TRABAJO PRCTICO N 3.

Propiedades generales de las Enzimas.

Objei!os"
Establecer diferencias entre catalizadores inorgnicos y orgnicos.
Estudiar algunas de las propiedades generales que presentan las enzimas.

I.# A$i!idad E%perimenal" A$$i&n del $alor sobre $aalizadores inorg'ni$os (
org'ni$os.
E%perien$ia N). Caalizadores Inorg'ni$os.
Prepare dos tubos de ensayo con 2ml de agua y unos mg de MnO
2.
Hierva el contenido de
uno de ellos durante medio minuto y delo enfriar.
!uando llegue a la temperatura ambiente" agregue a ambos tubos #ml de una soluci$n de
H
2
O
2
y observe el efecto. %note los resultados.
E%perien$ia N *. Caalizadores Org'ni$os.
&!%'%(%)%)


*iluya #ml de sangre en #+++ml de agua destilada. 'ome dos tubos de ensayo y en cada
uno vierta 2 ml de esta disoluci$n.
!aliente el contenido de uno de ellos ,asta ebullici$n y delo enfriar a temperatura
ambiente. (uego a ambos tubos agrgueles # ml de soluci$n de H
2
O
2
y observe el efecto.
%note los resultados.
&PE-O./*%)%).
!orte dos trozos peque0os de papa y coloque cada uno en un tubo de ensayo" c1bralos con
agua.
Hierva uno de ellos durante 2 minutos y luego delo enfriar.
%0ada a ambos tubos 2 ml de soluci$n de fenol al #3 y ag4telos.
%gregue 2 gotas de H
2
O
2
a cada uno" delos en reposo y observe a los 2 minutos. Escriba
los resultados.
II.# A$i!idad e%perimenal" +ele$i!idad de las enzimas ( e,e$o de la empera-ra
sobre la sa$arasa.
E%perien$ia N ). Oben$i&n de la +a$arasa de la .e!ad-ra.
!oloque #+ gr. de levadura de panader4a en un mortero y a0ada 2 gr. de arena" agregue #+
ml de tolueno. Macere la mezcla y a0ada 5+ ml de agua en porciones de 5ml agitando la
mezcla continuamente.
*urante #2 minutos agite la mezcla ocasionalmente y centrifugue de 2 a#+ minutos.
E%perien$ia N *. +ele$i!idad de la enzima ( e,e$o de la Tempera-ra.
Pipetee el l4quido sobrenadante que puede ser claro o lec,oso.
*isponga de cuatro tubos de ensayo tal como se se0ala en el siguiente cuadro6
/ 0E T1BO .231I0O
+OBRENA0ANTE
0E .E4A01RA
B155ER
ACETATO
p6 787
+O.1CI9N
0E
+ACARO+A
):
+O.1CI9N
0E
A.;I09N
):
# 7ml #ml 888888 88888
2 7ml #ml 7ml 88888
7 7ml #ml 88888 7ml
9 7ml ,ervidos
por 2 min.
#ml 7ml 88888

