Lorena Norambuena

Facultad de Ciencias, Universidad de Chile

lnorambuena@uchile.cl
Marcadores moleculares

Marcadores moleculares I. Terico.
Marcadores moleculares II; Prctico in silico
INTRODUCCION A LAS TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Organismo
Set de Genes
Variabilidad gentica
Variabilidad gentica
Polimorfismo: variacin en la secuencia del ADN entre dos individuos,
modifiquen o no, stas su fenotipo
Organismo
Set de Genes
Polimorfismo
Un marcador es un carcter que debido al ligamiento puede usarse para
indicar la presencia de una caracteristica
La presencia de A necesariamente implica la de B
Qu es un marcador?
Caracterstica A
Caracterstica B
Gen
Protena
Tipo de hoja
que est asociada a la presencia o expresin de una
Vigor
Altura
Enfermedades
Marcador Morfolgico

Son caractersticas fenotpicas de
fcil identificacin visual

Por ejemplo
forma, color, tamao o altura

Desventajas:
Pequeo nmero de ellos
Poseen bajo polimorfismo comparado
con marcadores moleculares

La presencia de A necesariamente implica la de B
Caracterstica A
Caracterstica B
Gen
Protena
que est asociada a la presencia o expresin de una
Vigor
Altura
Enfermedades
Marcadores moleculares
- Polimrfico
- Herencia mendeliana (no episttica, sin interaccin entre genes)
- Insensible a los efectos ambientales
- Codominante
- Rpida identificacin y simple anlisis
Marcador molecular
Epistasis interaccin gnica de diferentes loci para una una caracteristica dada
Codominancia un individuo heterocigoto presentar las caractersticas de ambos alelos
Marcador Bioqumico
lsoenzlmas

varlanLes de una mlsma enzlma que comparLen un susLraLo en
comun pero dleren en su punLo lsoelecLrlco y por ende en su
movllldad elecLroforeuca en un lsoelecLroenfoque (gradlenLe de
pP)
lueron los prlmeros marcadores no morfolglcos usados en
geneuca de planLas.
!"#$%&'()"
+%,-'"'"
.$/$-)0#
$"1$2'32# 1)4)
)25/'0)0
$%&'()52)
Tomado desde CHAPTER 5 Molecular Markers as Tools for Rice Population Improvement. Catalina Ramis, Ana Cludia
de Carvalho Badan, Elcio Perptuo Guimares, Antonio Daz, Carlos Eduardo Gamboa
Figure 1. Different electrophoretic
patterns (Pi) observed for isoenzymes
isocitrate dehydrogenase (IDH),
phospho-glucoisomerase (PGI), -
esterase (-est I and -est II) and acid
phosphatase (ACP) in cycle 0 of rice
population PFD-1, and four commercial
rice cultivars Araure 4,Cimarrn,
Fonaiap 1 and Palmar
Marcador Bioqumico
La mayor desvenLa[a de esLe upo de marcador es que son
llmlLados en numero y que su expresln depende del Le[ldo
anallzado y del esLado de desarrollo de la planLa.
Marcadores Moleculares DNA
Secuenclas de unA que permlLen evldenclar varlaclones enLre
lndlvlduos
6787

- verlcacln de la pureza" de los culuvares. LspeclalmenLe uullzado
por empresas para la valldacln de caracLeres de lnLeres.

- CaracLerlzacln de germoplasma.
- LsLudlos logeneucos.
- Me[oramlenLo geneuco a Lraves de Marker AsslsLed Selecuon y la
consLruccln de Mapas de LlgamlenLo.
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms
Longitud de los fragmentos obtenidos por el corte del DNA
Como se generan las sondas:
Transcripcion reversa de mRNA generando una coleccin de cDNA
Librera genmica
Genomas secuenciados, amplificacion via PCR secuencias conocidas
Limitaciones:
Trabajoso
Se necesita disponer de una coleccin de sondas
Se requiere de alta cantidad de DNA genmico
60% de los individuos de raza negra con hemoglobina S tienen un fragmento de restriccion
13 kb. Los que tienen hemoglobina normal tienen un fragmento de restriccion de 7.6 kb (US)
* La utilidad de este ensayo es limitada ya que en gente de otras partes del mundo la
enfermedad puede asociarse a ambos fragmentos
En 1978 Kan & Dozy (UC San Francisco) report que el sitio de restriccion HpaI estaba
asociado con SCA. Este polimorfismo podra ser usado para diagnstico
Sickle cell anemia
Condicion mdica trasmitida de padres a hijos en la cual los globulos rojos son de forma
curva lo que produce dolor y fiebre. Se encuentra especialmente en la raza negra. Es
causada por una mutacin en el gen de la globina
Hemoglobina S
Hemoglobin A tiene un sitio MstII en los codones 5 to 7

