Captulo I

INTRODUCCIN
Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un hemoflagelado
heteroxnico que desarrolla su ciclo de vida en hospederos mamferos y utiliza como vectores a
ms de 140 especies de insectos estrictamente hematfagos (Herrera, 2010).

Este parasito protozoario afecta entre 10-16 millones de personas en Latino Amrica y se estima
que causa aproximadamente 13000 muertes por ao (Lewis et al., 2009).

El Chagas representa un serio problema de Salud Pblica tanto por su magnitud como por su
impacto. El rea conocida de dispersin de vectores domiciliarios de la Enfermedad de Chagas
en Bolivia cubre aproximadamente el 60% del territorio (OPS, 1998 y Santalla et al., 2011).
Alrededor de 1 800 millones de personas estn en riesgo de infeccin y datos del 2005 todava
indican ms de 10 000 nuevos casos por ao (Arajo-Jorge & Medrano, 2009).

El mecanismo por el cual las diferentes formas clnicas de la enfermedad se establecen an

permanece oscuro. Sin dudas, factores asociados al paciente estn involucrados, pero queda cada
vez ms evidente la existencia de un papel fundamental asociado a aspectos genticos del
parsito (Macedo, 2009).

Trypanosoma cruzi, exhibe un alto grado de polimorfismo intraespecfico, desde aspectos

morfolgicos hasta refinados marcadores moleculares recientemente descritos (Macedo, 2009).
Adems de mostrar niveles extremadamente altos de diversidad gentica, y una abundancia de
marcadores genticos que pueden ser usados para estratificar las especies en varias subdivisiones
(Lewis et al., 2009).

Una de las cuestiones actuales ms intrigantes en la enfermedad de Chagas se relaciona al

posible papel de la diversidad gentica de las poblaciones de T. cruzi en la determinacin de las
diferentes formas clnicas de esta parasitosis (Macedo, 2009).

La naturaleza clonal de T. cruzi, ha permitido la utilizacin de marcadores bioqumicos y

moleculares para agrupar fenotipos y genotipos del parsito que pueden mostrar diversidad
biolgica, bioqumica y molecular, sean distribuidos o no en una misma rea geogrfica:
Trypanosoma cruzi I, II, III, IV, V y VI (Herrera, 2010).

1
De acuerdo a Falla et al. (2008), en Colombia se descubrieron cuatro haplotipos en el grupo T.
cruzi I: Ia, Ib, Ic y Id. La identificacin de los haplotipos dar lugar a una mayor comprensin
sobre la dinmica de transmisin del parsito y su influencia en caractersticas clnicas.

En Amrica Latina, actualmente hay un creciente esfuerzo por estudiar al T. cruzi a nivel
molecular, donde este agente causal de la enfermedad de Chagas es una de las principales causas
de mortalidad, siendo beneficioso para comprender ms claramente la dinmica de transmisin
del parsito.

En Bolivia, la enfermedad de Chagas afecta de manera significativa a la poblacin, siendo que su

agente causal, Trypanosoma cruzi, no est muy estudiado a nivel gentico y molecular en nuestro
medio. Han sido reconocidos seis linajes (I-VI), cada uno presentes en distintas reas y con
tropismos diferentes. Estudios realizados a nivel molecular, principalmente con cepas de nuestros
pas, aportando datos para posteriores estudios necesarios para la enfermedad, ya sea en cuanto a
los vectores (domiciliarios, silvestres o peridomiciliarios), hospederos o sus sntomas.

Captulo II
OBJETIVOS
Objetivos Generales
- Realizar una breve descripcin sobre la Enfermedad de Chagas.
- Describir la biologa molecular de Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad.

Objetivos Especficos
- Realizar una breve descripcin de las generalidades de la Enfermedad de Chagas, en
cuanto a la epidemiologa, transmisin, diagnstico, ciclo de vida del parsito, etc.
- Explicar la importancia a nivel social y cientfico que genera conocer sobre la
Enfermedad de Chagas y la biologa molecular del parsito.
- Recopilar informacin sobre estudios e investigaciones realizados en el campo de la
Biologa molecular en T. cruzi.
- Describir aspectos genticos de T. cruzi mediante los avances en el campo de la Biologa
Molecular.

2
Captulo III
REVISIN BIBLIOGRFICA

1. Enfermedad de Chagas
La enfermedad de Chagas, producida por el Trypanosoma cruzi, est ampliamente distribuida en
Amrica Latina y es transmitida por triatmidos conocidos como vinchucas. Al menos 10
millones de personas se encuentran expuestas al riesgo de infeccin. El T. cruzi presenta una
estructura compleja con diversas caractersticas genticas, moleculares, bioqumicas y biolgicas
dentro del husped vertebrado (Coronado et al., 2006).

El peso social de esta endemia es muy alto entre los pases Latinoamericanos, considerndose
que el Chagas es la cuarta causa de prdida de aos de vida potenciales entre las enfermedades
infecciosas y parasitarias, solamente por debajo de las respiratorias agudas, de diarreas y del
SIDA, en la regin (OPS, 1998).

1.1 Epidemiologa y transmisin

T. cruzi es endmica a travs de la vasta mayora de Latino Amrica y en el sur de los
Estados Unidos, siendo as que la Tripanosomiasis americana, se extiende desde la latitud
42 N (EUA) hasta el paralelo 49 S (zonas meridionales de Argentina y Chile), incluyendo
las islas del Caribe (Herrera, 2010). (Ver Fig. 1)

La transmisin del parsito principalmente se da por intermedio del vector, insectos

triatominos en cuyas heces se encuentran las formas infectantes del parsito. Sigue, en
importancia, la transmisin transfusional y la congnita, que se viene volviendo cada vez
ms importante. Tambin la transmisin ocurre por accidente de laboratorio y por leche
materna, pero con poco significado epidemiolgico (Goncalves et al., 2005).

Tambin ocurrieron brotes de la forma aguda de la enfermedad de Chagas y muerte por

ingestin de formas tripomastigotes, en alimentos o bebidas, en las cuales los insectos
vectores, probablemente silvestres, fueron triturados durante la preparacin o sus heces
contaminaron el alimento (Goncalves et al., 2005).

La enfermedad de Chagas sigue siendo un problema de salud pblica por todos los pases de
Amrica Latina, y su distribucin cubre toda Sudamrica, incluyendo, desde Chile y
Argentina, hasta el sur de los Estados Unidos, donde existen vectores adecuados al parsito.
3
La Iniciativa de los Pases del Cono Sur de promover acciones de control del vector fue muy
bien sucedida, con la participacin de Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay
(Goncalves et al., 2005).

Fig. 1: Distribucin geogrfica de Chagas desde el Sur de Amrica del Norte, Amrica
Central y Sur Amrica.
Fuente: Ledezma, 2003

1.2 Chagas en Bolivia

El rea conocida de dispersin de vectores domiciliarios en Bolivia cubre
aproximadamente el 60% del territorio, en zonas geogrficas comprendidas entre los 300 a
3.500 m.s.n.m, ocupando casi toda la superficie de los departamentos de: Tarija,
Chuquisaca, Cochabamba, Santa Cruz y parcialmente Potos y La Paz, siendo que el
Programa Nacional de Chagas reconoce 6 departamentos endmicos, no considerando a
Beni, Pando y Oruro (OPS, 1998; Arajo-Jorge & Medrano, 2009 y Santalla et al., 2011).

La infeccin ocurre en diferentes reas geogrficas y afecta principalmente a la poblacin

socioeconmicamente pobre. Los porcentajes de positividad en 7 departamentos tienen un
promedio del 28% (OPS, 1998). Actualmente, en Bolivia se reconocen las formas de
transmisin: vectorial 30-50%, congnita 1-7% y transfusional 1-5% (Santalla et. al, 2011).

La etapa crnica de la enfermedad de Chagas puede categorizarse en tres formas clnicas

mayores; las que involucran cardiopatas, patologas del tracto digestivo e indeterminadas
(asintomticas). Parece haber una variacin geogrfica en el desarrollo de estas formas
clnicas en Latino Amrica, pero en Bolivia se observan las tres formas clnicas (del Puerto
et al., 2010).

Debido a las importantes iniciativas internacionales, en los ltimos veinte aos, la

prevalencia de infecciones por T. cruzi disminuy. A pesar de los esfuerzos concertados
para el control de Chagas en Bolivia, la prevalencia de T. cruzi permanece alta. En 2005,
Bolivia cont con 620000 casos de infeccin, siendo la mitad del nmero estimado en

4
 1985 (1134000). Pero datos del 2005 todava indican que hay ms 10000 nuevos casos/ao
en Bolivia (Arajo-Jorge & Medrano, 2009).

1.3 Conocimiento de la enfermedad

1.3.1 Estudios moleculares
Con el avance en el conocimiento de la biologa molecular, a partir de 1980, diversos
grupos en Brasil, Argentina y Estados Unidos aislaron protenas recombinantes
obteniendo buenos resultados de acuerdo con cada grupo. Tambin fueron publicados
estudios con pptidos sintticos (Luquetti, 2005).

