteccin de
la toxina en muestras de caf tostado y en infusiones de caf (rea de Toxicologa.
Universidad de la Laguna, 2011).
El caf es un alimento importante en el consumo humano, y que a pesar de los
avances tecnolgicos ni el proceso de tostado ni el de preparacin aseguran la
destruccin completa deocratoxina, por lo que es necesario un correcto control de
higiene en la produccin de caf verde para preservar la salud de los consumidores,
disminuyendo as su exposicin a la ingesta alimentaria de esta toxina
(Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, 2006).
3.5 Determinacin de Ocratoxina

Los mtodos de determinacin y cuantificacin han variado a lo largo de los aos,
as como los procedimientos de extraccin y purificacin. El objetivo principal en la
elaboracin de tcnicas es la obtencin de niveles de deteccin muy bajos,
pudiendo ser utiliza- dos tanto en investigacin como en anlisis de prospeccin o
control (rea de Toxicologa. Universidad de la Laguna, 2011).
Entre los mtodos ms usuales empleados para la determinacin y cuantificacin
de los niveles de Ocratoxina A se incluyen:
Cromatografa lquida de alta resolucin.
Cromatografa de capa fina
Cromatografa de intercambio inico
Tcnicas de electroforesis capilar








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4. MARCO METODOLGICO

En este captulo se presenta la metodologa que se implement para el desarrollo
del trabajo investigativo, desde la preparacin de las soluciones hasta los anlisis
realizados.
4.1 Materiales

Balanza Analtica
Molino para granos
Tamiz
KIT de Ocratoxina
Fluormetro
Esptulas
Caf molido
Bicarbonato de Sodio al 1%
Solucin PBS al 2%
4.2 Procedimiento

Parte I: Extraccin de la Muestra
Se pesaron 25 g de caf molido y se colocaron en el vaso de la licuadora.
Se agregaron al vaso 50 mL de metanol: 1% bicarbonato de sodio.
Se tap el vaso de la licuadora y se mezcl a alta velocidad por un minuto.
Se quit la tapa del vaso y se verti el extracto dentro del papel filtro. Se
recogi el lquido filtrado en un recipiente limpio.
Parte 2: Dilucin del extracto
Se vertieron 10 mL del extracto filtrado dentro de un beaker limpio.
Se diluy el extracto con 40 mL de PBS/2% Tween-20 Wash Buffer. Se
mezcl bien.
Se filtr el extracto a travs de un filtro de microfibra y se recoge lo filtrado
en un beaker limpio.
El filtrado se deposit en un tubo de ensayo pequeo y se coloc en el
fluormetro para determinar la concentracin.


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5. RESULTADOS

En el presente captulo se muestran los anlisis de los resultados sobre la
determinacin de ocratoxina en una muestra de caf molido.
5.1 Determinacin de la Ocratoxina A en el caf

Segn las soluciones realizadas y los datos obtenidos en el fluormetro se determina
que la concentracin de ocratoxina A en la muestra de caf molido es de 36 ppb.

Tabla 5.1 Lmites permisibles de la Ocratoxina en alimentos
Fuente: (Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, 2006)

De acuerdo a la Tabla 5.1 los lmites mximos permisibles de Ocratoxina A en caf
molido establecidos por la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura
y la Alimentacin (FAO) es de 10 g/kg o ppb, por lo que podemos deducir que los
niveles de ocratoxina encontrados en la muestra de caf molido son
significativamente ms altos de los niveles permitidos, por los que es posible que el
consumo de este caf afecta la salud de los consumidores nicaragenses.
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6. CONCLUSIONES

Se logr determinar la presencia de ocratoxina en una muestra de caf molido, con
los resultados obtenidos se llega a la conclusin que de los niveles de ocratoxina
presentes en la muestras son significativamente mayores a los niveles mximos
establecidos por la FAO, por lo tanto esa muestra de caf no es apta para consumo
humano.
Se desarrollaron habilidades en el uso del fluormetro ya que se logr entender
cmo es que se tiene que calibrar este instrumento para lograr obtener una medicin
realista para poder realizar un correcto anlisis de los resultados obtenidos.


















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7. LISTA DE REFERENCIAS


rea de Toxicologa. Universidad de la Laguna. (2011). La ocratoxina A en
alimentos de consumo humano: revisin. Santa Cruz de Tenerife:
Universidad de la Laguna.
Fundacin Vasca para la seguridad alimentaria . (2013). Ocratoxina A. Madrid:
Elika .
Ministerio de Salud de Chile. (2011). Monitoreo de Micotoxinas en alimentos.
Santiago de Chile .
Oraganizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin.
(2006). Un caf ms sano. Roma: FAO.


















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8. ANEXOS

8.1 Anexo A








Figura 8.1 Estructura Qumica de la Ocratoxina A
Fuente: (rea de Toxicologa. Universidad de la Laguna, 2011)

8.2 Anexo B











Figura 8.2 Fluormetro
Fuente: (Ministerio de Salud de Chile, 2011)