USO DE DILUTORES HIPERTNICOS EN LA CRIOPRESERVACIN

DE SEMEN OVINO

Hernn Guerrero V.
1
, Wilfredo Huanca L.
1, 2
, Fernando Raymundo
T.
1
, Sandra Huerta O.
1
y Daphne Ramos D.
3


1
Laboratorio de Reproduccin Animal,
3
Laboratorio de Salud Pblica y
Salud Ambiental, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional
Mayor de San Marcos, Lima
2
E-mail: whuanca2002@yahoo.com

RESUMEN
Se evalu el efecto crioprotector de dos dilutores hipertnicos (Trealosa
y Lactosa) sobre las caractersticas postdescongelamiento del semen
ovino (n=4). La composicin de los dilutores base incluy Tris 27.1 g/l,
cido ctrico 14.0 g/l, fructosa 10.0 g/l, glicina 10.0 g/l, yema de huevo
10.0 % (v/v) y glicerol 6.5 % (v/v). El semen colectado con vagina
artificial tuvo las siguientes caractersticas: volumen: 1.1 0.1ml,
concentracin espermtica: 3.5 0.1 x 109 /ml, motilidad individual:
87.0 2.4%, motilidad masal (escala 0-5): 4.4 0.2, espermatozoides
vivos: 90.2 3.8% y anormales 1.8 0.7%. El semen fue congelado
en pajillas de 0.5 ml y conservado en nitrgeno lquido. Las pajillas
fueron descongeladas luego de 3 meses para su evaluacin. Se obtuvo
una motilidad individual de 40.3 5.9 y 30.0 5.0% y un nmero de
espermatozoides vivos de 34.4 6.6 y 24.4 5.0 para los dilutores
Trealosa y Lactosa, respectivamente. El mejor resultado se obtuvo al
utilizar el dilutor hipertnico Trealosa por tener mejores caractersticas
de motilidad individual y espermatozoides vivos postdescongelamiento.

Objetivo: Evaluar el efecto crioprotector en la congelacin de semen de
carnero de dos dilutores con altas concentraciones de disacridos
(trealosa y lactosa) sobre las caractersticas fsicas del semen de ovinos
Blackbelly.

INTRODUCCION
Con el fin de evitar el dao durante el proceso de congelamiento, se han
desarrollado numerosos diluyentes en base a amortiguadores de pH
(tris, cido ctrico), azcares de bajo peso molecular (fructuosa,
glucosa) que pasan a travs de la membrana celular sirviendo como
fuente de energa para el esperma, agentes protectores de membrana
(yema de huevo, leche descremada) que contienen macromolculas que
proveen proteccin contra el shock por fro, y crioprotectores (glicerol y
otros polialcoholes, aminocidos) que reducen la formacin intracelular
de cristales de hielo durante el proceso de congelado-descongelado
(Molinia et al., 1994; Salamon y Maxwell, 1995). Adicionalmente, otros
componentes tales como azcares no difundibles (lactosa, sucrosa,
dextrano, trealosa) han sido empleados porque proveen proteccin al
enfriamiento mejorando la restauracin postcongelamiento del esperma.
Aunque se reduzca la viabilidad y fertilidad de los espermatozoides.

MATERIALES Y METODOS
Las muestras de semen se colectaron entre abril y julio de 2003 de
cuatro ovinos entre 2 a 3.5 aos de edad, del fundo El Cortijo, situado
en el km 75 de la Panamericana Sur (Lima - Per).

Mtodo de colecta: El semen se colect con una frecuencia de dos
veces por semana y por un periodo de tres meses. El semen,
inmediatamente despus de su coleccin, se conserv a 37 C para su
evaluacin. Se utilizaron los eyaculados que tuvieron un volumen 0.4
ml, una concentracin espermtica superior a 2,000 x 106
espermatozoides/ml, una motilidad masal 4, una motilidad individual
70% y <15% de anomalas espermticas.

Cuadro 1. Composicin de dos dilutores para su utilizacin en la
congelacin de semen ovino.