En otra fase del diagnstico de laboratorio, en la dcada de 1990, los estudios se

dedicaron a la amplificacin de cidos nucleicos del propio parsito, buscando el
diagnstico parasitolgico, a travs de la amplificacin por PCR. Hoy en da, es posible
verificar la presencia de un parsito en 20 ml de sangre. Lo que sucede es que, por ser un
mtodo de verificacin de la presencia del parsito, que puede no estar presente en el
infectado crnico, un resultado negativo no tiene valor diagnstico. La sensibilidad es
superior a la del hemocultivo y del xenodiagnstico, aunque exista preocupacin con
relacin a la especificidad cuando es realizado en servicios de rutina (Luquetti, 2005).

1.4 Diagnstico
El diagnstico de la enfermedad de Chagas puede ser realizado a travs de diferentes
estrategias, de acuerdo con la fase en la que la enfermedad se encuentra. La deteccin directa
o indirecta del parsito tiene importancia clnica y epidemiolgica. Los mtodos
parasitolgicos se basan en la observacin del parsito y requieren de experiencia suficiente
para no confundirlo con otros hemoflagelados. De stos, el procedimiento ms relevante es el
xenodiagnstico, ya que se considera el mtodo parasitolgico estndar y cuando se aplica,
generalmente se combina con estudios serolgicos. La principal desventaja es su baja
sensibilidad en la etapa crnica. Por otra parte los mtodos serolgicos se basan en la
deteccin de anticuerpos IgM contra Trypanosoma cruzi presentes en infecciones recientes o
recadas; pero presentan algunas desventajas ya que al detectar anticuerpos IgM, es un
inconveniente en inmunodeprimidos o neonatos, adems de la factibilidad de presentar
reacciones cruzadas con Leishmania spp. y T. rangeli (positivas falsas), por lo que la OMS

5
recomienda positividad en dos de tres pruebas serolgicas y de ser posible, corroborada con
el xenodiagnstico para considerar a un individuo como infectado (WHO, 1991).

1.4.1 Laboratorio
En el estadio inicial de la infeccin por el Trypanosoma cruzi, un gran nmero de
parsitos circula en la corriente sangunea y el diagnstico puede ser obtenido a travs de
examen microscpico directo en la sangre perifrica (Britto, 2005). En la fase aguda y en
las formas crnicas de la enfermedad de Chagas el diagnstico etiolgico podr ser
realizado por la deteccin del parsito a travs de mtodos parasitolgicos (directos o
indirectos) y por la presencia de anticuerpos en el suero, a travs de pruebas serolgicas,
utilizando preferentemente la inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemaglutinacin
(HAI) y enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pruebas ms complejas como la
prueba molecular, utilizando polymerase chain reaction (PCR) acoplado a la
hibridizacin con sondas moleculares, y el Western blot (WB) han presentado
prometedores resultados y podrn ser utilizados como prueba de confirmacin tanto en la
fase aguda como en las formas crnicas de la enfermedad (de Miranda, 2005).

1.4.2 Molecular
Las limitaciones en la sensibilidad y especificidad de las pruebas parasitolgicas y
serolgicas de laboratorio, especialmente cuando se trata del diagnstico de la fase
crnica, explican el inters y la necesidad de implantacin de un mtodo directo y ms
sensible que permita monitorear la presencia del parsito y confirmar la etiologa de la
enfermedad (Britto, 2005).

En este sentido, desde que se utiliz por primera vez la Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (RCP) y otras tcnicas moleculares para la deteccin e identificacin del
parsito, se logr un gran avance en el diagnstico de la enfermedad y en la tipificacin
de los diferentes aislados del parsito. El primer blanco de amplificacin del genoma de
este parsito y uno de los ms usados actualmente es el ADN del cinetoplasto (Ver Fig.
2). La principal virtud de esta secuencia en el ADN del cinetoplasto es que se encuentra
en gran abundancia, por lo que la PCR sea capaz de detectar un parsito en 20 ml de
sangre, constituyndose la deteccin molecular un procedimiento singular, con alta
sensibilidad y especificidad muy prometedora para darle solucin al problema del

6
 diagnstico (vila et al., 1991). Entretanto, casi veinte aos despus de la publicacin de
los primeros relatos del empleo de la PCR en la deteccin de la infeccin por T. cruzi,
tales pruebas an no se comercializan y slo son usadas en el ambiente de investigacin.
(Britto, 2005).

Para convalidar un ensayo de PCR como herramienta molecular de diagnstico de la

infeccin chagsica, la sensibilidad y especificidad del mtodo deben ser probadas con un
elevado nmero de muestras procedentes de diferentes reas geogrficas, ya que la
enfermedad presenta una gran variedad de manifestaciones clnicas, ms all de
diferentes niveles de parasitemia en el continente americano (Britto, 2005).

Fig. 2: (A) Esquema representativo de la molcula de minicrculo de T. cruzi

presentando las 4 regiones de secuencias conservadas (rectngulos), las posiciones de
los iniciadores de la PCR (flechas) y los respectivos productos amplificados (lnea
punteada). (B) Electroforesis en gel de agarosa 1,5% para la deteccin de los productos
amplificados (fragmento de 330 pb correspondiente a regiones hipervariables de los
minicrculos). Fuente: Britto, 2005.

Estudios clnicos y epidemiolgicos preliminares demostraron que el ensayo de la PCR

puede alcanzar una mejor sensibilidad y especificidad cuando se compara junto con el
diagnstico serolgico y clnico. Ms all de eso, la PCR es sin dudas un mtodo ms rpido
y ms prctico que cualquier otra prueba parasitolgica, como, por ejemplo, el
xenodiagnstico y el hemocultivo (Britto, 2005).

1.5 Importancia Social

De acuerdo con el ngulo de abordaje: primero, los orgenes ecobiolgicos e histricos de la
tripanosomiasis americana y, segundo, aspectos de su impacto social y su control en la
regin. Por un lado, los factores bioecolgicos que determinaron la ocurrencia de los ciclos
primitivos del T. cruzi y, por otro, todo el contexto poltico, social y econmico que ocasion
la dispersin de la endemia, individualizando las poblaciones afectadas y determinando las
perspectivas de control. Otro ngulo es la importancia de la produccin cientfica
latinoamericana sobre el tema, as como el papel poltico y social de los investigadores en el
combate a la enfermedad (Pinto & Rodrigues, 2005).

7
 Del punto de vista epidemiolgico y poltico, la enfermedad de Chagas constituye
bsicamente un problema de Amrica Latina, especficamente de sus pases continentales.
Son estimados de 12 a 14 millones de individuos infectados por el T. cruzi en 19 pases.
Tambin se calcula una proporcin de 10 a 40 % de los infectados como aquellos que ya
tienen o tendrn una cardiopata crnica debida a la tripanosomiasis americana y, de ellos,
por lo menos 10 % presentarn una forma grave que ser probablemente su causa de muerte
y prdida de aos de vida productiva. Ms all de la cardiopata, formas digestivas
(predominantes en Amrica del Sur), ausentismo, costos previsionales y mdico
hospitalarios, procesos de perpetuacin de pobreza familiar en zonas endmicas, baja
productividad y costos de programas de control y vigilancia, son elementos que indican
importantes gastos financieros y sociales de los pases afectados por la endemia. A partir del
primitivo ciclo enzotico, la enfermedad humana se disemin en el continente americano por
circunstancias y factores de naturaleza bsicamente antrpica y poltico social, retratados en
ranchos rurales de mala calidad, poblaciones socialmente excluidas, bolsones de pobreza y
baja productividad, sistemas de salud ineficientes y espacios geogrficamente abiertos,
principalmente por deforestacin intensiva (Pinto & Rodrigues, 2005).

2. Generalidades de la Enfermedad de Chagas

2.1 Animales reservorios
Originalmente, la infeccin por T. cruzi era exclusivamente una zoonosis que afectaba a
numerosos triatominos selvticos y animales salvajes en focos naturales, de los cuales
estaban ausentes los seres humanos y los animales domsticos. Como resultado de
desequilibrios ecolgicos llevando algunas especies de Triatominae a un proceso de
domesticacin, el Chagas se propag al ambiente domiciliario y peridomiciliario, afectando a
los hombres y animales domsticos. Se constituyen en reservorios de T. cruzi slo los
mamferos. Ms de 150 especies selvticas y domsticas de mamferos fueron encontradas
naturalmente infectadas por T. cruzi. El perro, los roedores y la comadreja constituyen los
huspedes ms importantes en el ciclo peridomstico mientras que, en el ciclo selvtico, esta
funcin es desempeada por el armadillo y la comadreja (Noireau, 1999).

La importancia del husped reservorio en el ciclo de T. cruzi depende de su especie, ectopo

(selvtico, peridomstico o domstico), capacidad de dispersin, densidad, distribucin
geogrfica, contacto con vectores, preferencias alimenticias de los vectores y relaciones
8
parsito-husped. Se mantiene la idea que varias especies pueden adquirir la infeccin por
va oral, a travs de la ingestin de insectos infectados antes que por va vectorial. Ya se sabe
que la va oral predomina para roedores y marsupiales quienes presentan hbitos
insectvoros. Tambin la infeccin por esta va fue demostrada en los perros (Noireau, 1999).