Un cambio de A a T elimina el sitio en hemoglobin S

N: puede ser cualquier nucleotido
Como el sitio de restriccin reconoce la mutacin este test da un diagnstico
correcto en 100% de los casos
Southern blot
Minisatelites
Loci hipervariable = minisatelites = VNTR
Secuencias adyacentes que se repiten en numero variable

15-100 pb que se repiten hasta 50 veces
VNTR: variable number tandem repeats
Los minisatelites estan dispersos por todo el genoma

Cada loci posee distinto nmero de repeticiones
Han sido usados en:
Identificacion de diversidad y determinacin de variedades y cultivares en planta
Anlisis de diversidad y determinacin de paternidad
Tcnicamente los polimorfismos de VNTR es similar al RFLP
Una proporcin del genoma de organismos eucariontes esta compuesta de secuencias
repetitivas
30% DNA Drosophyla 70% tabaco 50% Arroz
H1 Hinfl
H3 HaeIII
Caja negra muestra donde la
sonda radioactiva se une
Anlisis de minisatlites o VNTR





Southern blot

DNA fingerprinting
Huella gentica es una tcnica utilizada
para distinguir entre los individuos de una
misma especie utilizando muestras de su
DNA.
RFLP fragments separated on a gel
In this case the sample from the crime scene matches suspect B
Criminalstica
History of DNA fingerprinting and RFLP

Because DNA has all of the information to define who we are, our DNA can be used as a unique means
of identifying us. The first method that used DNA as a means of fingerprinting was presented in 1985 in the
journal Nature. This method, dominant for the next ten years, was called restriction fragment length
polymorphism or RFLP. RFLP takes advantage of the fact that there is a copy of DNA in each cell and
typically a forensic sample has many cells. A type of chemical called a restriction enzyme is applied to chop
up the DNA into smaller fragments. It makes its cuts at specific sequences of nucleotides. These
fragments have different sizes and this variation is called polymorphism. To continue the above analogy,
let's pretend the following sentences represent DNA from two different people.
DNA fingerprinting
The analysis might be specific enough
that only 1 person in 20 billion people
would have the same pattern,
indicating an almost definite match.
PCR

Fue desarrollada a mediado de la
decada de los 80s

Se amplifican secuencias de DNA

Se requiere una pequea cantidad
de templado para obtener cantidades
suficientes de DNA que se pueden
observar utilizando bromuro de etidio

Uno de los requerimientos es
conocer las secuencias que flanquean
la sequencia a amplificar
Marcadores basados en PCR
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
Se usan primers cortos de secuencia arbitraria
Las secuencias complementarias deben estar a <4000 pb y en orientacion opuesta
La secuencia blanco es desconocida
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
Permite la realizacin de anlisis genticos de especies de genomas no conocidos

Fingerprinting individuos, variedades y poblaciones

Anlisis de estructura y diversidad gentica en poblaciones naturales

Relaciones filogenticas entre distintas especies

Construccin de mapas genticos
Ventajas
Anlisis es mas rapido
No se requiere un banco de secuencias
El mismo conjunto de partidores puede ser usado para distintos organismos
Limitaciones
Los genotipos heterocigotos no pueden ser discriminados de los homocigotos
Significance of Lactobacilli
in Cheddar Cheese
In summary these studies found that one species of lactobacilli (Lb. paracasei) was
the dominant non-starter lactic acid bacteria in mature Cheddar cheese. Although a
wide variety of strains were identified, only a few were found in any particular
cheese, suggesting their likely role in cheese flavour diversity even within the same
manufacturing plant. This suggests the potential for flavour control or enhancement
through the selective and controlled use of non-starter lactic acid bacteria.
18 mature Cheddar cheeses, from 7
commercial companies were selected for
analysis
RAPD was investigated as a
suitable method to determine the
number of strains of lactobacilli
isolated from the commercial
Cheddar cheeses.
Microsatelites
Microsatellites Polymorphism
SSR: simple sequence repeats
STR: short tandem repeats
Consisten en secuencias de 1-4 nucleotidos adyacentes repartidas
Puden ser utilizados para generar mapas genticos de especies
Se disean primer especificos que flanquean el microsatelite
Se requiere de un mtodo de separacin de los amplificados de alta resolucion
9$- 0$ 1#-')24'-)('0)
7: 7; 7<
=>+ $?@4)25#%A "$1)4)@$
14#@$'%"B 14$2'1'@)@$ =>+B
C)"D =>+B 4$"E"1$%0 =>+
FG.
FG.
FG.
ACGTAGTTTAAGCGATAGACGACTAGACTCAGATCAGATCAGATCAGACACTGTTGCA
ACGTAGTTTAAGCGATAGACGACTAGACTCAGATCAGATCAGACACTGTTGCA
ACGTAGTTTAAGCGATAGACGACTAGACTCAGATCAGACACTGTTGCA
7: 7; 7<
7:
7<
7;
HG+9+
; .IFI+H7
< .IFI+H7
J .IFI+H7
SSRs:
Son las
semillas de
variedades
distintas?

