1

BIOLIXIVIACION DEL AGUA RESIDUAL DE LA MINA SAN JOS

1. OBJETIVOS.

1.1 Objetivo General
Disminuir la cantidad de hierro (II) presente en muestras de agua proveniente de los
efluentes de la mina San Jos, mediante un proceso de biolixiviacin con la bacteria
Thiobacillus ferrooxidans
1.2 Objetivos Especficos.
Determinar el crecimiento de la poblacin microbiana durante el proceso de lixiviacin a
lo largo del tratamiento
Determinar la concentracin de Fe
+2
y el pH de la muestra a lo largo del tratamiento
Analizar la concentracin de los iones metlicos presentes y el crecimiento de la
poblacin microbiana respecto del tiempo

2. FUNDAMENTO TEORICO.

Recin a fines del presente siglo, de intenso desarrollo econmico-industrial y el afn desmedido
de industrializacin y crecimiento econmico, la humanidad ha comenzado a comprender las
alarmantes consecuencias de ignorar y soslayar la implementacin de medidas que permitan la
preservacin y conservacin del equilibrio natural de los ecosistemas de la Tierra.
En el presente proyecto, no solamente se pretende evitar mayores atentados a la calidad de suelo
y aguas, sino que, simultneamente, se considera el posible aprovechamiento de alguno de sus
productos, con lo que se podra disminuir aun ms, los efectos secundarios de la contaminacin.
2.1 Aguas de minas y problemtica ambiental.
La industria de explotacin minera es una de las actividades ms problemticas en todo el
mundo. La extraccin minera y su proceso son fuente de muchos contaminantes que estn
dispuestos en el ambiente, de ah la contaminacin del agua, el suelo y el aire. La exposicin de
los minerales sulfurosos al aire, agua, procesos microbianos y oxidacin produce drenaje cido
de mina, caracterizado por su alta acidez y alta cantidad de metales pesados disueltos. Cuando
esta agua contaminada alcanza los cuerpos del agua, las alteraciones del ecosistema de hecho
ocurrirn. La flora y la fauna pueden ser afectadas y los recursos hdricos pueden tornarse
dainos para el consumo humano o los propsitos agrcolas e industriales. Tambin la
infiltracin del drenaje cido de la mina puede contaminar suelos y el agua subterrnea.




2

2.1.1. Drenaje cido De Minas (Dam).

Drenaje cido de mina es el agua contaminada originada de la explotacin minera, ya sea
superficial o profunda, tpicamente de alta acidez, rica en sulfato y con niveles elevados de
metales pesados, principalmente hierro, manganeso y aluminio. Las concentraciones medidas del
drenaje de la mina de carbn se extienden a partir del 50 a 300 mgFe/L, 20 a 30 mgMn/L, 20 a
2000 Mg(SO
4
)
2
-/L, y 3,0 a 5,5 unidades estndares del pH.
El drenaje cido de la mina ocurre cuando los minerales del sulfuro se ponen en contacto con el
oxgeno y el agua, condiciones favorables para su oxidacin qumica o a la oxidacin rpida por
bacterias tales como Thiobacillus ferrooxidans.
La alta acidez de DAM es causada a menudo por la oxidacin de la pirita, la forma cristalina del
sulfuro del hierro (FeS). Como resultado de esa oxidacin, se genera el cido sulfrico dando
condiciones cidas a los efluentes de la mina. La mezcla de agua acida de mina con la de ros y
lagos provoca una degradacin grave de la calidad del agua natural porque tanto el acido como
los metales disueltos son txicos para la vida acutica, adems, esas aguas contaminadas no son
aptas para el consumo humano, ni para el uso industrial. La oxidacin de la pirita lleva, en
ltima instancia, a la formacin de acido sulfrico y de hierro ferroso y se pueden alcanzar
valores de pH tan bajos como 2. El acido formado ataca a otros minerales presentes en la roca
asociados con el carbn y la pirita, originando la degradacin de toda la estructura de la roca. El
aluminio, que es uno de los principales elementos formadores de rocas, es solo soluble a pH
bajo, con frecuencia el Al
+3
se encuentra en aguas acidas de las minas a concentraciones
elevadas, lo que puede ser toxico para los organismos acuticos.
El requerimiento de O
2
en la oxidacin de hierro ferroso a frrico explica en parte como se
desarrolla el drenaje acido de las minas. En tanto no se extraiga carbn, la pirita no se oxida,
pues ni el aire ni las bacterias pueden alcanzarla. Cuando se extrae el carbn entra en contacto
con Thiobacillus ferroxidans y con el O
2
, lo que hace posible la oxidacin de la pirita. El acido
que se forma puede filtrars e a los cursos de agua cercanos.

2.2 Mina San Jos.
El rea de estudio est ubicada en la mina San Jos, propiedad de la Empresa minera
Subsidiaria Oruro, EMSO-COMIBOL, cuyos yacimientos e instalaciones se encuentran la zona
oeste de la ciudad de Oruro, capital de la provincia Cercado y el departamento de Oruro; se halla
a 3706 msnm, entre 17 58 latitud sud y 67 5 longitud oeste y, a 230 Km. al sur de la ciudad
de La Paz.
La Mina San Jos se constituye de 4 secciones principales; Itos, Colorado, Santa Rita y
Machaca marca, cuenta con 43 concesiones de 1364 pertenencias. Los principales rubros de
explotacin son minerales de estao, plomo, plata, zinc y antimonio.
3