2.1.1 Hospedero humano

Originalmente, la infeccin por T. cruzi era una zoonosis silvestre que, posteriormente, se
convirti tambin en una entidad domiciliaria despus de un proceso de captacin del
parsito por el ser humano. La participacin del hombre en la cadena epidemiolgica se
inici cuando ste invadi al ambiente silvestre. Las modificaciones antrpicas del medio
llevaron a su desmantelamiento progresivo y tuvieron como consecuencia una reduccin
de la fauna silvestre. La edificacin por el hombre de viviendas con paredes de barro o
madera llenas de grietas y techo vegetal ofreci el biotopo apropiado a triatominos
huyendo de su medio natural amenazado por la reduccin gradual de fauna silvestre. Sin
embargo, los ciclos silvestres y domiciliarios de T. cruzi quedan interdependientes en las
reas donde permanece la circulacin en los mamferos reservorios (Noireau, 1999).

2.2 Vectores
Los vectores de la enfermedad de Chagas o triatominos son insectos hempteros
caracterizados por su hbito hematfago, pertenecientes al Orden Hemptera. Las especies
hematfagas de este orden incluyen 2 familias: los Cimicidae, o chinches de la cama, y los
Reduviidae. Esta ltima familia a su vez est constituida por 22 subfamilias de las cuales los
Triatominae, que corresponden a insectos hematfagos, son agrupados en 5 tribus y 15
gneros. Actualmente se reconocen 123 especies de triatominos: 110 especies estn
difundidas slo en el nuevo mundo entre las latitudes 42 Norte y 46 Sur. Todas las especies
son potencialmente vectores aunque solamente la mitad ya han sido encontradas
naturalmente infectadas por T. cruzi (Noireau, 1999).

Siendo Triatoma, Panstrongylus y Rhodnius los gneros de mayor importancia

epidemiolgica (Herrera, 2010). Triatoma infestans sigue siendo el vector ms importante y
extendido de la enfermedad en Sud Amrica, y particularmente en Bolivia (Arajo-Jorge &
Medrano, 2009).

2.3 Parsito
9
2.3.1 Ciclo Biolgico (Ver Fig. 3 y Fig. 4)
El ciclo en el hospedador vertebrado, que puede ocurrir en diferentes especies de
mamferos, se inicia cuando formas infectantes eliminadas por el insecto vector entran en
contacto con mucosas o regiones de la piel de esos hospedadores con lesiones. Las
formas tripomastigotes metacclicas son altamente infectantes. Al invadir estas clulas
usando diferentes mecanismos, ocurre la proliferacin intracelular y la liberacin de
formas tripomastigotes, as como algunas formas intermediarias y amastigotes en el
espacio intercelular. Estas formas pueden invadir nuevas clulas, pero tambin pueden
alcanzar la corriente circulatoria y todos los tejidos del hospedador, invadiendo los ms
diferentes tipos celulares. La cintica del proceso descrito anteriormente, as como los
tejidos ms infectados, variarn de acuerdo con la cepa del T. cruzi y el animal infectado
(de Souza, 2005).

El parsito existe en la naturaleza en diferentes poblaciones de hospedadores vertebrados

tales como seres humanos, animales silvestres y animales domsticos, e invertebrados,
como los insectos vectores. El T. cruzi posee variaciones morfolgicas y funcionales,
alternando entre estadios que sufren la divisin binaria y las formas no replicativas e
infectantes. En las formas replicativas estn incluidos los epimastigotes presentes en el
tubo digestivo del insecto vector y los amastigotes observados en el interior de las clulas
de los mamferos. Las formas no replicativas e infectantes, tripomastigotes metacclicos,
son encontradas en las heces y orina del insecto vector y los tripomastigotes circulantes,
en la sangre de los mamferos (Azambuja & Garcia, 2005).

Durante la fase en el hospedador invertebrado, el T. cruzi se transforma en epimastigotes

y, entonces, en el intestino posterior, se diferencian en tripomastigotes metacclicos los
cuales, eliminados a travs de las heces y orina del insecto vector, son capaces de infectar
el hospedador vertebrado. El parsito no penetra en la piel intacta, slo infectando al
hospedador va mucosa o heridas en la piel. En los mamferos, los parsitos se
desarrollan en el interior de las clulas y son liberados en la sangre despus que las
clulas del hospedador se rompen. Durante la alimentacin del insecto, las formas
tripomastigotes que se encuentran en la sangre del hospedador vertebrado infectado son
ingeridas por los insectos. Algunos das despus de la alimentacin del insecto, los
parsitos se transforman en epimastigotes y esferomastigotes. Despus de que la
10
 infeccin se establece en el estmago del insecto vector, las formas epimastigotes del
parsito se dividen repetidamente por divisin binaria y pueden adherirse a las
membranas perimicrovillares de las clulas intestinales. En gran cantidad, los
epimastigotes se conectan a la cutcula rectal, y se diferencian en tripomastigotes
metacclicos pudiendo, ambas formas, diferenciadas o no, ser eliminadas a travs de las
heces y orina (Azambuja & Garcia, 2005).

Despus de la ingestin de la sangre infectada, en la regin anterior y posterior del

intestino medio (estmago e intestino, respectivamente), los parsitos se enfrentan a
componentes existentes en estos compartimientos digestivos. Estos incluyen los factores
hemolticos, pptidos derivados de la cadena D-globina, lisozimas, defensinas, sistema
profenoloxidasa, NO y lectinas, etc.; los cuales pueden modular la dinmica de la
multiplicacin y diferenciacin del T. cruzi en el tubo digestivo del insecto vector e
ilustrar la complejidad de los mecanismos envueltos en la interaccin con el T. cruzi
(Azambuja & Garcia, 2005).

Fig. 3: Ciclo biolgico de T. cruzi.

Fuente: Ledezma, 2003

Fig. 4: Ciclo biolgico de T. cruzi, (a) vector ; 1: tripomastigote sanguneo en el

hombre, mamferos silvestres y domsticos; 2: epimastigote en el intestino del
vector; 3: tripomastigote metacclico en el intestino del vector; 4: amastigotes en
rganos parasitados. Fuente: Maldonado, 2001

3. Trypanosoma cruzi

11
Actualmente, es sabido que T. cruzi es una especie heterognea, consistiendo en varias sub-
poblaciones del parsito que circula entre diferentes hospederos invertebrados y vertebrados
(Devera et al., 2003).

La variacin intra-especfica dentro de T. cruzi ha sido observada basada en (i) el

comportamiento biolgico de las cepas en animales de laboratorio, (ii) caractersticas
bioqumicas de los aislados, y (iii) caractersticas moleculares. Para estudiar el rol de la
diversidad del parsito en la patognesis de la enfermedad de Chagas, una caracterizacin
exhaustiva de las poblaciones encontradas en la naturaleza es crucial (Macedo & Pea, 1998).

As como T. cruzi est compuesta de una poblacin heterognea, el mismo hospedero puede
simultneamente ser infectado por diferentes cepas. En este escenario, un concepto mayor es la
clara existencia de clones que son ms representativos, siendo encontrados en varios hospederos
en diferentes reas geogrficas de Latino Amrica (Andrade 1999). Actualmente, se sabe que T.
cruzi tiene una estructura poblacional clonal. Esto explica la existencia de organismos
independientes con caractersticas biolgicas discretas explicando el descubrimiento de un gran
nmero de clones en diferentes reas geogrficas (Devera et al., 2003).

3.1 Taxonoma
Se encuentra dentro del subfilo Mastigophora del filo Sarcomastigophora, Trypanosoma
cruzi pertenece al orden Kinetoplastida que incluye flagelados provistos de un cinetoplasto
conteniendo una red fibrosa de ADN. T. cruzi integra la seccin Stercoraria conformada por
tripanosomas que se desarrollan hacia la forma infestante en el tracto digestivo del vector y
contaminan el mamfero con las por las deyecciones de ste. El subgnero Schizotrypanum
rene los tripanosomas que se multiplican en los vertebrados por va intracelular, de ah que
el nombre taxonmico completo es Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi (Noireau, 1999).

El gnero Trypanosoma es uno de los ms importantes dentro de la familia

Trypanosomatidae por incluir una serie de especies causadoras de enfermedades humanas
importantes como el Trypanosoma cruzi, agente de la enfermedad de Chagas; T. rhodesiense
y T. gambiense, agentes de la enfermedad del sueo (de Souza, 2005).

3.2 Morfologa del parsito

12
Las observaciones realizadas a travs de observaciones del parsito fijado y teido con el
colorante de Giemsa, es el mtodo utilizado hasta hoy (Ver Fig. 5), esto permiten
descripciones morfolgicas del Trypanosoma cruzi: (i) la forma general de la clula, (ii) el
Ncleo, (iii) el cinetoplasto y (iv) el flagelo (Ulisses, 2005).

