VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniera

Habana 2007


UN PROCEDIMIENTO BIOMIMTICO NOVEDOSO PARA
OBTENER COMPOSITES DE QUITOSANA-HIDROXIAPATITA

Y. Solis, C. Peniche, R. Garca , N. Davidenko

Centro de Biomateriales
La Habana 10400 charlie@biomat.uh.cu



RESUMEN
En el presente trabajo se obtuvieron composites de
quitosana/hidroxiapatita deficiente en calcio
(CHI/CDHA) de tres composiciones: 20/80, 50/50,
80/20. El procedimiento involucr la formacin de la
hidroxiapatita en presencia de la fase orgnica. Con este
fin se utiliz quitosana de langosta (Panulirus argus,
peso molecular, Mv = 1.4 x 10
5
g/mol y grado de
desacetilacin, DD=80.83%). Los composites de
CHI/CDHA obtenidos fueron caracterizados mediante
difraccin de rayos X y anlisis trmico. La morfologa
de las partculas se visualiz por microscopa ptica.
Los patrones de difraccin de rayos X de los
composistes mostraron la presencia de la fase apattica
embebida en la matriz orgnica de CHI. El patrn de
descomposicin trmica de la quitosana result alterado
por la presencia de la fase inorgnica, indicando que
existe una buena interaccin entre el componente
orgnico y el componente inorgnico. Se encontr una
excelente correlacin entre la composicin de la mezcla
de partida y la de los composites obtenidos.

Palabras clave: composites, quitosana, hidroxiapatita.

1. INTRODUCCIN
Los composites de quitosana con diferentes fosfatos
de calcio constituyen materiales hbridos muy atractivos
para ingeniera de tejidos seos, especficamente para la
reconstruccin sea guiada [1].
Dentro esta temtica, los materiales obtenidos por el
mtodo biomimtico (nucleacin de la fase inorgnica
dentro de la matriz polimrica), se consideran ms
ventajosos ya que permiten un mejor control de la
estructura y composicin qumica de los materiales
resultantes [2].
Enmarcada en esta promisoria lnea, en el presente
trabajo se prepararon composites de quitosana/
hidroxiapatita deficiente en calcio (CHI/CDHA) por un
mtodo biomimtico, con el objetivo de obtener un
nuevo material osteoconductivo, bioactivo y
biodegradable con vistas a su futuro empleo como
sustituto seo.

2. METODOLOGA

Determinacin del peso molecular de la
quitosana por viscosimetra
El peso molecular promedio viscosimtrico ( v M )
de la quitosana se determin partiendo una solucin de
quitosana con una concentracin de 0.001g/ml y se
calcul mediante la ecuacin de Mark-Houwink; que
relaciona la viscosidad intrnseca [] con el peso
molecular como sigue:

[ ]
a
v M K = (1)
Los valores reportados de K y a para la quitosana en el
disolvente utilizado (HAc 0,3M + NaAc 0,2M) a 30C
son 0.074 ml/g y 0.76 respectivamente [3].
Se utiliz un viscosmetro capilar Ubbelohde,
sumergido en un bao termosttico a 30 0.01C. Se
midi el tiempo de cada del solvente (t
0
) y de 5
soluciones polimricas (t
i
) de concentraciones
conocidas. Con los valores obtenidos, se calcularon la
viscosidad relativa (
rel.
= t
i
/t
0
) y la viscosidad
especifica (
esp
=
rel
- 1), y con esta ltima se calcul la
viscosidad reducida (
red
=
.

esp
/C).
Mediante la extrapolacin a concentracin cero en
el grfico de viscosidad reducida vs. concentracin, se
determina la viscosidad intrnseca, con la que
finalmente se puede hallar v M .

Determinacin del grado de desacetilacin
de la quitosana por potenciometra
Se disolvi la quitosana en un exceso conocido de
HCl acuoso y se valor con una solucin de NaOH
0,25M (previamente estandarizada). A partir de las
mediciones realizadas se obtiene una curva de pH frente
a volumen de NaOH aadido.
Para calcular el grado de desacetilacin se calcula
primeramente la masa molar del equivalente de la
quitosana segn sigue:


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V NaOH C
quitosana m
Meq

=
) (
) (
(2)

donde m(quitosana) son los gramos de quitosana seca,
C(NaOH) es la concentracin molar de NaOH, V es el
volumen (en mL) de NaOH gastado, cuyo valor se
obtiene del grfico y Meq es la masa molar del
equivalente. Con este ltimo se calcula el grado de
desacetilacin mediante la frmula siguiente:


Meq
DD
+
=
42
203
(3)

donde DD es el grado de desacetilacin.