2.2.1 Efectos del drenaje acido en la ciudad de Oruro.
En particular la ciudad de Oruro sufre gradual deterioro en la estructura de sus terrenos y en la
composicin de los mltiples ojuelos freticos, como efecto de la alta acidez de suelos en el
rea urbana (pH < 4), especialmente en la zona central oeste de casco viejo al grado que ha
ocasionado la corrosin de tuberas de agua potable y el desgaste de los conductos de concreto
del alcantarillado establecindose fundamentalmente el origen, en la intensa evacuacin del
drenaje cido procedente de la Mina San Jos, a lo largo de toda su historia de explotacin y
ms aun durante las ltimas dcadas.
Se saba que continuaba la libre evacuacin de agua cida procedente del interior de la mina, en
caudal promedio casi constante en los ltimos aos, tanto en sequa como en das normales, -ms
o menos 15 litros por segundo, durante las 24 horas del da, representando cerca de 1300 m
3

diarios- hacia el centro urbano. Para el efecto, se dispone del Rio Copagira, un canal natural
abierto que se inicia con unos 500 metros a travs del barrio adyacente, donde inclusive se halla
el hospital; luego por medio de una canalizacin embovedad de concreto, se transporta el fluido
por zonas urbanizadas, hacia el norte, para finalmente verterlo en otro canal abierto a escasos
200 metros del Estadio Departamental, distribuyndose la evacuacin junto a residuos
domsticos recolectados en su trayecto, sobre extensas reas aledaas a los barrios marginales
del noroeste de la ciudad, donde se evapora y/o infiltra.
Sin embargo el curso del desage no se mantuvo como fue descrito ya que sufri diferentes
alteraciones por fines de explotacin, y como efecto de las corrientes fluviales, lo que se
evidencia en el deterioro del paisaje que presenta las laderas occidentales del Cerro San Jos,
especialmente en las adyacentes al casco viejo de la ciudad.
El drenaje cido procedente de San Jos, consiste en solucin acuosa muy cida, de PH mayor
a 1.5 y menor a 2.5, que contiene diferentes metales pesados como: Hierro, zinc, cobre y estao,
considerados de importancia toxicolgica, adems de, arsnico, plomo y algunos metaloides de
alto riesgo; todos en importante proporcin, constituyndose en conjunto, en un agente
contaminante y agresivo, que no ha merecido una adecuada atencin.
El flujo de agua cida es permanente y proviene de corrientes subterrneas que en contacto con
el cuerpo mineralizado de sulfuros y la accin de determinadas bacterias, provocan la alta
acidez, representando un riesgo en las actividades del interior de la mina como consecuencia de
la alta corrosividad, toxicidad y continua acumulacin, hacindose entonces necesaria su
eliminacin hacia la superficie, por bombeo forzado.
Una vez evacuado al exterior de la mina se observa que como consecuencia de la evaporacin
natural de disolvente, la superficie de las reas circundantes, queda cubierta con las diferentes
sales disueltas y en suspensin transportados por la corriente; en tanto que, por efecto de la
filtracin varios de estos contenidos se infiltran en los niveles freticos de un nmero
indeterminado de bolsones de agua diseminados en toda la zona, con el consiguiente riesgo de
contaminacin, si acaso no es evidente aun, provocando en conjunto la inutilizacin de tierras,
4

aspecto observado actualmente por la paulatina ausencia de vegetacin y pastoreo zonales,
independiente de su propia acidez y naturaleza arenisca. No obstante, la corriente de Copagira
se percola a travs de los suelos hasta alcanzar un nivel; la capa fretica o meseta de agua. De
esta capa fretica, el agua se mueve lentamente recorriendo el contorno de los suelos para en una
ltima instancia alcanzar la superficie como un manantial o un escurrimiento con contenido de
contaminantes.
Por otra parte, en aquellas reas urbanas afectadas por la constante infiltracin de agua de
Copagira, donde est ha coadyuvado en la corrosin de tubos y tuberas, existe el permanente
riesgo de mezclado entre flujos de agua potable y desechos lquidos de alcantarilla,
especialmente, cuando cesa el bombeo de la primera hecho que ocurre 4 horas diarias- efecto
que se observa en la calidad del agua potable en las primeras horas del da y las mltiples
filtraciones en calles y viviendas del centro de la ciudad, adems, de los consiguientes riesgos y
perjuicios adicionales.
El yacimiento de San Jos despus de 500 aos de explotacin deja como saldo un impacto
ambiental negativo de contaminacin a los recursos atmosfricos, terrestres e hdricos que
afectan a la poblacin, fauna y flora de la regin. La determinacin de daos se realiza a travs
de una auditora ambiental entre marzo de 1994 y abril de 1995, por la Swedish Geological AB y
COMIBOL.
2.2.2 El sistema de evacuacin del drenaje cido.
El drenaje cido de la Empresa Minera San Jos, tiene caudales promedio casi invariables
durante el ao y proviene de diferentes vertientes en interior mina. Para el efecto, se han
construido en los diferentes niveles de interior mina, 13 diques de recoleccin, en cada uno de
los cuales se rene el drenaje proveniente de los niveles inferiores y mediante 16 bombas
centrfugas, se impulsa hacia el exterior, a trabes de tuberas PVC de 4 in.
2.3 Ciclo del hierro
El hierro es uno de los elementos ms abundantes de la corteza terrestre. En la superficie de la
Tierra, el hierro se presenta en dos estados de oxidacin, ferroso Fe (+2) y frrico Fe (+3). El Fe
0

es producto de la actividad humana en la mezcla de menas de hierro ferroso o frrico para
obtener hierro fundido. En la naturaleza, por tanto, el ciclo del hierro se da entre las formas
ferrosa y frrica; la reduccin de Fe
+3
se da tanto qumicamente como a consecuencia de la
respiracin anaerbica, y, la oxidacin de Fe
+2
se produce tanto qumicamente como resultas de
una forma de metabolismo quimiolitotrofico.
El nico aceptor de electrones capaz de oxidar espontneamente Fe
+2
es el O
2
. A pH neutro se
facilita la produccin de precipitados de hierro frricos altamente insolubles, sin embargo a pH
bajos, el Fe
+2
es estable, lo cual permite el crecimiento de bacterias acidfilas oxidadoras de
hierro, como el Thiobacillus Ferroxidans.
5