Fig. 5: Observacin del parsito con microscopio ptico-Resto sanguneo de animal

infectado
Fuente: Ulisses, 2005

De acuerdo con (i) la forma general de la forma evolutiva; (ii) la posicin relativa entre el
flagelo y el ncleo; (iii) la localizacin de la bolsa flagelar (local de salida del flagelo); y (iv)
la localizacin del flagelo libre, podemos diferenciar las formas evolutivas de los
tripanosomtidos (Ulisses, 2005).

En el caso del T. cruzi, la observacin por microscopa ptica permite la identificacin de 3

formas evolutivas bien definidas con diferente morfologa (Fig. 6):
Los tripomastigotes se encuentran en la sangre del mamfero (Fig. 7) y en el contenido
rectal del insecto (Fig. 8). Poseen un cuerpo alargado y fino de 16-20 de largo y 2-4 de
ancho. El ncleo redondo y alargado est ubicado en el tercio medio del cuerpo y el
cinetoplasto en el extremo posterior. A partir del cinetoplasto sale un flagelo que se inicia
en el corpsculo parabasal y corre externamente al cuerpo exteriorizndose en su parte
anterior. Una aparente membrana ondulante bordeada por el flagelo se observa a la
microscopia ptica. Los tripomastigotes observados en el insecto, o formas metacclicas,
son ms uniformes en su morfologa que los encontrados en la sangre del vertebrado
(formas sangucolas) donde el polimorfismo es grande (Noireau, 1999).

Los amastigotes (Fig. 9) son esfricos, tienen un dimetro de 2-5, un ncleo redondo, un
cinetoncleo en forma de barra y no presentan flagelo visible. Se localizan
exclusivamente dentro de las clulas del vertebrado donde se multiplican. Las clulas
parasitadas pertenecen inicialmente al sistema fagoctico monocitario pero, despus,
13
 pueden ser invadidas una gran variedad de clulas. Sin embargo las ms afectadas son las
musculares cardacas, intestinales y esquelticas (Noireau, 1999).

Los epimastigotes (Fig. 10) se observan solamente en el intestino del insecto donde se
constituyen la forma de multiplicacin. Son alargados y miden 10-15 de largo y 1-3 .
de ancho. El ncleo esfrico se ubica en la mitad del cuerpo y el cinetoplasto, en forma
de barra, adelante y prximo al ncleo dando nacimiento al flagelo que pronto se hace
libre en el extremo anterior (Noireau, 1999).

La observacin de formas tripomastigotes en la sangre de animales infectados mostr que no

todas son idnticas entre s, lo que indica la existencia de dimorfismo, o incluso de
poliformismo, en T. cruzi, caracterizado por la presencia de formas tripomastigotes gruesas,
finas e intermediarias, tal como descrito para los tripanosomas africanos. Las
interpretaciones para este hecho han sido las ms variadas, incluso como indicacin de
dimorfismo sexual (de Souza, 2005).

Fig. 6: Morfologa de T. cruzi en sus diferentes estados.

Fuente: Maldonado, 2001

Fig. 7: Formas tripomastigotes sanguneas del Trypanosoma cruzi.

Fuente: Ulisses, 2005

14
Fig. 8: Formas tripomastigotes metacclicas (metaciclognesis in vitro).
Fuente: Ulisses, 2005

Fig. 9: Formas amastigotes intracelulares del Trypanosoma cruzi.

Fuente: Ulisses, 2005

Fig. 10: Formas epimastigotes del Trypanosoma cruzi.

Fuente: Ulisses, 2005

3.3 Criterios de identificacin

La identificacin de T. cruzi se funda en criterios biolgicos y morfolgicos. Sin embargo,
en diferentes regiones coexiste con otras especies, por lo que la diferenciacin de su
morfologa, muy similar, necesita el desarrollo de marcadores bioqumicos. Estas
poblaciones se han distribuido hasta tal punto que existe una gran heterogeneidad de cepas.
Criterios de identificacin son tiles para caracterizar el taxn y la cepa (Noireau, 1999).

3.3.1 Caracterizacin Biolgica

Las caractersticas diferenciales entre cepas se basan en las diferencias observadas en la
capacidad de infectar al vector y en el curso del desarrollo del parsito en los huspedes
mamferos: diferente tropismo de cada cepa por los tejidos y rganos, grado de
15
 virulencia, curso de la parasitemia y grado de sensibilidad a los agentes
quimioteraputicos (Noireau, 1999).

3.3.2 Caracterizacin Inmunolgica

Se ha demostrado la existencia de antgenos especficos de cepa en la superficie del
parsito. Tambin se utilizan anticuerpos monoclonales para diferenciar las cepas
(Noireau, 1999).

3.3.3 Caracterizacin Bioqumica y Molecular

Varias caractersticas al nivel molecular pueden ser usadas para identificar las cepas de T.
cruzi. As, se clasifican las cepas segn sus patrones isoenzimticos o zimodemas, sus
esquizodemas y por hibridacin con sondas de ADN kinetoplasto. Estos anlisis han
revelado una gran variabilidad gentica en T. cruzi (Noireau, 1999).

3.3.3.1 Marcadores genotpicos polimrficos

Para la generacin de marcadores genotpicos polimrficos fueron empleadas
diferentes tcnicas: (i) polimorfismo de tamao de productos de digestin del ADN
(RFLP); (ii) amplificacin aleatoria del ADN polimrfico por PCR (RAPD) e (iii)
impresiones digitales del ADN (Zingales, 2005).

Histricamente, estos marcadores fueron inicialmente investigados en el genoma

mitocondrial, representado por una red compleja de millares de molculas de ADN
circular, denominada cinetoplasto (Fig. 11A). En T. cruzi, el ADN mitocondrial
(kADN) representa cerca de 20 a 25% del ADN total de la clula y es compuesto por
dos tipos de molculas, los maxicrculos (20.000 pb; 50 copias por clula) y los
minicrculos (1.400 pb; 10.000 a 20.000 copias por clula). El minicrculo contiene
cuatro regiones de secuencia conservada, separadas por cuatro regiones de secuencia
variable (Fig. 11B). Las ltimas presentan alta tasa de mutacin, que confiere
diversidad entre los minicrculos de los aislados. Se explorar esta caracterstica y se
estableci el estndar de RFLP de los minicrculos de varias cepas de T. cruzi (Fig.
11C). Los estndares obtenidos (denominados esquizodemos) confirmaron su
elevada heterogeneidad (Zingales, 2005).

16
 La caracterizacin de las cepas tambin fue estudiada a travs de la tcnica de
impresiones digitales del ADN nuclear (Figura 11D); RAPD y anlisis de
microsatlites. En todos los casos fue observada la heterogeneidad gentica entre las
cepas (Zingales, 2005).

Fig. 11: A: micrografa electrnica de epimastigotes, K= cinetoplasto; B: estructura

del minicrculo; C: Perfiles de digestin del minicrculo de aislados de T. cruzi con
enzima de restriccin y anlisis por electroforesis en gel. D: impresiones digitales
del ADN nuclear. Fuente: Zingales, 2005

3.4 Biologa Molecular

El conjunto de poblaciones que circulan en hospedadores mamferos e insectos vectores,
tambin denominadas aislados o cepas, presentan una gran heterogeneidad de
comportamiento biolgico como, por ejemplo, diferentes grados de virulencia en animales
experimentales y humanos, variaciones en la sensibilidad a drogas y tropismo tisular. La
explicacin para esta diversidad fenotpica reside en el hecho de que el T. cruzi es un
organismo diploide que se multiplica predominantemente por divisin binaria. De esta
forma, el genoma de cada aislado evoluciona de manera independiente. Es interesante
destacar que la enfermedad de Chagas tambin presenta una diversidad de presentaciones
clnicas (formas indeterminada, cardaca y digestiva). De esta forma, la comunidad cientfica
enfrenta un gran desafo al identificar marcadores genticos de aislados capaces de reunirlos
en grupos discretos, buscando su caracterizacin desde el punto de vista epidemiolgico y
patgeno (Zingales, 2005).

Estudios recientes usando herramientas moleculares, demostraron que los clones de reas
endmicas puedan ser responsables de algunas manifestaciones clnicas (Andrade, 1999).

Una hiptesis sugiere que (i) la heterogeneidad y (ii) la multiclonalidad de una cepa
determina el tropismo de los tejidos y, consecuentemente, variaciones en la presentacin
clnica de la enfermedad (Andrade 1999). Una correlacin entre la diversidad gentica de T.
cruzi y su patogeneidad fue propuesta como el modelo histotrpico clonal, basado en lo
anteriormente mencionado (Oliveira et al., 1998 y Macedo & Pea, 1998).