Obtencin de composites de (CHI/CDHA)
en forma de partculas
Los composites de CHI/CDHA se obtuvieron
preparando una suspensin de fosfato diclcico
dihidratado (DCPD), a partir de la mezcla de los
precursores de fsforo (NaH
2
PO
4
.H
2
O) y calcio
(CaAc
2
) en una disolucin de quitosana al 3% en cido
actico al 2%. Esta mezcla se adicion sobre el medio
precipitante de la CHI (NaOH al 10% en metanol) y se
obtuvieron partculas con forma esfrica, que
posteriormente fueron reticuladas e hidrolizadas en un
bao termostatado a 60C durante 72 horas, para dar
lugar a la formacin de la hidroxiapatita deficiente en
calcio (CDHA) en la matriz de quitosana.

Caracterizacin de los Composites
Difraccin de rayos X (DRX)
La determinacin cualitativa de las principales fases
minerales presentes, la cristalinidad de los composites
obtenidos y la identificacin de la quitosana se realiz
mediante la difraccin de rayos X utilizando el mtodo
de polvo. El anlisis se realiz en el difractmetro
D5000 con gonimetro Kristaloflex, con radiacin
CuK ( = 1,5406 ) con un tiempo por paso de 1,5 s,
un voltaje de 40KV, una intensidad de 35 mA y
intervalo angular o paso del gonimetro de 0,05.

Apariencia macroscpica de los composites
Para analizar macroscpicamente la morfologa, se
tomaron fotografas, con una cmara digital Sony
modelo DSC-P52 Cyber-Shot, de los composites
obtenidos a las tres composiciones de CHI/CDHA
(20/80, 50/50 y 80/20) antes de su liofilizacin.

Caracterizacin mediante TG, ATD y DTG
La caracterizacin termogravimtrica fue realizada
en un sistema de anlisis trmico TGS-2 Perkin Elmer
con un microprocesador programador System-4 como
unidad de control de temperatura. Se utiliz una
corriente de aire, con una velocidad de flujo de
200 cm
3
/min., con una velocidad de calentamiento de
2C/min. y utilizando como referencia almina y un
termopar de Pt/Rh.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN

Determinacin del peso molecular por
viscosimetra
En la tabla 1 se muestran los tiempos de cada (t
i
)
obtenidos en un viscosmetro Ubbelohde para las
disoluciones de quitosana en el sistema disolvente
seleccionado a 30C. Estos tiempos son el promedio de
cinco mediciones. Con estos valores, y conociendo el
tiempo de cada del disolvente (t
0
= 74.3 seg), se
determinaron las viscosidades relativas (
rel.
), especfica
(
esp.
), y reducida (
red
).
Tabla I
Datos relacionados con la determinacin de la ( v M )

C(g/ml)*10
4
t
i

(seg)

rel

esp

red
8,595 133.4 1,796 0,796 926,3
7,907 127.2 1,713 0,713 901,3
7,321 122.2 1,645 0,645 881,5
6,589 115.8 1,559 0,559 848,7
5,990 111.2 1,497 0,497 830,1

Con estos resultados se construy el grfico de
viscosidad reducida (
red.
) contra la concentracin, que
se muestra en la Fig.1. A partir del intercepto de la lnea
recta obtenida se determin por extrapolacin la
viscosidad intrnseca, [] = 604.0mL/g. Con este dato y
con las constantes reportadas anteriormente se obtiene,
aplicando la ecuacin (1), que v M = 1.4 x 10
5
g/mol.

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
820
840
860
880
900
920

r
e
d
Conc 10
4
(g/ml)

Fig. 1. Dependencia de la viscosidad reducida con la
concentracin de CHI. A partir de este grfico se determin de la
viscosidad intrnseca ([]) de la quitosana.

Determinacin del grado de desacetilacin
de la Quitosana por potenciometra
En la Fig. 2 se observan dos puntos de inflexin y la
primera derivada de la curva potenciomtrica obtenida.
La diferencia de volumen entre estos dos puntos
corresponden a la cantidad de NaOH necesaria para
neutralizar todos los grupos amino protonados de la
quitosana, lo que permite determinar el por ciento
grupos amino de la muestra y el DD de la quitosana.
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0 5 10 15 20 25
0
2
4
6
8
10
12
p
H
Volumen de NaOH (mL )


Fig. 2. Dependencia del pH contra el volumen de NaOH gastado en la
valoracin. Curva de valoracin potenciomtrica de Quitosana

En la Fig.2 se muestran los dos puntos de inflexin
que permiten determinar el grado de desacetilacin de la
muestra.
Utilizando las ecuaciones (2) y (3) y el valor de la
concentracin de la solucin de NaOH que fue de
0.2313 g/mL se obtuvo el grado de desacetilacin de la
quitosana que result ser 80.83%.