En esas condiciones el ion frrico no precipita como hidrxido sino que forma un complejo sulfato
mineral llamado jarosita (HFe
3
(SO4)
2
(OH)
6
) que es un precipitado amarillento que le da ese color a las
aguas de mina, se lo llama tambin chico amarillo.
El potencial bioqumico colectivo de los microorganismos es enorme, es por ello que estos han
sido utilizados para ayudar a extraer minerales (lixiviado microbiano) y a recuperar el medio
ambiente (biorremediacin).
2.4 Biolixiviacin.
La biolixiviacin es una metodologa de solubilizacin de metales a partir de matrices complejas
utilizando la accin directa o indirecta de microorganismos. En el caso de los minerales
sulfurados de metales de transicin, los microorganismos ms frecuentemente usados son
bacterias quiomioautotrficas y mesfilas entre las que se destacan Acidithiobacillus
ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Acidithiobacillus caldus. Tambin se encuentran
asociadas a este proceso, clulas de Leptospirillum ferrooxidans. El uso de estas especies de
bacterias en aplicaciones industriales de esta metodologa, est asociado directamente a su
carcter de acidfilos y a los escasos requerimientos de nutrientes e infraestructura necesarios
(debido a que no requieren fuentes orgnicas de energa ni mantenimiento de temperaturas
elevadas) lo que permite que el proceso sea econmicamente factible para la recuperacin de
diferentes metales a partir de minerales.
Las especies correspondientes al gnero Acidithiobacillus son capaces de catalizar la oxidacin
de compuestos reducidos de azufre (como sulfuro, azufre elemental, tionatos, etc.) utilizando
oxgeno como aceptor electrnico y generando cido sulfrico como producto final.
La lixiviacin ("leaching processes") se realiza ya en grandes cantidades para la obtencin de
minerales a cielo abierto, probablemente podr utilizarse tambin en las minas. La forma ms
sencilla consiste en dejar que el agua se vaya filtrando a travs de gruesas capas del material
rocoso que contiene el mineral desmenuzado, por ejemplo con la pirita (FeS
2
), con los sulfuros
metlicos asociados a ella, como el Cu
2
S (chalcocita), CuS, ZnS, SNi, S
2
Mo, S
3
Sb
2
, CoS y PbS;
finalmente se recoge la disolucin que contiene las sales sulfatadas. A partir de ella se obtienen
los metales por procesos de concentracin y precipitacin.
En trminos ms globales, se puede decir que la biolixiviacin es una tecnologa que emplea
bacterias especficas para extraer un metal de valor como uranio, cobre, zinc, nquel y cobalto
presente en las minas o en un concentrado mineral. El producto final de la biolixiviacin es una
solucin cida que contiene el metal valor en su forma soluble.
Desde 1947 cuando Colmer y Hinckle aislaron y describieron al Thiobacillus ferrooxidans
(T.F.), principal microorganismo involucrado en la disolucin de sulfuros, se ha investigado en
el proceso de la lixiviacin bacterial de minerales en universidades y laboratorios, con la
6

intencin de encontrar aplicaciones industriales de los microorganismos en el beneficio de los
minerales.
2.5 Thiobacillus ferrooxidans
T. ferrooxidans presenta forma bacilar, gram negativa, de 0.5 a 1.7 , algunas cepas tienen
flagelos, es quimioautotrfico, capaz de oxidar compuestos inorgnicos como iones ferroso
Fe(II) y azufre, los que le sirven de fuente primaria de energa. El carbono necesario para su
arquitectura celular lo obtiene por fijacin de CO
2
, de manera similar a las plantas verdes (Ciclo
de Calvin-Benson). Es aerobio (requiere de O
2
como aceptor final de electrones), acidfilo
(desarrolla en rangos de pH que varan entre 1.5 y 3.0), y a temperaturas que oscilan entre 25-
35C. Es considerada como el
mayor contribuyente en la
produccin de aguas cidas que
drenan de depsitos de metales
sulfurados, gracias a la
capacidad que tienen de oxidar
minerales de disulfuro de hierro,
generando soluciones cidas por
la produccin de acido sulfrico.

2.5.1 Clasificacin del Thiobacillus ferrooxidans
Dentro del gnero Thiobacillus, la bacteria Thiobacillus ferrooxidans, es la ms importante tanto
por los estudios realizados sobre ella como, por ser la ms aplicada a nivel prctico, bien a escala
laboratorio, piloto o industrial.
En el catlogo de Bergeys Manual of Determinative Bacteriology se puede establecer la
siguiente clasificacin sistemtica:
Clase: Esquizomicetos
Orden: Pseudomonadales
Suborden: Pseudomonadineas
Familia: Thiobacteriaceas
Gnero: Thiobacillus
Especie: Ferrooxidans

En resumen:





Bacilo Gram (-)
Aerobio (O2)
Temp: 20C - 35C
Tamao: 0.5 - 0.17 micras
Habitat: aguas termales, fisuras
volcnicas y depsitos de sulfuros.
Quimiolitoauttrofo
Acidfilo (pH 1.5 3.0)

Procariota Unicelular
Solo tiene membrana citoplasmtica.
Protegida por Pared celular
Bacteria mvil
Pared multilaminar: Gram (-)
Reproduccin asexual : fisin binaria
No esporulado