3.4.1 Genoma
17
Se utiliz la cepa de referencia: CL Brener, seleccionada durante la reunin para la
planeacin de los Genomas de los Tripanosmidos, en 1994 (Brazil). Las caractersticas
de esta cepa por las cuales fue seleccionada como el organismo de referencia son: 1) Fue
aislada de Triatoma infestans; 2) Se diferencia en medio lquido; 3) Infecta clulas en
monocapa y posee tropismo hacia clulas musculares y cardiacas; 4) Presenta curvas
definidas de parasitemia y mortalidad en ratones; 5) Es altamente susceptible a drogas
usadas clnicamente en la enfermedad de Chagas (Maldonado, 2001).

La secuencia genmica del T. cruzi fue oficialmente publicada junto con las secuencias
genmicas completas de L. major y T. brucei, en la revista Science en 2005. El montaje
del genoma fue apenas parcial, debido a muchas dificultades con secuencias repetitivas y
con la heterozigosis del clon. De esta forma, fueron predichas 22.570 protenas, de las
cuales 12.570 forman pares allicos. Ms all de retrotransposones y otros elementos
repetitivos, haba muchos genes pertenecientes a grandes familias de protenas de
superficie (Degrave, 2005).

Ms de 50% del genoma es repetitivo (entre genes codantes repetidos, micro y

minisatlites, repeticiones LTR y no-LTR, etc.). Fueron encontrados genes
potencialmente codantes para la maquinaria de reparacin de ADN, recombinacin,
replicacin y meiosis (Degrave, 2005).

La comparacin de las estructuras genmicas y protenas con las de L. major y T. brucei

indica ms similaridad entre T. cruzi y T. brucei, una gran conservacin entre los
respectivos proteomas (excepto antgenos de superficie), a pesar de la divergencia, de 200
a 500 millones de aos atrs. Muchos proyectos se encuentran en realizacin, estudiando
genmica comparativa, reconstruccin metablica, caracterizacin bioqumica con
bsqueda de nuevos blancos para drogas, expresin gnica durante los diversos estadios
de vida del parsito, etc. (Degrave, 2005).

3.4.2 Tcnicas moleculares

La diversidad gentica de T. cruzi ha sido revelada por marcadores enzimticos,
Fragmentos de Longitud Polimrficos de Restriccin (RFLP) del ADN_cinetoplstico,
cariotipos moleculares, huellas digitales de ADN y Anlisis de ADN polimrfico
amplificado al azar (RAPD). Alternativamente, cuando los marcadores derivan de genes
18
constitutivos se utilizan, como el 24Sa rRNA y los genes mini-exn, diferentes resultados
son revelados (Fernandes et al., 1998).

3.4.2.1 La PCR en la deteccin molecular de T. cruzi

El diagnstico de la enfermedad de Chagas se basa actualmente en tcnicas
serolgicas, que son muy sensibles, pero su uso presenta problemas. Primero, la
reaccin cruzada entre T. cruzi y otros parsitos que estn presentes en una misma
rea geogrfica pudiendo generarse falsos positivos. Segundo, el estatus clnico de un
paciente no puede estar ligado a su respuesta humoral (Wincker et al., 1994).

Lo anterior, aunado en casos crnicos, donde el nmero de parsitos circulantes es

considerablemente bajo, justifican la necesidad de aplicar un mtodo ms eficiente
para la deteccin del parsito. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una
importante tcnica, cuyos principales blancos de amplificacin son el minicrculo de
ADN del cinetoplasto y secuencias nucleares repetitivas (Maldonado, 2001). La
aplicacin de la PCR para detectar T. cruzi directamente de muestras de sangre abri
nuevas posibilidades para el diagnstico de la infeccin. Estos procedimientos han
revelado una sensibilidad y especificidad altamente variable, dependiendo del
nmero de factores tcnicos, como el volumen de la muestra colectada, las
condiciones de conservacin, los mtodos de aislamiento de ADN, las secuencias del
parsito y los primers seleccionados, etc. (Schijman et al., 2011).

El diagnstico mediante PCR ha mostrado diferentes grados de variabilidad en la

eficiencia. En ese sentido, existen reportes que refieren sensibilidad del 96% al 100%
comparado con el serolgico, sin embargo, algunos autores han observado niveles de
sensibilidad ms bajos; del 94.1% hasta 90%, usando los iniciadores S35 y S36, que
pertenecen al ADN del minicrculo del cinetoplasto (Maldonado, 2001).

La PCR se usa adems para el diagnstico, para determinar si existe persistencia del
parsito en miocardio de individuos con Chagas crnico despus del tratamiento, as
como en la deteccin de T. cruzi en vectores silvestres (Dorn et al., 1999).

3.4.2.2 RADP

19
Las diferencias entre cepas, su diversidad y variabilidad gentica, son fcilmente
reveladas mediante el uso del anlisis RAPD, que prob ser una herramienta muy til
para Trypanosomas y otros parsito protozoarios. Desde su introduccin en 1990,
esta tcnica ha sido usada en taxonoma y estudios de tipificacin de
microorganismos (Urdaneta et al., 2001).

Es una tcnica mediada por PCR que usa primers cortos de sequencias al azar, que
pueden amplificar fragmentos annimos en un blanco del ADN, generando mltiples
patrones de bandas que pueden ser especficas. Las ventajas de esta tcnica son (i) el
requerimiento de mnimas cantidades de blancos ADN, (ii) la aceptacin de un
nmero ilimitado de primers, (iii) no requieren un conocimiento previo de las
secuencias a amplificar (Devera et al., 2003).

Podemos destacar que los datos de RAPD pueden ser utilizados para la construccin
de dendrogramas y que los microsatlites permiten determinar si un aislado de T.
cruzi es una poblacin monoclonal o multiclonal (Zingales, 2005).

3.4.2.3 RFLP
Los genes ARN ribosomal (rRNA) son altamente conservados y tienen potencial para
anlisis filogentico en tripanosmidos. En estos protozoos, el rADN se encuentra en
secuencias repetidas. Utilizando los espaciadores internos transcritos (ITSs) se pudo
aplicar para caracterizacin molecular de cepas de T. cruzi. Los resultados muestran
que el RFLP-ITS rDNA tiene gran resolucin para distinguir la variabilidad intra-
especfica en T. cruzi. Tambin permite hacer un clustering geogrfico de aislado d T.
cruzi (Devera et al., 2003).

Estudios realizados mediante el anlisis de la diversidad gentica entre las

poblaciones Z3 de Brazil usando tcnicas de RFLP-ITS rDNA, muestran que los
aislados pueden ser divididos en dos sub-grupos con orgenes filogenticos distintos
(Kawashita et al., 2001).

3.4.2.4 Microsatlites
Son secuencias repetitivas en el ADN que estn dispersadas en el genoma. El nmero
de copias de las unidades repetidas en un loci especfico es extremadamente

20
 polimfica. Debido al polimorfismo, los microsatellites son considerados como
marcadores a elegir con diversas aplicaciones en diferentes reas, como ecologa
gentica de poblaciones y reconstrucciones filogenticas (Harr et al., 2000).

Para T. cruzi, los microsatlites son utilizados para estudios de gentica de

poblaciones, filogentica y para definir la clonalidad de ciertas cepas (Devera et al.,
2003). La metodologa implement primers fluorescentes al PCR y determinacin
del tamao de los alelos, as se observ que las cepas de T. cruzi son diploides y
multiclonales (Oliveira et al., 1998).

3.4.3 Estructura gentica poblacional

Los pacientes de reas endmicas pueden infectarse por mltiples contactos con
diferentes triatomineos, y stos, a su vez, se pueden alimentar de diferentes individuos
infectados. Esta promiscuidad es propicia para la formacin de poblaciones
multiclonales tanto en los hospedadores como en los vectores, producindose as el
aislamiento de cepas multiclonales cuando crecen en cultivo. El estudio de poblaciones
de T. cruzi de diferentes orgenes, ha demostrado la presencia de un gran nmero de cepas
con caractersticas biolgicas, inmunolgicas, bioqumicas y de respuesta farmacolgica
diferentes (Bruss et al., 2009).

Las isoenzimas, (formas moleculares diferentes de una misma enzima) han sido
ampliamente utilizadas para clasificar al T. cruzi. Diferentes zimodemos (grupo de cepas
que comparten el mismo patrn isoenzimtico para un set de enzimas) han sido
detectados en cepas aisladas de varios hospedadores y regiones geogrficas, permitiendo
la tipificacin de las poblaciones. Debido al polimorfismo biolgico, diferentes clones de
una cepa podran presentar un tropismo especial por diferentes tejidos y as ser un factor
determinante en el curso clnico de la enfermedad (Bruss et al., 2009).

3.4.3.1 Gen Mini-exn

Para el AND nuclear, hay varias herramientas moleculares disponibles para
caracterizar a cepas de T. cruzi. El gen mini-exn (ME) est presente en el genoma
nuclear de los Kinetoplstidos en aproximadamente 200 copias, arregladas en
secuencias repetidas en tndem, consistiendo en tres regiones distintivas: exn,
intrn y regin intergnica. El exn tiene 39 pares de bases, altamente conservadas
21
entre los componentes del Orden. El intrn es conservado moderadamente entre las
especies del mismo gnero y sub-gnero. Y la regin intergnica es disimilar entre
las especies (Fernandes et al., 2001).