Resultados de rayos X de la CHI y de los
composites CHI/CDHA
En la Fig.3 se muestran los difractogramas de rayos
X obtenidos para la quitosana y los composites de
CHI/CDHA de composiciones 20/80, 50/50 y 80/20,
respectivamente, diferencindose las fases de CHI y
CDHA segn la simbologa descrita.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
50
100
150
200
250
300
I

(
u
n
i
d
a
d
e
s

a
r
b
i
t
r
a
r
i
a
s
)
2
CHI
CHI/CDHA 20/80
CHI/CDHA 50/50
CHI/CDHA 80/20

Fig 3 Difractogramas de CHI y composites obtenidos.

Del anlisis de los difractogramas de Rayos X
(Fig. 3) se puede concluir que la fase inorgnica
presente en todos los composites corresponde a la
hidroxiapatita, destacndose en todos los casos lnea a
26 en 2 y las otras tres de mayor intensidad,
correspondientes a la fase apattica, en 2 = 31.7, 32.2 y
32.8. Adems, se observa un elevado contenido de
componente amorfo correspondiente a la CHI, que
aumenta al disminuir la fraccin de componente
inorgnico en la mezcla inicial, siendo mayor en el
composite de CHI/CDHA: 80/20, donde el contenido de
material orgnico en el composite es mayor. Por su
parte, el patrn de difraccin de rayos X de la quitosana
presenta los picos caractersticos a 10 y 20 en 2.


Apariencia macroscpica de los composites
Durante la obtencin de los composites fueron
tomadas las fotografas que se muestran en la Fig. 4
previo al proceso de liofilizacin.
CHI/CDHA: 20/80 CHI/CDHA: 50/50 CHI/CDHA: 80/20

Fig. 4 Fotografas de los composites de CHI/CDHA de las diferentes
composiciones.

En las imgenes se observa que los composites de
CHI/CDHA de composicin 20/80 se presentan
fundamentalmente en forma de polvo, producto de que
la fase inorgnica se encuentra en mayor proporcin.
Sin embargo, los composites de composicin de 50/50
tienen una morfologa cercana a la esfrica, aunque no
tan perfecta como la que se observa en los composites
de 80/20, donde el contenido de CHI es mayor. Este
resultado corresponde con el obtenido por difraccin de
rayos X, pues al aumentar el contenido de CHI presente
en la mezcla inicial, mayor es la cantidad de material
orgnico incorporado al composite y mayor es la
esfericidad que presentan los mismos. Esto se debe a la
reconocida capacidad de la quitosana de formar esferas
en las condiciones empleadas.

Caracterizacin mediante TG, ATD y DTG
Los composites obtenidos fueron analizados
mediante tcnicas termogravimtricas y anlisis trmico
diferencial. En la Fig. 5 se muestran las curvas de TG,
ATD y DTG obtenidas para los composites preparados
a las tres composiciones: 20/80, 50/50 y 80/20.
El primer efecto endotrmico observado en la Fig.5
se debe a la prdida de H
2
O (etapa 1), y los dos efectos
exotrmicos posteriores (etapas 2 y 3), corresponden a
las dos etapas tpicas de descomposicin de la
quitosana. Sin embargo, debe observarse que el patrn
de descomposicin se encuentra afectado por la
composicin, lo que es indicativo de la existencia de
una interaccin entre la fase apattica y la quitosana. En
la Tabla II se resumen los resultados obtenidos a partir
de las curvas termogravimtricas de los composites de
las diferentes composiciones.
En los clculos de la composicin de los composites
se asumi que el residuo a 600C era slo
hidroxiapatita. Sobre esta base se puede decir que la
prdida de peso total de las etapas 2 y 3 corresponde a
la masa de quitosana presente en la muestra.
Los resultados de la tabla muestran que los
composites se encuentran enriquecidos en
hidroxiapatita, en comparacin con la composicin
inicial de la mezcla. Se puede mostrar, no obstante, que
existe una dependencia lineal entre la relacin
quitosana/fase inorgnica programadas en las mezclas
iniciales y la relacin quitosana/hidroxiapatita en los
composites correspondientes.
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Fig. 5. Curvas de ATD ,TG y DTG de los composites.