7





2.5.2 Desarrollo Bacteriano
pH: los T. ferrooxidans, desarrollan bien en medios cidos, siendo incapaces de desarrollar
sobre Fe
+2
a un pH mayor de 3.0. Normalmente los valores sobre los que los tiobacilos se
desarrollan se ubican dentro del rango de 1.5 a 2.5.
Oxgeno y CO
2
: Estudiando el efecto del CO
2
sobre la actividad bacterial, ha sido observado
que la velocidad de oxidacin de la pirita por TF gradualmente disminuye cuando se elimina
el dixido de carbono del aire usado para la aireacin. Aumentando en contenido de dixido
de carbono del aire se estimula al crecimiento del TF usando in ferroso como sustrato.
Nutrientes: Como todos los seres vivientes, T. ferrooxidans requiere de fuentes
nutricionales para su ptimo desarrollo, entre las que tenemos fuente de N
2
(amonio), de
fosfato, de S, iones metlicos (como Mg
+
), etc. El magnesio, es necesario para la fijacin de
CO
2
y el fsforo es requerido para el metabolismo energtico. Los medios de cultivo
empleados presentan estos requerimientos, siendo los ms importantes el 9K y el TK. El TF
sintetiza sus materiales celulares a partir de fuentes inorgnicas tales como sulfato de
amonio, fosfato cido de potasio (como fuente de nitrgeno y fosfato), cloruro de potasio,
sulfato de magnesio y nitrato de calcio por fijacin del C0
2
del ambiente.
Fuente de Energa: Los T. ferrooxidans utilizan como fuente primaria de energa los iones
ferroso y azufre inorgnico. El hierro ferroso debe ser suplementado al medio cuando se trata
de medios sintticos. En caso de utilizar mineral, no es necesario aadir Fe
+2
.
Luz: La luz visible y la no filtrada tienen un efecto inhibitorio sobre algunas especies de
Thiobacillus, pero el hierro frrico ofrece alguna proteccin a los rayos visibles.
Temperatura: El rango sobre el cual se desarrollan se encuentran entre 25C y 35C. La
temperatura ptima para el crecimiento del TF ha sido encontrada en el rango de 25C a
45C. Para la oxidacin de Fe
2+
los valores ptimos reportados estn en el rango de 28C y
35C. La oxidacin biolgica cesa alrededor de 50C y a temperaturas mayores solamente la
oxidacin qumica ocurre. Una temperatura mnima no ha sido establecida para el
crecimiento del TF, pero est generalmente aceptado que la actividad bacterial cesa en el
punto de congelacin de los medios de cultivo.
Presencia de Inhibidores: En los procesos de molienda o por accin propia del agente
lixiviante se liberan algunos iones que en ciertas concentraciones resultan txicas para las
bacterias ferrooxidantes afectando el desarrollo bacterial. La literatura seala que los niveles
de tolerancia de las bacterias para ciertos metales es Zn
+2
= 15 -72 g/l; Ni
+2
= 12 - 50 g/l;
Cu
+2
= 15 g/l; Ag
+
= 1 ppm; UO
2
+2
= 200 - 500 mg/l, entre otros.

2.6. Metodologa de pre-enriquecimiento, aislamiento y cultivo.
El medio seleccionado para el pre-enriquecimiento y el posterior aislamiento fue el medio 9K de
Silverman y Lundgren por cuanto la literatura lo describe como el adecuado para el crecimiento
de este tipo de bacterias.
8


a) Pre-enriquecimiento
Medio 9k Liquido









Ajustado a pH = 1.5 con H
2
SO
4
y se esteriliz en autoclave a 121 libras de presin por 15
minutos

b) Aislamiento
Medio 9k Slido
En la preparacin del medio 9K slido se generaron dos soluciones.
Solucin A








Ajustado
a pH = 1.9 con H
2
SO
4,
esterilizado en autoclave a 121 libras de presin por 15 minutos y
filtrado antes de su uso

Solucin B






Ajustado a
pH = 1.9 con H
2
SO
4


Solucin final 9k slida
Cantidad Sustancia Composicin Qumica
700 ml
0.025 gr
0.1 gr
0.01 gr
0.025 gr
9 gr
Agua destilada
Sulfato de amonio
Cloruro de potasio
Fosfato cido de potasio
Sulfato de magnesio heptahidratado
Sulfato Ferroso heptahidratado
H
2
O
(NH
4
)
2
SO
4

KCl
K
2
HPO
4

MgSO
4
*7H
2
O
FeSO
4
*7H
2
O
Cantidad Sustancia Composicin Qumica
210 ml
1.75 gr
0.061 gr
0.031 gr
0.029 gr
0.095 gr
Agua destilada
Sulfato de amonio
Cloruro de potasio
Fosfato cido de potasio
Sulfato de magnesio heptahidratado
Sulfato de Calcio
H
2
O
(NH
4
)
2
SO
4

KCl
K
2
HPO
4

MgSO
4
*7H
2
O
CaSO
4

Cantidad Sustancia Composicin Qumica
290 ml
12 g
37.3 gr

Agua destilada
Agar Agar
Sulfato Ferroso heptahidratado
H
2
O

FeSO
4
*7H
2
O
9

Mezclar soluciones A y B para luego llevarlas a ebullicin. Posteriormente servir en cajas
Petri 15 ml de medio y dejar enfriar

c) Cultivo
Es necesaria una solucin preparada o natural de minerales ferrosos tales como la pirita,
como sustrato para el desarrollo de la poblacin bacteriana.

3. METODOS DE ANLISIS
Anlisis para determinacin de Fe (II)
Para analizar Fe (ll) se utilizo 40 ml de cultivo y se aadi 20 ml de solucin de Zimmermann
Reinhard para la posterior determinacin por medio de titulacin. Para esto se utilizo como
titulante el KMnO
4
de concentracin 0.05 M.
Determinacin de la poblacin bacteriana
Realizaremos un conteo directo de las bacterias empleando un porta objetos especial
denominado Cmara de Newbauer con la ayuda de un microscopio.

4. MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales

tem Material Dimensin Cantidad
1 Matraz aforado con tapa 250 ml 2
2 Matraz aforado con tapa 500 ml 2
3 pH-metro digital 1
4 Papel pH 6
5 Probeta graduada 1000 ml 1
6 Probeta graduada 100 ml 1
7 Vidrio reloj 1
8 Recipiente de plstico 2 lt 1
9 Vasos de precipitado 100 ml 2
10 Vasos de precipitado 1000 ml 2
11 Pipeta Graduada 10 ml 1
12 Pipeta Graduada 0.1 ml 1
13 Propipeta 1
14 Varilla de vidrio 1
15 Esptula 1
16 Cepillo 1
17 Microscopio 1
18 Cmara de Newbauer 1
19 Cubreobjetos 3
20 Portaobjetos 3
10

21 Bureta 1
22 Soporte Universal 1
23 Pinza Nuez 1
24 Balanza de precisin 1
25 Autoclave 1
26 Cajas Petri 6
27 Incubadora 1
28 Tubos de ensayo con tapa 7
29 Gradilla 1
30 Papel Madera 1 Hoja
31 Bolsas de plstico 2
32 Hornilla de gas 1
33 Garrafa de GLP 1
34 Campana de flujo laminar 1
35 Hornilla elctrica 1


Reactivos
tem Reactivo Frmula Cantidad
1 Agua destilada H
2
O 1000 ml
2 Sulfato de amonio (NH
4
)
2
SO
4
1.75 g
3 Cloruro de potasio KCl 0.12 g
4 Fosfato cido de potasio K
2
HPO
4
0.05 g
5 Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO
4
*7H
2
O 0.05 g
6 Sulfato Ferroso heptahidratado FeSO
4
*7H
2
O 18 g
7 Agar Agar 3 g
8 Sulfato de Calcio CaSO
4
0.1 g
9 Permanganato de Potasio KMnO
4
3.951 g
10 cido Sulfrico HCl 18 ml
11 Acido fosfrico H
3
PO
4
18 ml
12 Sulfato manganoso MnSO
4
H
2
O 7.15g

5. TOXICOLOGA.

Sulfato de amonio
Usos recomendados y restricciones de uso: Industria agropecuaria fertilizante.

Aplicaciones industriales: manufactura de especialidades de fertilizantes, mezclas frigorficas,
curtido de pieles.
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Condiciones a evitar: calor, humedad y sustancias incompatibles.

Incompatibilidad con otras sustancias: hipoclorito de sodio, potasio + nitrato de amonio, clorato de
potasio, polvo de sodio potasio + nitrato de amonio y otros oxidantes fuertes. Ligeramente reactivo
a reactivo con agentes oxidantes. Corrosivo al cobre, bronce, metales frreos y aleaciones. Muy
ligeramente a ligeramente reactivo con metales, lcalis, humedad. No es reactivo con agentes
reductores, materiales combustibles, materia orgnica, cidos.

Mutagenicidad en clulas germinales: no mutagnico
Carcinogenicidad: no cancergeno
Toxicidad para la reproduccin: no txico para la reproduccin
Toxicidad sistmica especfica de rganos diana

Ortofosfato de potasio trihidratado
Evite la contaminacin de alcantarillas y cursos de agua. No se esperan productos de egradacin
peligrosos a corto plazo. Sin embargo, pueden formarse productos de degradacin a largo plazo. Ni
el producto en s ni sus productos de degradacin son txicos.
El lquido debe recogerse evitando el contacto con la piel. El rea debe lavarse con agua, si es
posible. El material debe disponerse de acuerdo las regulaciones existentes. No incinerar, cortar ni
soldar los contenedores vacos. Cuando se descarta este producto constituye un desecho txico.
Debe transferirse a recipientes adecuados para su recuperacin o disposicin.
Sulfato de magnesio heptahidratado
Peso molecular=246.48 g/mol
Reagente analtico
Informacin toxicolgica
Toxicidad aguda:
DLLo oral ratn: 5000 mg/kg (referido a la sustancia anhidra)
Efectos peligrosos para la salud:
No son de esperar caractersticas peligrosas.
Observar las precauciones habituales en el manejo de productos qumicos.
Riesgo para el medio acutico = Bajo
Riesgo para el medio terrestre = Bajo
Otros posibles efectos sobre el medio natural:
Manteniendo las condiciones adecuadas de manejo no cabe esperar problemas ecolgicos.

Sulfato de calcio hidratado
Llevar ropa de trabajo lavada regularmente. Las personas con antecedentes de sensibilizaciones
cutneas deben adoptar precauciones en la manipulacin de este producto
12


No hay ningn dato disponible sobre el producto. Puede provocar obstruccin estomacal en caso de
ingestin. Puede provocar tambin una irritacin de las mucosas oculares y en vas respiratoria

El sulfato de calcio se trata de un compuesto natural que no representa ningn riesgo para el
medioambiente
Cloruro de potasio
Peso molecular=74.558 g/mol
Es un producto altamente higroscpico. Existen dos tipos de Cloruro de Potasio, standar y
granulado cuya diferencia es la granulometra (el standar contiene ms partculas pequeas
que el granulado). La sustancia ingresa al organismo a travs de la va inhalatoria, ingestiva y la
piel. Puede afectar el sistema respiratorio. Sntomas se pueden presentar despus de exposicin.
Solo para uso en laboratorio. No usar para otros fines o en casa
Estable e condiciones normales de manipulacin y almacenamiento.
La inhalacin del polvo y el contacto con la piel o los ojos puede causar irritacin. La ingestin
puede causar efectos adversos sobre la salud.
Este material puede irritar piel y ojos.
Agar agar

Insoluble en agua fra y soluble en agua caliente
Gel firme de 34 a 40C. No refundir hasta no superar los 85C
Se considera inocua. El organismo no es capaz de absorberla por lo que en gran cantidad puede
volverse laxante.
Puede usarse sin lmite de cantidad en alimentos

cido sulfrico

Cncer: No existe informacin acerca de la generacin de cncer por causa directa del contacto con
cido Sulfrico y por esta razn organismos de vigilancia de la salud de la poblacin en otros
pases no lo han clasificado como cancergeno por s solo.

Efectos genotxicos: Directamente el cido Sulfrico no es una sustancia que cause mutaciones
celulares; sin embargo, si existen posibilidades de generacin de anormalidades a nivel celular en
linfocitos humanos por causa del pH Acido que puede inducir la presencia de esta sustancia.

Sulfato de hierro heptahidratado

Peso molecular=278.02g/mol
Por inhalacin: irritaciones
13

En contacto con la piel: irritaciones
Por contacto ocular:irritaciones
Por ingestin: Irritaciones en el aparato digestivo
Precauciones habituales en el manejo de productos qumicos.