3.4.3.2 Linajes de T. cruzi

Como contrapartida a la gran diversidad gentica de las cepas, evidenciada por las
diferentes tcnicas y al anlisis de secuencias con una tasa de evolucin menor, los
genes de ARN ribosmico (marcadores clsicos de evolucin, y los genes de mini-
exn) utilizados para la taxonoma de tripanosomtidos, mostraron un claro
dimorfismo entre los aislados (Fig. 12), determinando su divisin en dos grupos. El
anlisis de 50-60 loci por RAPD mostr que los dos grupos corresponden a dos
grandes linajes filogenticos. Se verific que los dos linajes se separaron hace mucho
tiempo (de 10 a 40 millones de aos). Estos fueron confirmados utilizando otros
abordajes metodolgicos y, pasaron a ser denominados grupos T. cruzi I y T. cruzi II,
en 1999 (Zingales, 2005).

Fig. 12: Tipificacin molecular de aislados de T. cruzi. Ensayos de PCR para el gen
de rARN 24Sa y para el espaciador intergnico del gen de mini-exn permiten
dividir los aislados en dos grupos. La PCR para 24Sa origina un producto de 110 pb
para TcI y de 125 pb para TcII. La PCR para mini-exn origina el producto de 350
pb para TcI y 300 pb para TcII. Fuente: Zingales, 2005.

El T. cruzi es una especie muy polimrfica y su estructura poblacional est lejos de

ser completamente comprendida. Durante muchos aos, prevaleci la idea de que las
poblaciones de T. cruzi no podran ser agrupadas en clusters discretos que
representasen taxones naturales de la especie. Al contrario, fue propuesta una
estructura multiclonal para las poblaciones de T. cruzi, en las cuales diferentes clones
evolucionaran bsicamente por la reproduccin clonal a partir de un ancestral comn
ms antiguo. Entretanto, la identificacin de significativa similaridad entre algunas
poblaciones de T. cruzi, revelada por diferentes marcadores moleculares, gener un
consenso sobre la existencia de, por lo menos, dos linajes filogenticos principales
dentro de la especie. La dicotoma inicial propuesta para el T. cruzi fue
posteriormente reforzada con una gran variedad de otros marcadores
22
epidemiolgicos, bioqumicos, biolgicos y moleculares, pero la denominacin de
los grupos principales en los diferentes trabajos era muy confusa (Macedo, 2005).

La distribucin epidemiolgica de los grupos T. cruzi I y T. cruzi II fue investigada,

concluyendo que las cepas del grupo T. cruzi I predominan en el ciclo silvestre y cepas
del grupo T. cruzi II en el ciclo domstico de la transmisin del parsito. En los pases
del Cono Sur, aislados de T. cruzi II son los principales responsables por las
manifestaciones clnicas de la enfermedad de Chagas (Fig. 13) (Zingales, 2005).

Fig. 13: Ciclos epidemiolgicos del T. cruzi. Parsitos T. cruzi I

predominan en los reservorios silvestres, mientras los parsitos T. cruzi II
son responsables por la enfermedad de Chagas en el ciclo domstico. La
conexin entre los dos ciclos la realizan los vectores que albergan T. cruzi
II e invaden los domicilios (Zingales, 2005).

En Colombia tambin se ha reportado la presencia simultnea de los dos grupos

filogenticos en varias de las cepas estudiadas, evidenciando una mezcla de ambos,
pero con predominio del grupo I en medios de cultivo. Este resultado, junto con el
hallazgo de los dos grupos de T. cruzi en las heces de vectores recolectados de
poblaciones silvestres del norte de Colombia, sugiere la posibilidad de que ambos
grupos circulan de manera simultnea en la naturaleza, generando una epidemiologa
ms compleja, pues tanto vectores como hospederos podran estar infectados con los
dos grupos y, en stos ltimos, darse un tropismo diferencial a tejidos ocasionando
manifestaciones clnicas diversas (Botero et al., 2007).

Subsecuentemente, utilizndose anlisis de isoenzimas y RAPD, se propuso la

subdivisin del taxn T. cruzi en seis linajes o DTUs (Discret Taxonmica Units) I,
IIa, IIb, IIc, IId, IIe, siendo el DTU I correspondiente al linaje T. cruzi I y el DTU IIb
correspondiente al linaje T. cruzi II. Los sublinajes IIa, IIc-e incluyen las cepas
hbridas y aquellas pertenecientes al zimodema 3. A pesar de no haber sido
oficialmente recomendada, esta nomenclatura es muy mencionada por la comunidad
cientfica (Macedo, 2005).

23
 La equivalencia de las nomenclaturas de los principales grupos o linajes de T. cruzi,
determinados a travs del uso de diferentes metodologas bioqumicas y moleculares
se presenta en el Cuadro 1.

Cuadro 1: Correspondencia entre la nomenclatura recomendada

para T. cruzi y otras denominaciones definidas por diferentes
marcadores bioqumicos y moleculares a, b. Fuente: Zingales, 2005

Se deben destacar dos puntos: (i) en pases del norte de Amrica del Sur y en Amrica
Central y Mxico la enfermedad de Chagas puede ser motivada por cepas del grupo T.
cruzi I; y (ii) en los pases del Cono Sur, aislados del grupo T. cruzi II inducen a diferentes
presentaciones clnicas de la enfermedad de Chagas. De esta forma, parece claro que la
patognesis de la enfermedad de Chagas resulta de la interrelacin entre las caractersticas
genticas (y, por lo tanto, biolgicas) de los aislados del parasito y las caractersticas
inmunogenticas del hospedador humano. En este momento, estos marcadores genticos
son activamente investigados ya que podrn ser usados para pronosticar la evolucin de la
enfermedad y, consecuentemente, sern tiles en la adopcin de procedimientos
teraputicos en el mbito del Sistema de Salud (Zingales, 2005).

La naturaleza clonal de T. cruzi, ha permitido la utilizacin de marcadores bioqumicos y

moleculares para agrupar fenotipos y genotipos del parsito que pueden mostrar

24
diversidad biolgica, bioqumica y molecular, sean distribuidos o no en una misma rea
geogrfica:
T. cruzi I (Tc I, Z1, DTU I), subpoblacin homognea, considerada ms antigua,
asociado primariamente a ambientes silvestres y sinantrpicos, especialmente a
mamferos didlfidos. Es el grupo de mayor frecuencia desde la cuenca amaznica hacia
el norte de Suramrica y Centro Amrica, aun en ambientes domsticos (Herrera, 2010).
T. cruzi II (Tc II, Z2, DTU IIb), subpoblacin ms heterognea atribuyndose hasta 5
variantes genticamente segregadas; de gran abundancia en el Cono Sur. Frecuente en el
ciclo domstico (Herrera, 2010).
T. cruzi III (Z3-A, DTU IIC), subpoblacin asociada a la transmisin enzotica. Se le
ha encontrado en mamferos terrestres y cavadores, y ocasionalmente en casos
humanos; se le ha atribuido su aparicin a eventos de hibridizacin (Herrera, 2010).
T. cruzi IV (Z3-B, DTU IIa), subpoblacin asociada a enzootias, registros en canidos
silvestres y ocasionalmente en humanos. Origen atribuido a eventos de hibridizacin.
T. cruzi V (Cepa Boliviana Z2, rDNA , clonet 39, DTU IId), subpoblacin asociada a
ciclos de transmisin domsticos con origen quizs en la hibridizacin de
subpoblaciones domsticas y silvestres. En humanos y en los triatominos de mayor
abundancia del Cono Sur (Herrera, 2010).
T. cruzi VI (Cepa Paraguaya Z2, Zymodema B, DTU IIe), subpoblaciones asociadas a
casos humanos y, frecuentemente asociada a triatominos domiciliados del cono Sur. Su
origen se atribuye al menos a dos procesos de hibridizacin (Herrera, 2010).

3.4.3.2.1 Haplotipos
En Colombia se descubrieron cuatro haplotipos en el grupo T. cruzi I: haplotipo I
est relacionado con infecciones humanas y Rhodnius prolixus domiciliarios;
haplotipo Ib corresponde al ciclo peridomstico, en relacin con Triatoma
dimidiata; haplotipo Ic es asociado con aislados peridomsticos; y haplotico Id
es relacionado con el ciclo silvestre de aislados de vectores silvestres y
mamferos. La identificacin de los haplotipos dar lugar a una mayor
comprensin sobre la dinmica de transmisin del parsito y su influencia en
caractersticas clnicas (Falla et. al, 2008).

25
3.4.3.3 Implicaciones clnicas de la variabilidad gentica del T. cruzi
Si se adopta una posicin sobre la decisin poltica y econmica de desarrollar
programas precisos y sustentables para el control vectorial de la transmisin de
Trypanosoma cruzi en las regiones del continente americano, se requerirn todava
herramientas ms eficaces para prevenir la presencia del vector en el hbitat
domstico, medir la transmisin del parsito al ser humano, el diagnstico preciso y
oportuno de la infeccin, el tratamiento teraputico, la prognosis de desarrollo del
cuadro crnico, as como de tratamientos de largo alcance. Los conocimientos sobre
la gentica/genoma y los proteomas del vector y el parsito sern esenciales para
desarrollar instrumentos precisos y eficaces para complementar las soluciones
socioculturales e impedir la transmisin (Lpez-Ordez et al., 2009).