Por lo tanto estas
semillas presentan
un polimorfsmo en
la zona amplificada
Microsatelites
Microsatellites Polymorphism
SSR: simple sequence repeats
STR: short tandem repeats
Consisten en secuencias de 1-4 nucleotidos adyacentes repartidas
Puden ser utilizados para generar mapas genticos de especies
Se disean primer especificos que flanquean el microsatelite
Se requiere de un mtodo de separacin de los amplificados de alta resolucion
Ventajas
SSR son los que contienen el mas elevado contenido de informacion de
poimorfismo, por esta razon esencialmente toda y cualquier poblacion
segregante puede ser utilizada como poblacion de referencia para estudios de
ligamiento y mapeo genetico
Criminalistica
Seis STR (short tandem repeats) fueron analizados
Microsatelites
SNP: Single Nucleotide Polymorphism
SFP: Single Feature Polymorphism
SSLP : Simple Sequence Length Polymorphisms
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
Son muy similares al concepto de RFLP pero utilizan la reaccin de PCR
Otros AFLP
Plant journal 1993 4 9 (2): 403
CAPS
Cleaved amplify polimorphic sequences
Desarrollo de marcadores moleculares

Ejemplo

CAPS, Cleaved amplify polimorphic sequences

A. thaliana cuando su genoma aun no era secuenciado totalmente

Identificacion de un set de genes que ya estaban mapeados y secuenciados

Diseo de primers para amplificar esas regiones

Se amplifican los correspondientes fragmentos de dos variedades de A.
thaliana

Para identificar RFLP cada fragmento fue analizado por digestion con
enzimas de restriccion hasta encontrar polimorfismo


Plant journal 1993 4 9 (2): 403
Plant journal 1993 4 9 (2): 403
CAPS, Cleaved amplify polimorphic sequences
No se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suciente memoria para abrir la imagen o que sta est daada. Reinicie el equipo y, a continuacin, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla
de nuevo.
Densidad de marcadores moleculares en Arabidopsis thaliana
K)1)" 0$ L'M)('$%@# # M$%N52#"
O)")0#" $% -) 4$2#(P'%)2'Q% M$%N52)
!%0'2)% -) 1#"'2'Q% R -) 0'"@)%2') M$%N52) 4$-)5/) $%@4$ ()42)0#4$"
) -# -)4M# 0$- 24#(#"#() $% 2K
.$"1#%0$% -) 14$ME%@)A
SGE,% 2$42) $"@, $- ()42)0#4 0$- M$% 0$ '%@$4N" # 0$ #@4# ()42)0#4T
Meiosis
Copyright 2007 American College of Cardiology Foundation. Restrictions may apply.
Damani, S. B. et al. J Am Coll Cardiol 2007;50:1933-1940
Schematic of Genetic Linkage and Recombination
G#%"@4E22'Q% 0$ E% K)1) 0$ L'M)('$%@#A SUEN 0'"@)%2') "$1)4) )
IB VW 9 R XT
En el 94.1% de
la descendencia
E segrega junto
con F.
Solo en el
85.6% E
segrega junto
con H
Cuatro zonas
polimorficas
dadas por ej
por 4 pares
de primer
para RAPD
Mapas de ligamiento
Ea: ecotipo a
Mutante
Eb: ecotipo b
X
nn
NN
NN Nn nN
nn
F1
F2
100% Nn
ctr1 CIW8 CIW4 nga280
P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M
P1: planta1
P2: planta2
P3: planta3
Ea: ecotipo a
Eb: ecotipo b
M: mezcla Ea+Eb