Informacin Ecolgica
Movilidad:
Ecotoxicidad: 12.2.1 - Test EC50 (mg/l):
Clasificacin: Extremadamente txico.
- Medio receptor: Riesgo para el medio acutico
Medio Riesgo para el medio terrestre Bajo

Sulfato de manganeso hidratado
Peso molecular=169.01g/mol
Carcinogenicidad: No existe informacin disponible
Epidemiologa: No existe informacin disponible
Teratogenicidad:No existe informacin disponible
Neurotoxicidad:No existe informacin disponible
Ecotoxicidad: Peligroso para la vida acuatica
Permanganato de potasio

Peso molecular=158.04g/mol
Solubilidad:65g/l
Pto fusion:50CCarcinogenicidad:
No existe informacin al respecto
Mutagenicidad:
Se ha informado de un pequeo incremento de aberracin cromosomal en cultivos de clulas de
mamferos.
El KMnO
4
slido es un oxidante muy fuerte, que mezclado con glicerina pura provocar una
reaccin fuertemente exotrmica. Reacciones de este tipo ocurren al mezclar KMnO
4
slido con
muchos materiales orgnicos. Sus soluciones acuosas son bastante menos peligrosas, especialmente
al estar diluidas. Mezclando KMnO
4
slido con cido sulfrico concentrado forma Mn
2
O
7
que
provoca una explosin. La mezcla del permanganato slido con cido clorhdrico concentrado
genera el peligroso gas cloro.
El permanganato mancha la piel y la ropa (al reducirse a MnO
2
) y debera por lo tanto manejarse
con cuidado. Las manchas en la ropa se pueden lavar con cido actico. Las manchas en la piel
14

desaparecen en 48 horas. Sin embargo, las manchas pueden ser eliminadas con un sulfito o bisulfito
de sodio.
Acido orto fosfrico
Provoca quemaduras. En caso de contacto con ojos o piel lavar inmediatamente con agua
El anin fosfato es un componente esencial del cuerpo humano, normal- mente se ingieren entre 1g
y 2 g de fsforo por persona al da. La exposicin laboral al cido fosfrico no contribuye de
manera significativa a la cantidad total de fsforo en el organismo. Los peligros asociados con la
exposicin cido fosfrico dependen fundamental-mente de su carcter cido, y la toxicidad est
ntimamente relacionada con la concentracin. El cido fosfrico con-centrado es corrosivo y en
cantidades menores es irritante para la piel, los ojos y las membranas mucosas de la cavidad oral,
respiratoria y el tracto gastrointestinal.
Hay una ausencia de datos sobre los efectos que produce la inhalacin de cido fosfrico (mayor
que para el pentxido de fsforo) que nos permita determinar con mayor precisin el nivel umbral
de irritacin o una evaluacin de los efectos que produce una exposicin prolongada a bajas
concentraciones de dicho cido


6. DIAGRAMA DE FLUJO

15

Inicio
Determinar concentracin inicial de
Hierro (Fe 2+)
Fin
Inocular t. ferroxidans en la muestra
original
Calcular concentracin celular de t.
ferroxidans y concentracion de iones
Fe 2+
Agua residual mina
San Jos (Oruro)
Incubar durante una semana
Pre-enriquecimiento con
solucin 9K
Aislamiento de cepas de
Thiobacillus ferrooxidans
Mtodos de anlisis
Concentracin celular: [Bacterias/ ml]
Concentracin de Fe 2+: [M]



Pre enriquecimiento con solucin 9K


16

Transferir a matraz de 250 ml
Ajustar el pH a 1.9 con H2SO4
Incubar a 35C durante 48 horas en
oscuridad
Fin
Pre-enriquecimiento con
solucin 9K
Tomar alcuota de 10
ml de muestra
Preparar 90 ml de medio liquido 9K
10 ml muestra + 90 ml 9K
250 ml H2O
0.025 g (NH4)2O4
0.1 g KCl
0.01 g K2HPO4
0.025 g MgSO4*7H2O
9g FeSO4*7H2O
Cultivo pre-enriquecdo















Aislamiento de cepas Thiobacillus ferroxidans


17

Colocar 20 ml de agar 9K en cajas
Petri
Fin
Incubar a 35C durante 48 hrs.
Aislamiento de cepas de
Thiobacillus ferrooxidans
Cultivo pre-
enriquecdo
75 ml H2O
13 g Agar agar
9 g FeSO4*7H2O
50 ml solucin 9K
0.095 g CaSO4
Preparar medio de cultivo selectivo
9K slido
Ajustar el pH a 1.9 con H2SO4
Distribuir uniformemente una
alcuota de 1 ml de cultivo de pre
enriquecimiento sobre cajas Petri
75 ml H2O
13 g Agar agar
9 g FeSO4*7H2O
50 ml solucin 9K
0.095 g CaSO4














Mtodos de anlisis


18

Mtodos de anlisis
Cultivo pre-
enriquecdo
Preparar solucin de KMnO4 0.05M
Preparar reactivo de Zimmermann
Reinhard (ZR)
700 ml H2O
50 g MnSO4
125 ml H2SO4
125 ml H3PO4
Realizar titulacin
Titulante: KMnO4
Analito: 40 ml Cultivo pre-
enriquecido + 20 ml ZR
Volumen utilizado de KMnO4
Titulacin Recuento en microscopio
Tomar una alcuota de cultivo pre-
enriquecido y colocarla sobre placa
Neubauer
Ajustar objetivo
Realizar recuento
Bacterias / Area
Fin