Tabla II
Determinacin del contenido de los composites (por
ciento en peso) a partir de las curvas de TG.
CHI/CDH
A
Inicial
H
2
O
(%)
CH
I
(%)
HA
p
(%)
CHI/CDH
A
Final
20/80 5.6 17.2 77.2 18.2/81.7
50/50 6.5 45.6 47.9 48.7/51.2
80/20 4.6 67.2 28.2 70.4/29.6

Para determinar la composicin de la fase apattica
inorgnica de los composites, se calentaron a 1000C
durante 15 horas, para eliminar el componente orgnico.
En estas condiciones, la hidroxiapatita deficiente en
calcio es inestable.
En la Fig. 6 se muestra el patrn de difraccin de
rayos X obtenido despus de ese tratamiento trmico.
En el mismo se muestran en rojo las lneas
caractersticas de la hidroxiapatita estequiomtrica,
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
y en azul, las correspondientes al
patrn de la rhenanita CaNaPO
4
. Lo anterior es
indicativo de que la hidroxiapatita obtenida es una
hidroxiapatita deficiente en calcio, cuya composicin se
puede representar como:
Ca
(10-x)
Na
x
(PO
4
)
(6-x)
(HPO
4
)
x
(OH)
2
.
El anlisis qumico del contenido de fsforo por el
mtodo del cido molibdofosfrico y del contenido de
Ca por EDTA (resultados no mostrados) mostraron que
la hidroxiapatita obtenida presenta una relacin
Ca/P = 1.614 0.004, inferior al valor de 1.667 de la
hidroxiapatita estequiomtrica.

Residuo composites 1000C/15h
09-0432(I)- Hydroxylapatite, syn- Ca5(PO4)3(OH) - Y: 97.92%- dxby: 1. - WL: 1.5406- Hexagonal - a9.418- b9.41800- c6.884- alpha90.000- beta90.000- gamma120.000- Primitive- P63/m(176) - 2- 528.79
29-1193(*) - SodiumCalciumPhosphate-NaCaPO4-Y: 8.33%- dxby: 1. - WL: 1.5406- Orthorhombic - a6.797- b9.165- c 5.406- alpha90.000- beta90.000- gamma90.000- Primitive- Pnam(62) - 4- 336.764-
Operations: Import
Residuocomposites1000C/15h- File: Residuo_Comp.RAW- Type: 2Th/Thlocked- Start: 2.000- End: 70.000- Step: 0.050- Steptime: 1.5s- Temp.: 25C(Room)- TimeStarted: 5s- 2-Theta: 2.000- Theta: 1.
L
i
n

(
C
o
u
n
t
s
)
0
100
200
300
400
2-Theta- Scale
6 10 20 30 40 50 60 70

Fig. 6. Patrn de difraccin de rayos X de una muestra de composite
despus de calentada a 1000C durante 15 horas. En rojo se muestran
las lneas correspondientes a la hidroxiapatita estequiomtrica, y en
azul las correspondientes a la rhenanita.

4. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se prepararon composites de
quitosana e hidroxiapatita no estequiomtrica con
distintas relaciones CHI/CDHA por un mtodo
biomimtico. La obtencin de estos composites se lleva
a cabo a temperatura ambiente, lo que permite
incorporar a los mismos sustancias trmicamente
inestables, tales como antibiticos, factores de
crecimiento, etc.
En la actualidad se continan los trabajos de
caracterizacin de los composites, y posteriormente se
iniciarn estudios para determinar la bioactividad y
biodegradabilidad de estos materiales.

REFERENCIAS
[1] A. D. Martino and M. Sittinger and M. V Risbud. Chitosan: A
versatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering,
Biomaterials, vol. 26, pp. 5983-5990, 2005.

[2] R. Murugan and S. Ramakrishna, Bioresorbable composite
bone paste using polysaccharide based nano hydroxyapatite,
Biomaterials, vol. 25, pp. 3829-3835, 2004.

[3] I. Yamaguchi and K. Tokuchi and H. Fukusaki and Y. Koyama
and K. Takakura and H. Monma and J. Tanaka. Preparation
and microstructure analysis oh chitosan/hydroxiapatite
nanocomposites, J. Biomed Mater Res., vol. 55, pp. 20-27,
2001.

0 100 200 300 400 500 600
0
5
10
15
20
25
0 100 200 300 400 500 600
-25
-20
-15
-10
-5
0
0.10
0.05
0.00
-0.05
-0.10
-0.15
-0.20
-0.25

ATD V
CHI/CDHA: 20/80

Temperatura C
TG %
DTG


0 200 400 600 800 1000
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 200 400 600 800 1000
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5

ATD V
CHI/CDHA: 50/50

Temperatura C
TG %
DTG

0 200 400 600 800 1000
-20
0
20
40
60
80
0 200 400 600 800 1000
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

ATD V
CHI/CDHA: 80/20

Temperatura C
TG %
DTG

0.6
ISBN 978-959-212-236-9 (c) Sociedad Cubana de Bioingeniera, artculo T028