cido hialurnico es un GAG no sulfatado que desempea papeles importantes en matrices extracelulares a travs de las glicoprotenas y proteoglicanos inmovilizacin

a las superficies celulares. Los oligosacridos producidos a partir de cido hialurnico se han utilizado para caracterizar las interacciones con protenas de unin. En algunos casos, las fracciones de bajo peso molecular de cido hialurnico tienen actividades biolgicas no asociada con la molcula parental (revisado en [30]). Estas observaciones han catalizado esfuerzos para generar mtodos para la produccin de olgosaccharides de cido hialurnico en alta pureza. Uno de estos mtodos combina SEC y cromatografa de intercambio aninico de alto rendimiento [30]. ESI se ha utilizado con eficacia en la caracterizacin de los oligmeros de cido hialurnico [30-32]. negativo ESI es una eleccin natural para los fragmentos de cido hialurnico, debido al alto contenido de cido urnico. GAGs sulfatados son polidispersos con respecto a la longitud de la cadena y el contenido de sulfato, lo que resulta en una distribucin de glicoformas de una cadena unida a un residuo de Ser dado. Aunque es posible producir iones abundantes de cadenas de GAG intactas utilizando ESI negativo, la polidispersidad y resultados de masas de alta en un complejo patrn de superposicin de estados de carga. Esto efecto se puede ver claramente con un analizador de masas cuadrupolar. Transformada de Fourier MS tiene suficiente poder de resolucin para separar istopos e identificar estados de carga para los iones producidos a partir de molculas tan grandes como los GAGs (hasta ~ 50 kDa), pero est limitada por efectos de carga de espacio. De este modo, la muestra intacta GAG crudo producir tantos diferentes valores de m / z que ninguno est por encima del nivel de ruido. Determinacin de las cadenas de GAG intactas utilizando FTMS requerir alguna separacin cromatogrfica preliminar o filtrado de iones para limitar el nmero de valores de m / z producidos en un solo espectro. El uso de la electroforesis capilar y la losa para el anlisis de GAGs ha sido revisado recientemente [ 33 , 34 ] . Electroforesis en gel de poliacrilamida de gradiente se ha utilizado para caracterizar los GAG en la orina de mucopolisacaridosis pacientes [ 35 ] . El valor de electroforesis en gel de losa es que proporciona una estimacin de la distribucin de peso molecular para estas muestras muy complejas . Los GAGs pueden ser transfirieron a membranas de nitrocelulosa catinicos , una tcnica que potencialmente permite la posterior manipulacin de las muestras [ 36 ] . Los GAGs son similares a los cidos nucleicos en la que son lineales y aninico . Al igual que los cidos nucleicos , cadenas de GAG se pueden separar usando electroforesis en gel de poliacrilamida con deteccin de fluorescencia inducida por lser . A diferencia de los cidos nucleicos , los GAG sulfatados son extremadamente polidispersa y bandas claras no se observan .

SEC ha sido ampliamente utilizado para determinar las distribuciones de tamao medio en las preparaciones de GAG ( para ejemplos vase [ 37-43 ] ) . Comportamiento de GAG durante la separacin SEC ha demostrado ser distinta de la de las protenas [ 44 ] . Un mtodo para la determinacin del peso molecular medio de preparaciones de heparina utilizando la SEC con calibracin universal se ha descrito [ 45 ]

ESI NEGATIVE MODE Las comparaciones de la utilizacin de ESI negativo y MALDI negativo para el anlisis de oligosacridos de cido hialurnico seala la importancia de los parmetros de funcionamiento de espectrometra de masas para el xito del experimento [106, 107]. El uso de ESI condiciones de desolvatacin que son apropiados para pptidos dar lugar a la fragmentacin de los oligosacridos de HA, con el resultado de que los iones correspondientes a la prdida de un residuo de monosacrido de los oligosacridos se detectan. Esta fragmentacin en-fuente puede ser eliminado mediante la reduccin de la magnitud de los voltajes de desolvatacin electrospray. Es la experiencia del autor de que las fuentes productoras de calentamiento lento de las gotas electrospray (fuentes capilares con calefaccin o Z-spray) dan como resultado la eliminacin de disolvente ms suave. Esto es particularmente importante para el anlisis de oligosacridos polisulfatados. Una LC / MS de sistema para el anlisis de oligosacridos de cido hialurnico se ha descrito que emplea una columna C2 para la separacin [107]. Observacin de iones intactos de oligosacridos GAG sulfatados utilizando ESI requiere un cuidado especial a pesar de la naturaleza amable de esta tcnica de ionizacin con respecto al vaco MALDI . Condiciones de desolvatacin optimizados para el anlisis de pptidos en el modo positivo seguramente causar la fragmentacin en - fuente de oligosacridos sulfatados . Gran xito resulta de cambiar al modo negativo y el uso de la menor ( en trminos absolutos) desolvation energas posibles. Adems , se recomienda el uso de una solucin que contiene sulfato de amonio [ 108 ] , acetato de amonio [ 109 ] , o hidrxido de amonio [ 110 ] . ESI negativo resulta en la observacin de los iones moleculares intactos , lo que permite experimentos de espectrometra de masas en tndem utilizando este modo de ionizacin . La produccin de iones positivos por el emparejamiento de oligosacridos polisulfatados con contraiones catinicos se ha demostrado usando ESI [ 111 ] y se aplica a en lnea LC / MS de iones en fase inversa utilizando el emparejamiento de cromatografa [ 112 , 113 ] , como se discute en detalle en la seccin 0 . Mientras pelado de iones catinico es til para la realizacin de CL-EM anlisis en modo de ion positivo , no es til en el anlisis de MS / MS , debido a la ausencia de oligosacridos de cadena principal productos de escisin