7. CLCULOS.
7.1 Determinacin concentracin Fe
+2

El Fe
3+
obtenido de la accin de la bacteria thiobacillus ferrooxidans es coloreado (amarillo), lo cual
es un problema que puede provocar errores a la hora de identificar el punto final.
Este problema se resuelve mediante el mtodo de Zimmermann-Reinhard (ZR), que consiste en
aadir a la disolucin, cantidad suficiente del reactivo de ZR. Este reactivo contiene cido sulfrico,
que nos proporciona la acidez necesaria, sulfato de manganeso, que disminuye el potencial redox del
sistema MnO
4
-
/Mn
2+
impidiendo la oxidacin del cloruro a cloro, y cido fosfrico, que forma con
el Fe
3+
que se forma en la reaccin volumtrica un complejo incoloro (permitiendo detectar
fcilmente el Punto Final) y simultneamente disminuye el potencial del sistema Fe
3+
/Fe
2+
,
compensando la disminucin del potencial del sistema MnO
4
-
/Mn
2+
. La reaccin volumtrica ser
pues:

Y mediante las siguientes formulas calculamos las concentraciones del ion metlico:

19

Sabiendo que se utilizo 40 ml de cultivo.
[

Da V KMnO
4
(ml) mmol Fe
+2
Concentracin Fe
+2
(mM)
1 8.9 2,225 46,01
2 8.1 2,025 42,09
3 7.7 1,925 40,36
6 7.2 1,800 38,13
7 6.9 1,725 35,78
10 6.9 1,725 35,78

Grfica 1. Concentracin Fe
+2
(mM) vs. Tiempo (das)










7.2 Determinacin poblacin bacteriana
Tal como se describe en los mtodos de anlisis se realizo un conteo directo utilizando el
microscopio y la cmara de Neubauer.
Los resultados del clculo de la poblacin bacteriana sern expresados de dos formas:
a) Nmero de bacterias / rea rejilla
b) Nmero de bacterias / ml de muestra


30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

F
e
+
2

(
m
M
)

Tiempo (das)
Concentracin vs. tiempo
20

Para lo que se utilizaron los siguientes valores pertenecientes a la cmara de Newbauer:



Adems el conteo se realiz tomando en cuenta 9 cuadriculas representativas de las 25 segn la
siguiente disposicin:







Para ambas formas de representar los resultados, sacamos un promedio de las cuadriculas y este se
multiplica por 25 (nmero total de cuadriculas), el resultado obtenido se divide entre el parmetro de
referencia (rea de rejilla o volumen de muestra).
Bacterias/unidad de rea = promedio*25/ 1 mm
2
Bacterias/unidad de volumen = promedio*25/ 0.02 mm
3
= promedio*25*1000/ 0.02 ml
Los datos obtenidos en laboratorio fueron:
Cuadricula
Nmero de bacterias
Da 1 Da 2 Da 3 Da 6 Da 7 Da 10
1 1 4 8 3 0 3
2 2 8 5 2 0 1
3 3 6 4 5 1 1
4 4 2 3 5 1 2
5 5 1 3 3 1 1
6 6 3 2 4 1 1
7 7 2 11 6 3 0
8 8 2 6 5 2 0
9 9 3 8 3 0 1
Promedio 5,0 3,4 5,6 4,0 1,0 1,1

Cmara de Newbauer
rea rejilla = 1mm
2

Profundidad concavidad = 0.02 mm
Nmero de cuadriculas = 25
21





Grfica 2. Poblacin bacteriana vs. Tiempo (das)










7.3 Variacin del pH en funcin del tiempo
Se realizaron medidas del pH cada vez que se realizaron las titulaciones y el conteo con el
microscopio obteniendo los siguientes valores:
Grafica 3. Variacin del pH vs. Tiempo (das)
Da pH
1 2.3
2 2
3 2
6 2
7 2,5
10 3




Resultados
Bacterias/mm
2
125,0 86,1 138,9 100,0 25,0 27,8
Bacterias/mm
3
de muestra 6250,0 4305,6 6944,4 5000,0 1250,0 1388,9
Bacterias/ml de muestra 6,3E+06 4,3E+06 6,9E+06 5,0E+06 1,3E+06 1,4E+06
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N

b
a
c
t
e
r
i
a
s

Das
N bacterias vs. Tiempo
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
p
H

Das
pH vs. Tiempo
22


Recomendaciones?
Estudiar el aprovechamiento adecuado de la actividad bacteriana natural, como alternativa tcnica
para restringir la evacuacin de estos licores contaminantes, al medio ambiente circundante a la
indicada mina, hasta alcanzar niveles tolerables de hierro en aguas superficiales
8. ANLISIS DE RESULTADOS
La grafica 1, muestra la variacin de la concentracin de Fe
+2
en el tiempo, donde se puede
ver la como esta disminuye rpidamente desde 46.01 mM con el paso de los das (gran
actividad por parte de thiobacillus ferrooxidans), llegando a un valor constante de 35.78 mM
en el 7 da, indicando as el cese de la actividad bacteriana en la muestra de anlisis
La grafica 2, muestra la variacin estimada de la poblacin de microorganismos en el
tiempo, donde se puede ver como esta crece en los primeros das; sin embargo cuando se
supone que la actividad bacteriana haba terminado, aun se observaron individuos de t.
ferrooxidans al microscopio, este debido a que mediante este mtodo de conteo no se pueden
diferenciar si las bacterias estn vivas o muertas, por lo que las interpretaciones acerca de
estos valores estn sujetos a un error discutible y significativo
La grafica 3, nos muestra como varia el pH a lo largo del proceso, es evidente que cuando
los microorganismos entran en actividad hay ligero descenso del pH debido a la produccin
de mas acido sulfrico, que resulta de las reacciones de degradacin de los minerales
presentes en el agua de mina, ahora catalizadas por las bacterias. Ms evidente es aun que a
partir del 7 da existe un aumento en el valor del pH, el que segn la bibliografa, es un
factor determinante que influye de forma significativa en su velocidad de crecimiento,
debido a que afecta a los grupos ionizables presentes en las enzimas, situadas en el
citoplasma y periplasma de la clula (Das et al., 1997; Das et al., 1998; Gmez y Cantero,
2005). este aumento en el pH pudo deberse a factores como: i) El consumo de protones
generado principalmente la disolucin de monosulfuros como calcopirita, esfalerita y galena
(Garca et al., 1995; Da Silva, 2004; Ballester, 2005); ii) Tanto al consumo inicial de H
+
propio de la actividad metablica de las bacterias, como al consumo de H
+
durante la
reaccin de oxidacin del Fe
2+
proveniente de la disolucin superficial del sustrato
(Tuovinen et al., 1971; Natarajan et al., 1994; Fowler et al., 1999; Sampson et al., 2005).