Una de las cuestiones ms intrigantes en la enfermedad de Chagas se relaciona al

posible papel de la diversidad gentica de las poblaciones de T. cruzi en la
determinacin de las diferentes formas clnicas de esta parasitosis. Se conoce poco
sobre los factores determinantes de las manifestaciones clnicas de la enfermedad e,
incluso, siendo cuestionada la existencia de un papel relevante del parsito en este
proceso. De hecho, los seres humanos pueden ser considerados como un accidente
reciente en la historia evolutiva del T. cruzi. Se estima que el T. cruzi naci como
especie hace 150 millones de aos, pero probablemente el primer contacto con el
hombre fue mucho ms reciente, hace aproximadamente 15.000 aos. De esta forma,
resulta natural suponer que ni toda la poblacin de T. cruzi pueda infectar seres
humanos y causar la enfermedad de Chagas (Macedo, 2005).

El mecanismo por el cual las diferentes formas clnicas de la enfermedad se

establecen an permanece oscuro. Sin dudas, factores asociados al paciente estn
involucrados, pero queda cada vez ms evidente la existencia de un papel
fundamental asociado a aspectos genticos del parsito. Por otra parte, a despecho
del empeo de varios investigadores en este sentido, an no fue posible correlacionar
la diversidad gentica de los parsitos con las caractersticas clnicas de la
enfermedad. Una posible explicacin para esta aparente ausencia de correlacin es
que varias cepas de T. cruzi estn formadas por diferentes subpoblaciones o clones
que pueden presentar tropismo para diferentes tejidos. As, un factor importante en la
26
 determinacin del curso clnico de la enfermedad parece ser la constelacin de clones
infectantes y sus tropismos especficos. Como la mayora de las tcnicas usadas para
el genotipificacin del T. cruzi requiere el aislamiento del parsito de la sangre del
paciente y su manutencin en cultivo, hay una amplia oportunidad para que suceda la
seleccin clonal, de manera que las poblaciones de parsitos disponibles para los
anlisis pueden ser diferentes de aquellos que realmente causan la lesin del tejido y,
probablemente, las manifestaciones clnicas. Lo que constituye el ncleo del modelo
histotrpico clonal, que presupone la necesidad de analizar la diversidad gentica de
los parsitos directamente en los tejidos infectados. Actualmente, se dispone de una
serie de marcadores con sensibilidad suficiente que sern utilizados en estudios de
genotipificacin del T. cruzi directamente en tejidos de pacientes, lo que abre nuevos
horizontes para la ecoepidemiologa molecular de la enfermedad (Macedo, 2005).

3.4.4 ADN y ARN

Todos los organismos poseen un genoma que controla su crecimiento, supervivencia e
interaccin con el ambiente. El metabolismo del ADN est conservado en todos los
organismos estudiados hasta el momento y puede ser inserido en los 3R del ADN, o sea,
replicacin, reparacin y recombinacin. El estudio de esta rea en tripanosomtidos es
un campo prometedor que, junto con las informaciones del proyecto genoma, ha trado
informaciones importantes sobre la biologa de ese organismo (Machado, 2005).

El tamao del genoma nuclear en el caso de Trypanosoma, se ha estimado en 3 a 4x107

pares de bases, el contenido de ADN vara entre especies, subespecies y cepas. En
algunas especies hay hasta 100 000 copias de estas secuencias conservadas y altamente
repetidas, hacindolas un blanco atractivo para mtodos diagnstico basados en
reacciones de amplificacin (Ledezma, 2003).

El Trypanosoma cruzi es miembro de la orden Kinetoplastida, uno de los linajes

eucariticos evolutivamente ms antiguos, caracterizado por la organizacin peculiar de
su ADN mitocondrial y por sus mecanismos de expresin gnica con varios aspectos
poco comunes cuando los comparamos con otros eucariotas. Casi todos los genes de
protena de este organismo estn organizados en grupos que son coordinadamente
transcriptos en precursores de mARN policistrnicos. Ya que en T. cruzi, como en los

27
dems eucariotas, solamente mARNs monocistrnicos son traducidos, los precursores de
mARN policistrnicos deben ser procesados hasta mARNs individuales. Este
procesamiento es realizado a travs de una combinacin de trans-splicing 5, clivaje y
poliadenilacin 3 (Urmenyi, 2005).

3.4.5 Regulacin de la expresin gnica

El Trypanosoma cruzi, as como otros tripanosomtidos, presenta algunas caractersticas
peculiares en trminos biolgicos, que se reflejan en la organizacin y funcin de su
genoma. La constitucin gentica del T. cruzi demuestra la existencia de un gran
polimorfismo, teniendo como consecuencia una significativa variacin en la cantidad de
ADN nuclear y en el nmero de cromosomas entre diferentes aislados del parsito.
Diferentes a la mayora de los organismos eucariticos, los genes de T. cruzi y de los
otros tripanosomtidos no son en general interrumpidos por las secuencias de insercin
(intrones) (Goldenberg, 2005).

Los genes son transcriptos, procesados continuamente y su expresin es entonces

regulada por el transporte selectivo para el citoplasma, sea por la estabilidad del mARN o
por la seleccin de las secuencias de mARN que sern traducidas, a travs de un
mecanismo de movilizacin polisomal diferencial. En el caso de la estabilidad, la mayor
parte de los estudios se concentran en demostrar el papel de la regin 3-no codante (3-
UTR). Obviamente, la secuencia UTR en s, no tiene papel regulador, pero si las
protenas a ellas asociadas. Entonces, estas protenas podran modular la expresin
gnica, participando de la seleccin de las secuencias de ARN mensajero a ser traducidas,
ya que varias evidencias apuntan para un mecanismo de movilizacin selectiva de
secuencias de mARN para los polisomas (Goldenberg, 2005).

An hay un gran campo a ser dilucidado e investigado con relacin a la regulacin de la

expresin gnica en tripanosomtidos. Con la determinacin de la secuencia genmica de
los tres tripanosomtidos de relevancia para la salud humana (T. cruzi, T. brucei y
Leishmania major), con el uso de herramientas de anlisis genmico y posgenmico y
con el avance de los estudios dedicados a la epigentica, nuevos mecanismos debern ser
descubiertos (Goldenberg, 2005).

3.4.6 Variabilidad gentica del kADN

28
Durante el ciclo vital de los parsitos de la Familia Trypanosomatidae ocurren
transformaciones morfolgicas en una sucesin sincrnica con cambios de aspecto,
tamao y ubicacin del kinetoplasto. La organela cumple un doble papel: uno funcional,
como mitocondria para garantizar la sobrevivencia de los estadios dependientes de
fosforilacin oxidativa, y otro como reservorio de heterogeneidad poblacional del
genoma extra-nuclear. Varios de los rasgos inusuales de los tripanosomatdeos (trans-
splicing, edicin de los ARN mitocondriales y escasez de intrones), son comunes en los
kinetoplastidios desde antes de la adopcin del parasitismo (de Lima et al., 2006).

La extensa heterogeneidad de la secuencia de millares de molculas de minicrculos que

conforman la estructura en red del ADN del cinetoplasto, ha posibilitado el uso del kADN
como un ptimo modelo de estudios de tipificacin molecular del Trypanosoma cruzi.
Los primeros relatos de polimorfismo de ADN en T. cruzi son de 1980 y se basaron en los
anlisis de los tamaos de los fragmentos de restriccin (RFLPs) de las molculas de
minicrculos del kADN. Los estndares de restriccin generados permitieron la
caracterizacin de diferentes cepas y clones del parsito, los cuales fueron agrupados en
subpoblaciones, en funcin de la semejanza de los perfiles de los productos de digestin
del ADN de minicrculos por endonucleasas de restriccin. De esta forma, poblaciones de
parsitos que presentaban estndares de restriccin idnticos o semejantes fueron
denominadas esquizodemas (Britto, 2005).

Los anlisis de los perfiles de digestin de kADN de T. cruzi revelaron una extrema
diversidad gentica intraespecfica, demostrando por primera vez que una nica cepa del
parsito poda contener dos o ms genotipos clonales diferentes, representando
probablemente clones que existen naturalmente y que fueron genticamente aislados uno
del otro con el pasar del tiempo. La existencia de estas cepas multiclonales fue
confirmada ms tarde por varios grupos, usando diferentes abordajes. La clasificacin de
las cepas de T. cruzi en esquizodemas sirvi como importante herramienta
epidemiolgica para monitorear cepas especficas en la naturaleza, as como para
entender el posible papel de la diversidad gentica de T. cruzi en el sndrome de la
enfermedad (Britto, 2005).