COMPONENTE DILUTOR
TRIS -
TREALOSA
TRIS - LACTOSA
DILUYENTE
BASE
Tris
cido ctrico
Fructosa
Glicina
Yema de huevo
27.1 g/l
14.0 g/l
10.0 g/l
10.0 g/l
10.0% (v/v)
27.1 g/l
14.0 g/l
10.0 g/l
10.0 g/l
10.0% (v/v)
DILUYENTE
HIPERTNICO
Diluyente base +
Trealosa 76.0 g/l
+
Glicerol 6.5%
(v/v)
Diluyente base +
Lactosa 76.0 g/l
+
Glicerol 6.5%
(v/v)

Cuadro 2. Caractersticas seminales reportadas en la literatura cientfica
para ovinos de pelo.

BLACKBELLY1 PELIBUEY2
Volumen (ml) 1.5 0.1 1.1 0.2 0.6 0.3
Motilidad
individual (%)
83.6 1.4 75.3 4.1 87.7 4.6
Concentracin
espermtica (x
109/ml)
3.7 0.2 3.6 1.0 4.2 1.2
Motilidad masal - - 4.2 0.2 - -
Espermatozoides
vivos (%)
- - 89.2 85.4 7.1
Espermatozoides
anormales (%)
- - 4.5 0.6 13.6 5.2
1 Quispe et al., 1998
2 Manco, 1999, y Carmenate y Hernndez, 1982, respectivamente.

Cuadro 3. Valores seminales de ovinos Blackbelly utilizados como
reproductores en el valle de Lima.

Promedio Mximo Mnimo
Volumen (ml) 1.1 0.1 1.4 0.8
Motilidad
individual (%)
3.5 0.1 3.3 3.8
Concentracin
espermtica (x
109/ml)
87.0 2.4 95 80
Motilidad masal 4.4 0.2 5 4
Espermatozoides
vivos (%)
90.2 3.8 95 80
Espermatozoides
anormales (%)
1.8 0.7 5 0

Cuadro 4. Efecto de los dilutores Tris-Treaosa y Tris-Lactosa en la
motilidad individual y porcentaje de espermatozoides vivos post-
descongelamiento de semen de ovino Blackbelly.

Dilutor Tris-Trealosa Dilutor Tris-Lactosa
Anima
l
Eyaculado
s
(n)
Motilida
d
(%)
Esperm
.
Vivos
Eyaculado
s
(n)
Motilida
d
(%)
Esperm
.
Vivos
(%) (%)
1 12 47.4
11.0
38.3
9.1
11 25.0
7.6
17.1
6.9
2 11 25.0
7.7
18.5
8.3
12 23.0
8.0
22.8
8.0
3 12 39.5
12.0
33.1
13.1
12 29.0
9.6
25.6
10.3
4 12 48.9
11.5
46.4
16.4
11 43.6
10.9
31.8
11.8
Total 47 40.3
5.9a
34.4
6.6
46 30.0
5.0b
24.3
5.0
ab Superndices con letras diferentes son significativamente diferentes
(p<0.05)


RAZONAMIENTO

1. Se encontr diferencia estadstica significativa (p<0.05) entre los
dilutores por encontrarse mejor respuesta en el de trealosa, en
trminos de motilidad y porcentaje de vivos
postdescongelamiento.

2. Es posible que el deterioro en la motilidad se haya debido a la
distancia entre el lugar de muestreo y el lugar de procesamiento
de las muestras, as como el manejo de los eyaculados;

3. La ventaja de la trealosa se basa en el efecto protector
estabilizante de la membrana celular, lo cual se refleja en la
integridad acrosomal. Adems, tiene un efecto deshidratante por
ser un medio hipertnico, resultando en una menor formacin de
cris tales.

CONCLUSIN
Se concluye que el dilutor hipertnico trealosa muestra un mejor
comportamiento en la criopreservacin de semen ovino con respecto al
dilutor lactosa, posiblemente por el efecto protector de membrana,
mejorando las caractersticas de motilidad individual y porcentaje de
espermatozoides vivos
postdescongelamiento.