9. CONCLUSIONES.
Se logr disminuir la cantidad de hierro (II) presente en muestras de agua proveniente de las
efluentes de la mina San Jos en un 12% aproximadamente
Se determin el crecimiento de la poblacin microbiana a lo largo del tratamiento de
biolixiviacin, en funcin del tiempo, se lo determino mediante conteo directo usando un
microscopio y cmara de Neubauer
23

Determinamos la concentracin de Fe
+2
mediante permanganimetras y el pH de la muestra a
lo largo del tratamiento para determinar el comportamiento de las bacterias en la muestra
El hierro, una vez transformado cuantitativamente en Fe2+, puede valorarse con KMnO4:

Sin embargo el Fe3+ es coloreado amarillo y dificulta la deteccin del punto final.
Esta dificultad se resuelve mediante el mtodo de Zimmermann-Reinhard (ZR), que consiste
en aadir a la disolucin ya reducida, cantidad suficiente del reactivo de ZR. Este reactivo
contiene cido sulfrico, que nos proporciona la acidez necesaria, sulfato de manganeso, que
disminuye el potencial redox del sistema MnO4-/Mn2+ impidiendo la oxidacin del cloruro
a cloro, y cido fosfrico, que forma con el Fe3+ que se forma en la reaccin volumtrica un
complejo incoloro (permitiendo detectar el Punto Final) y simultneamente disminuye el
potencial del sistema Fe3+/Fe2+, compensando la disminucin del potencial del sistema
MnO4-/Mn2+. La reaccin volumtrica ser pues:

El Punto Final viene marcado nuevamente por el primer exceso de KMnO4 que teir de
rosa la disolucin.
El volumen de permanganato de potasio utilizado en la titulacin es inversamente
proporcional a la concentracin de Fe
+2
presente en la solucin.
La oxidacin biolgica del in ferroso y de los sulfuros incluye movimientos de iones de
hidrgeno, as como de electrones. Por lo tanto, el pH tiene un efecto importante sobre el
metabolismo de la bacteria.
10. RECOMENDACIONES
Se recomienda usar mayor cantidad de agar-agar en la preparacin de Agar 9K a la
establecida en la bibliografa, de tal manera que el medio de cultivo cuaje con una solidez
mayor para aadir la solucin enriquecida con 9K Silverman y Lundgren.
Incubar al caldo con microorganismos por lo menos 2 semanas para tener mejores
resultados.
Tener mucho cuidado en manipular los reactivos para evitar accidentes.
Limpiar con un papel desechable los objetivos del microscopio antes de su uso para evitar
errores en la medicin de cuantificacin de microorganismos
En la solucin liquida del medio de cultivo con 9K Silverman y Lundgren debe tener menor
cantidad de agua, se recomienda reducir para que este no sea muy acuoso.
24

La campana de flujo laminar es un instrumento de laboratorio muy delicado y peligroso para
la salud, este debe ser manipulado por una persona que este calificada.
Se puede utilizar la cmara de PetroffHauser para el recuento de microorganismos y para
ver con mayor claridad se debe utilizar el objetivo x100.
Se debe estudiar el aprovechamiento adecuado de la actividad bacteriana natural, como
alternativa tcnica para restringir la evacuacin de estos licores contaminantes, al medio
ambiente circundante a la indicada mina
Para la determinacin de la concentracin de Fe
2+
se recomienda la utilizacin de equipos
ms sofisticados como ser el espectrofotmetro para obtener valores ms precisos.
En Bolivia es necesaria la investigacin para el desarrollo de la tecnologa de biolixiviacin
para tratar todos los efluentes metalrgicos, esto cambiar radicalmente la minera.

9. BIBLIOGRAFIA.
Orrantia, Erasmo. 1997. Aislamiento y caracterizacin de cepas de Thiobacillus ferrooxidans
con alta resistencia a arsnico y su utilizacin en la recuperacin de oro a partir de
concentrados de pirita y arsenopirita. Tesis como requisito parcial para obtener el grado de
Doctor en Ciencias con especialidad en Biotecnologa. Universidad Autnoma De Nuevo
Len. Facultad De Ciencias Biolgicas
Pgina web: http://www.monografias.com/trabajos73/determinacion-hierro-mineral-
dicromato-potasio/determinacion-hierro-mineral-dicromato-potasio.shtml#ixzz30L13oaMZ
visitado el 28 de abril de 2014 a horas 21:27
Brock. Biologia de los microorganismos. Pearson Prentice Hall. Decima edicin. 658 663
p.
Lucia Constanza Corrales, Ligia Consuelo Snchez, Paula Snchez Cortes, Alba Snchez
Len, Viviana Snchez Quintero, Julieth Zrate Daz. 2006. Estudio piloto de aislamiento y
fenotipificacin de bacterias que participan en los procesos de biolixiviacin, en las zonas
mineras del Departamento de Boyaca. Programa de Bacteriologa y Laboratorio Clnico,
Facultad Ciencias de la Salud, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Disponible en:
http://sjss.universia.net/pdfs_revistas/articulo_249_1342182563734.pdf. Consultado el 3 de
junio de 2014.
Volumetras redox, Permanganimetras. Disponible en: www.analytica-2-
0.com/fotos/permanga/Practicafotospermanga2.htm. Consultado el 5 de junio de 2014.




25
















ANEXOS

Materiales y reactivos


26


Muestra de agua residual mina San Jos






27

Enriquecimiento con solucin 9K lquido



Preparacin de solucin 9K slido


Esterilizacin de materiales en la autoclave Inoculacin de muestra

28


Titulacin con permanganato de potasio


Recuento de Thiobacillus ferrooxidansen microscopio