29
A travs de la secuenciacin de ADN de minicrculos de diferentes cepas y aislados de T.
cruzi, fue demostrado que cada molcula de aproximadamente 1.400 pares de bases, se
encontraba organizada en cuatro pequeas regiones de 120 pb, dispuestas una con
relacin a la otra en ngulos de 90, las cuales presentaban un alto nivel de conservacin
de secuencia intra-especie. Esas regiones conservadas se presentaban intercaladas por
regiones mayores, de 330 pb, que exhiban una extrema variabilidad de secuencia entre
los millares de minicrculos que conforman la red de kADN (Fig. 13) (Britto, 2005).

El descubrimiento de que los minicrculos de kADN en T. cruzi contenan segmentos

repetidos (conservados) y abundantes, denominados mini-repeats, hizo con que estas
molculas fuesen blancos ideales para el desarrollo de procesos moleculares de deteccin
y tipificacin de este parsito. Podemos considerar que la identificacin de los mini-
repeats en los minicrculos de T. cruzi represent un marco, por las perspectivas y
oportunidades que abri para nuevos abordajes en estudios de laboratorio y diagnsticos,
clnicos y epidemiolgicos, de la enfermedad de Chagas (Britto, 2005).

Fig. 13: Representacin esquemtica del minicrculo mostrando la organizacin

de las cuatro regiones conservadas (rectngulos azules), de aproximadamente
120 pb cada una, conteniendo los bloques de secuencias ms conservadas de la
molcula: BSC-1, BSC-2 y BSC-3 (rectngulos negros). Los iniciadores para la
amplificacin por la PCR, para uso diagnstico, fueron diseados a partir de las
secuencias de esos bloques conservados. Las regiones con secuencias
hipervariables de los minicrculos de 330 pb (flecha roja) se encuentran
intercaladas con las regiones conservadas. Fuente: Britto, 2005

Para fines comparativos, el anlisis del kADN por esquizodemos tiene las ventajas
siguientes: (a) los genes mitocondriales son pequeos en tamao y complejidad, lo que
facilita el anlisis con endonucleasas de restriccin y su secuenciamiento; (b) las
secuencias de ADN mitocondrial cambian mucho ms rpidamente que los genes
nucleares, de ah son ms tiles para comparar organismos con divergencias recientes; (c)
el genoma de la organela muestra ms polimorfismo dentro de una especie, revelando
detalles de la estructura poblacional que no son obtenibles por otros mtodos; (d) el
kADN es resistente a la manipulacin. Una de las aplicaciones ms comunes de la tcnica
de esquizodemos es la caracterizacin de aislados de regiones geogrficas. Tambin se ha
30
utilizado con xito para discriminar entre especies relacionadas de tripanosomatideos
como T. cruzi y T. rangeli y varias especies de Leishmania (de Lima et al., 2006).

La variabilidad gentica de los minicrculos de ADN puede ser estudiada con una
diversidad de tcnicas entre las cuales estn las: endonucleasas de restriccin (RFLP) y
LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer-PCR) (Bruss et al., 2009).

Posteriormente se pudo establecer una mayor diversificacin del parsito, empleando

estas mismas secuencias mediante la tcnica PCR multiplex permitiendo su clasificacin
como T. cruzi-I, T. cruzi-II, T. cruzi Z3 o T. rangeli. Tambin, mediante la utilizacin de
fragmentos de restriccin polimrficos se logr la ampliacin de T. cruzi-II en cinco
subgrupos denominados IIa, IIb, IIc, IId y IIe. Sin embargo, la mayor deteccin de
variabilidad gentica en T. cruzi ha sido obtenida mediante la amplificacin de la regin
de minicrculos del kADN, reafirmando la validez de la tcnica de esquizodemos para
detectar subpoblaciones de parsitos asociadas a ciertos factores como aislamiento de
cepas a partir de un hospedador, condiciones de mantenimiento en el laboratorio y
patogenicidad entre otros (de Lima et al., 2006).

Es evidente que no existe una nica tcnica que rena todos los criterios que la encuadren
dentro de la tcnica ideal como mtodo de estudio para el polimorfismo gentico de T.
cruzi, por lo tanto es importante tener un men de protocolos, o al menos varios mtodos
diversos cuando se quiere abordar este tema (Bruss et al., 2009).

3.4.7 Variabilidad gentica e isoenzimtica de T. cruzi

En diversos estudios, se ha visto que las diferentes formas de la enfermedad de Chagas
presenta una distribucin geogrfica peculiar, siendo algunas formas ms frecuentes en
determinadas regiones endmicas y raras en otras. Los factores determinantes de esta
variabilidad clnica y epidemiolgica no estn completamente comprendidos, pero se
sabe que en ello estn implicados aspectos asociados tanto al hospedero como al parsito.
La variabilidad en la patogenecidad de T. cruzi depende de diversos factores, como el
polimorfismo gentico del parsito, el tropismo, los constituyentes antignicos, la carga

31
 parasitaria, as como tambin a otros factores relacionados con el hospedero (Ledezma,
2003).

La variabilidad en su comportamiento biolgico y la heterogeneidad que presenta T. cruzi

en su caracterizacin bioqumica y molecular, han impedido establecer parmetros
adecuados para su clasificacin y taxonoma, lo que ha hecho que su caracterizacin sea
una condicin necesaria para su estudio y control (Ledezma, 2003).

Se ha visto que en su mayora las enfermedades transmitidas mediante vectores,

presentan una inmensa variabilidad gentica. En el caso del parsito causante del mal de
Chagas, el Trypanosoma cruzi, se ha descrito una gran heterogeneidad isoenzimtica.

Trypanosoma cruzi se presenta como una poblacin heterognea que circula entre
diferentes reservnos, el vector y el hombre, y presenta diferencias respecto a la
parasitemia, la virulencia, patogenicidad, sensibilidad a drogas, en la interaccin con
drogas, etc. (Brisse et al., 2000).

La variabilidad isoenzimtica de cepas de T. cruzi, ha sido ampliamente estudiada, y se

han obtenido datos que han permitido concluir en la multiplicacin asexuada del parsito,
dando lugar as a una estructura poblacional esencialmente clonal (Olea, 2001).

Se han realizado investigaciones que muestran que estas poblaciones de clones pueden
presentar propiedades biolgicas diferentes. En estas poblaciones se encuentran
subgrupos evolutivos, como linajes de clones que permiten realizar estudios integrados de
la biologa, ecologa y epidemiologa de estos organismos (Bosseno et al., 2000).

Captulo IV
CONCLUSIONES
La enfermedad de Chagas es causada por el parsito protozoario Trypanosoma cruzi, que
principalmente se transmite por las heces contaminadas del vector (vinchucas), a hospederos
mamferos, los cuales, depende del tropismo del parsito, en la etapa crnica presentan
padecimientos cardiacos, digestivos y hasta nerviosos. El diagnstico, depende la fase, se realiza
exmenes parasitolgicos, serolgicos principalmente y actualmente moleculares.

32
La Tripanosomiasis americana, pese a diferentes esfuerzos de control y erradicacin, sigue siendo
una enfermedad que afecta a gran parte de Latino Amrica; pases endmicos como Bolivia, no
cuentan todava con un tratamiento eficaz; ms an que esta enfermedad ya no es solo rural, sino
que est afectando tambin al rea urbana; y por migraciones humanas, se extendi a pases no
endmicos, siendo una alarma para el primer mundo. El poco entendimiento de la biologa,
bioqumica y gentica del parsito Trypanosoma cruzi, deja vacos de informacin para un
diagnstico correcto e inmediato, la aplicacin de tratamientos eficaces y una posible erradicacin.

Al ser esta enfermedad de importancia, por lo antes mencionado, ya se cuenta con mayores
conocimientos a nivel molecular, especialmente aspectos genticos que fueron estudiados en el
extranjero con cepas de pases endmicos, por lo que se cuenta con diferentes tcnicas, como el
PCR, RAPD, RFLP y otros, llevando esto a mostrar que el T. cruzi presenta una amplia diversidad
y variabilidad gentica, existiendo seis linajes, cada uno preferente de algn rea geogrfica, con
diferentes tropismos y ciclos.

La diversidad gentica entre las cepas del T. cruzi fue ampliamente documentada. La clasificacin
de las cepas en grupos permitir estudiar mejor las caractersticas relacionadas al pronstico y
tratamiento de la enfermedad de Chagas. Por lo que aunque existen investigaciones,
principalmente en el extranjero, y muy pocas en nuestro pas, el mecanismo por el cual las
diferentes formas clnicas de la enfermedad se establecen y otros aspectos an permanecen
oscuro. Sin dudas, factores asociados al paciente estn involucrados, pero queda cada vez ms
evidente la existencia de un papel fundamental asociado a aspectos genticos del parsito. Lo
que muestra la importancia de estudios moleculares y genticos del parsito para posteriormente
poder correlacionarlos con otros factores y entender ms a este agente causal, y luego
proporcionar las herramientas para que se desarrollen diagnsticos y tratamientos eficaces.
Captulo V
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