CONCLUSIONES
Estudio Congelacin semen Descongelacin
semen
Criopreservacin de
semen ovino
empleando tres
dilutores y cuatro
combinaciones de
agentes
crioprotectores
permeantes y no
permeantes.

Las pajillas fueron
congeladas con los
vapores de nitrgeno
lquido; para tal efecto,
se disminuy la
temperatura de 5 a -25
C en un lapso de 6
minutos y finalmente
fueron sumergidas en
nitrgeno lquido (-196
C).

Se sumergieron las
pajillas en agua
temperada a 37 C por
10 segundos.

Congelacin de semen
de carnero en pellets
con los diluyentes
Tris-glucosa-yema de
5 C congelaron e
introduccin en
nitrgeno lquido.

Bao Mara a una
temperatura de 37C
durante 10 a 15
segundos.
huevo o Lactosa-yema
de huevo.


Uso de dilutores
hipertnicos en la
criopreservacin de
semen ovino

Rango de enfriamiento
para el semen fue de
50-60 C/min.
La congelacin del
semen se hizo en un
tanque de nitrgeno
lquido.

Recipiente con agua a
37 C por 60 segundos.



Estudio Criopr./
Diluy.
Motil.
Progr.
Esp.
vivos
acrosom
a intacto
termores
istencia
Integ.
de mem.
Criopreservacin de
semen ovino
empleando tres
dilutores y cuatro
combinaciones de
agentes
crioprotectores
permeantes y no
permeantes.

Glicerol
+
Trehalos
a

64.1
4.8

57.8
6.9

40.4
4.4

62.7
2.8

Congelacin de
semen de carnero
en pellets con los
diluyentes Tris-
glucosa-yema de
Lactosa-
yema de
huevo

40.2
huevo o Lactosa-
yema de huevo.

Uso de dilutores
hipertnicos en la
criopreservacin de
semen ovino

Tris-
Trealosa

40.3
5.9

34.4
6.6



RECOMENDACIONES

Estudio Criopreser
vante /
Diluyente
Motilid
ad
progre
siva
Espermatoz
oides vivos
con
acrosoma
intacto
termoresist
encia
Integri
dad de
la
membr
ana
Criopreserv
acin de
semen
ovino
empleando
tres
dilutores y
cuatro
combinacio
nes de
agentes
crioprotect
ores
permeantes
y no
permeantes
Glicerol +
Trehalosa

64.1
4.8

57.8 6.9

40.4 4.4

62.7
2.8


Mejor motilidad progresiva.
Mayor proporcin de espermatozoides vivos con acrosoma intacto.
La trehalosa es un protector especfico de las membranas
espermticas que, como resultado de su interaccin con los
fosfolpidos, puede unirse con el hidrgeno de las cabezas
fosfolipdicas de la membrana, de una manera ms fuerte que el
glicerol (Foote et al., 1993). Adems, posee una accin
crioprotectora relacionada al efecto osmtico, que protege al
espermatozoide del congelamiento (Aisen et al., 2002).
Clulas espermticas del efecto de la criopreservacin.



















Referencias bibliogrficas

Roco Sandoval M; Alexei Santiani A; Luis Ruiz G; Vctor Leyva V;
Luis Coronado S; Alfredo Delgado C. Criopreservacin de semen
ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes
crioprotectores permeantes y no permeantes. Rev. investig. vet.
Per v.18 n.2 Lima jul./dic. 2007.

Brito, F. I.; Valencia, M. J.; Balczar, S. A.; Angulo, M. R. y Meja,
V. O. Congelacin de semen de carnero en pellets con los
diluyentes Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo.
Rev. Avances en investigacin agropecuaria. Mxico.

Hernn Guerrero V., Wilfredo Huanca L., Fernando Raymundo T.,
Sandra Huerta O.y Daphne Ramos D. Uso de dilutores hipertnicos
en la criopreservacin de semen ovino. Rev Inv Vet Per 2009; 20
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