%0ada al tubo :#" 7ml de agua. Mezcle bien el contenido de los tubos y delos en reposo a
temperatura ambiente por 7+ minutos.
Aj-se el p6 de $ada -bo a medio al$alino agregando <8=ml de NaO6 )N.
-ealice con cada tubo una prueba de benedict. Observe y anote los resultados.
E%perien$ia N 3. Pr-eba de Benedi$.
%0ada a los tubos anteriores 2 ml del reactivo de ;enedict" agite y caliente en un ba0o de
agua ,irviente durante 2 minutos. Observe e interprete los resultados.
III.# A$i!idad E%perimenal" E,e$o de la Con$enra$i&n de Enzimas.
E%perien$ia N). E%ra$$i&n de la Bromelina.
!oloque un trozo de pi0a en la licuadora y acci$nela durante 2 minutos.
Pase la mezcla obtenida a travs de un liencillo.
%gregue al ugo obtenido unas gotas de roo de metilo <apartando antes unos 9ml= y luego
gota a gota soluci$n de amon4aco ,asta pH 58> <comprobar con papel indicador=.
E%perien$ia N *. E,e$o de la $on$enra$i&n de la enzima.
*isponga de > tubos de ensayo tal como se se0ala en el siguiente cuadro6
/ 0E T1BO A>1A
JUGO
# 88888 2ml de ugo puro
2 2ml 2ml a pH 58>
7 2ml 88888
9 2ml 88888
2 2ml 88888
5 2ml
> 2ml
*el tubo : 2" tome 2ml y pselos al tubo : 7" mezcle bien y repita la operaci$n con el tubo
: 7 y 9" y as4 sucesivamente ,asta llegar al tubo : > que debe tener solamente 2ml de agua.
%0ada a cada tubo 7ml de lec,e" mezcle bien y anote el tiempo.
Observe ,asta aparici$n de los primeros grumos. !alcular la diluci$n de cada tubo.
Haga una grfica utilizando como datos los ml de la enzima y el tiempo de la aparici$n de
los grumos . Presente la grfica en el informe.
Pr'$i$a N? 3. .ECT1RA CO;P.E;ENTARIA
(a 'ripsina <E.!. 7.9.2#.9.= forma parte de un grupo de enzimas ?serina proteasas@.
)e llaman as4 por tener una )erina en el sitio activo" serina que es esencial para la actividad
de la enzima.
En este grupo de enzimas" adems de la 'ripsina" se consideran entre otras" la
Auimotripsina <E!. 7.9.2#.#.=" la Blastasa <E.!. 7.9.2#.##.=" la 'rombina <E.!. 3.4.21.5.),
la )ubtilisina <E.!. 7.9.2#.#9.=" as4 como enzimas que no son propiamente proteol4ticas"
como la fosforilasa <E.!. 2.9.#.#"= y la Cosfatasa %lcalina <li!. 7.#.7.#.=.
(a 'ripsina ,idroliza pptidos" amidas" steres" etc." en las uniones que involucran
al grupo carboDilo de (8%rginina o (8(isina. Es una proteasa de las ms espec4ficas. En los
animales superiores se sintetiza en Pncreas en forma de 'ripsin$geno" que es la forma
inactiva o precursor de la 'ripsina misma. El 'ripsin$geno es una prote4na de masa
molecular de 29"+++ daltons" que cuando pierde sus seis primeros aminocidos del trmino
amino" por la acci$n de la Enterocinasa" o por otra molcula de 'ripsina ya activada" se
convierte a 'ripsina activa" prote4na de masa molecular 27"2E# daltons. %ctualmente se
conoce perfectamente su secuencia de aminocidos" su estructura terciaria y su mecanismo
de acci$n.
(a actividad enzirntica de la tripsina se puede in,ibir por ciertas a sustancias como
la p8aminobenzidina" la acetamida" la fenilacetamida" la etilamina" la butilamina" etc. El
calor tambin in,ibe a la enzima" pero la in,ibici$n por calor" o desnaturalizaci$n es
irreversible. Por otro lado los compuestos organofosforados como el dietilo de
paranitrofenilfosfato <*PC=" la
in,iben espec4fica y totalmente como a todas las esterasas. Estos compuestos in,iben a la
tripsina de la misma manera que lo ,acen con la enzima colinesterasa y acetilcolinesterasa.
El colgeno es la prote4na estructural del teido conuntivo. Es el principal componente de
los tendones" ,uesos
y ligamentos. En la piel se encuentra en la dermis" mientras que la queratina est en las
capas de la epidermis. (a queratina puede solubilizarse por reducci$n de sus puentes
disulf,4dricos" separndose as4 las ciste4nas unidas que estaban unidas entre s4.
El colgeno se ,ace entonces soluble. )i el colgeno se calienta por largo tiempo
con agua" se solubiliza y se convierte en la prote4na conocida como Felatina. Esta
conversi$n parece que encierra la ,idr$lisis de algunas
uniones pept4dicas dbiles.
(a gelatina tiene una masa molecular promedio de 5+"+++ daltons. (as soluciones
de gelatina son muy viscosas y forman geles duros a temperatura
ambiente" cuando estn en concentraciones de ms del 2 3. (a formaci$n de estos geles
depende del pH y de la fuerza i$nica de la soluci$n. (a gelaci$n se atribuye a la formaci$n
de uniones de ,idr$geno entre pares de uniones pept4dicas.
Entre glicina <25.# 3=" Prolina <#7 3=" HidroDiprolina <#7.5 3=" y cido glutmico
<##3=" est el 57 3 de los aminocidos del colgeno y de la gelatina. Pero no eDiste
tript$fano. El contenido de arginina es de E.7 3 y el de (isina es de 7.5 3.
(a tripsina al romper las uniones pept4dicas de la gelatina va deando grupos
carboDilo libres. Mientras ms tiempo act1a la enzima" ms grupos #carboDilo titulables
,abr en la soluci$n. El formol neutralizado se a0ade para que se una con los grupos amino
libres no cargados" y ,acer ms eDacta la titulaci$n de los grupos carboDilo.
!omo desde el principio del eDperimento" aun sin actuar la enzima puede ,aber
grupos carboDilo titulables" se necesita tener una muestra de cero tiempos" para restar el
valor inicial de cero tiempo a todos los dems valores que se obtengan de la acci$n de la
enzima.