Investigacin Qumica

Estrategias bioanalticas en estudios metalmicos de frmacos de platino

M Milagros Gmez Gmez, Estefana Moreno Gordaliza, M Luz Mena Fernndez, M Antonia Palacios Corvillo, Benito Caas Montalvo
Resumen: En este artculo se muestra el potencial que presentan las modernas estrategias bioanalticas en estudios metalmicos de frmacos de platino. La combinacin de tcnicas de separacin multidimensionales cromatogrficas y/o electroforticas con la espectrometra de masas atmica ICP-MS y molecular ESI-MS/MS se presenta como una valiosa alternativa en este tipo de estudios. Palabras clave: Bioanlisis, metalmica, frmacos de Pt, cncer, espectrometra de masas, separaciones multidimensionales. Abstract: This article demonstrates the potential of modern bioanalytical strategies used in metallomic studies of platinum drugs. The combination of multidimensional chromatographic and/or electrophoretic separation techniques with atomic (ICP-MS) and molecular (ESI-MS/MS) mass spectrometry is presented as a valuable alternative in this type of studies. Keywords: Bioanalysis, metallomics, platinum drugs, cancer, mass spectrometry, multidimensional separations.

Introduccin
Ciertos complejos de platino son utilizados extensamente en el tratamiento de tumores slidos. As el cisplatino, (cisdiaminocloroplatino) se emplea en el tratamiento de cncer de pulmn, testculos, ovarios, vejiga, cuello, cabeza, bazo y crvix.1 Puesto que los tumores se caracterizan por un aumento incontrolado de la proliferacin celular, el ADN suele ser la diana de los frmacos antitumorales. El mecanismo de accin del cisplatino y de molculas anlogas implica la interaccin coordinativa covalente del platino con las bases nitrogenadas del ADN, fundamentalmente guanina y adenina, produciendo

M M. Gmez Gmez E. Moreno Gordaliza M L. Mena Fernndez

M A. Palacios Corvillo

B. Caas Montalvo

Universidad Complutense de Madrid. Departamento de Qumica Analtica. Facultad de Ciencias Qumicas. Avda. Complutense s/n, 28040 Madrid. C-e: mmgomez@quim.ucm.es Recibido: 15/06/2011. Aceptado: 02/12/2011.

un entrecruzamiento en la misma cadena, o incluso, intercadena.1 Los aductos de platino formados inciden en los procesos de replicacin y transcripcin, produciendo, finalmente, la muerte celular por apoptosis.2 La clave del xito en los tratamientos de quimioterapia estriba en destruir las clulas malignas sin causar un dao irreparable a las sanas. Adems de la reactividad descrita entre los frmacos del platino y las bases del ADN, la presencia de Pt (II) les proporciona la capacidad de unirse (principalmente a travsde los grupos tiol) a otras biomolculas como las protenas deltorrente sanguneo (albmina, transferrina, hemoglobina), los fosfolpidos de las membranas celulares, los aminocidos cistena y metionina, el oligopptido glutatin (GSH) o las metalotionenas (MTs).3 Entre las consecuencias ms importantes de la formacin de estos complejos Pt-biomolcula cabe destacar la resistencia al tratamiento debida al desarrollo de mecanismos de destoxificacin por la reaccin con MTs o GSH, as como los efectos txicos que aparecen durante el tratamiento (el principal y ms limitante es la nefrotoxicidad), por lo que, a pesar de la potente actividad antitumoral del cisplatino, su uso clnico est limitado. Aunque el mecanismo molecular de la nefrotoxicidad no est completamente establecido, se sabe que el cisplatino ocasiona daos estructurales en las clulas epiteliales de los tbulos del rin con prdida del borde en cepillo.4 Estos daos son dependientes de la dosis, por lo que su administracin mxima est limitada a 100 mg/m2. Con objeto de disminuir los efectos txicos del cisplatino, y/o buscar compuestos alternativos que mejoraran o complementaran el espectro de su accin teraputica, se desarrollaron otros frmacos anlogos como el carboplatino (cis-diamino (1,1-ciclobutanodicarboxilato) platino(II)) y el oxaliplatino (trans-L-1,2-diaminociclohexano oxalatoplatino (II)). Estos compuestos son activos frente al mismo tipo de cnceres y en ocasiones eficaces frente a tumores resistentes al cisplatino, y permiten dosis de hasta 300 mg/m2 y 150mg/ m2 de carboplatino y oxaliplatino respectivamente.5 No obstante, estos frmacos presentan otros efectos secundarios
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como mielosupresin y neuropatas, y su eficacia en general es inferior. Actualmente, cabe destacar tres compuestos de Pt (II) que ofrecen un comportamiento prometedor: el nedaplatino (cis-diaminoglicolato-O, O-platino (II)), aprobado para uso clnico en Japn, el lobaplatino (cis-1,2-diaminociclobutanoglicolato-O, O-platino (II)), autorizado en China y el picoplatino (cis-aminodicloro (2-metilpiridina) platino (II)), en fase III de ensayos clnicos. La Figura 1 muestra la estructura qumica de estos frmacos.

Cisplatino

Carboplatino

Oxaliplatino

Nedaplatino

Lobaplatino

Picoplatino

Figura 1. Estructura de los frmacos de platino ms importantes.

Si se echa la vista atrs, el progreso en las terapias oncolgicas con frmacos de platino ha sido exponencial desde la aprobacin clnica del cisplatino en 1978. Sin embargo, hay todava una falta de conocimiento profundo acerca del comportamiento de estos frmacos en el organismo, tanto de sus mecanismos de accin como de sus efectos txicos. Desde que estos frmacos entran en el torrente sanguneo, tras su administracin intravenosa, hasta que penetran en la clula y causan el efecto citotxico, interaccionan con gran variedad de biomolculas. Estas interacciones tienen que ver con fenmenos de transporte, de traspaso de la membrana celular, fenmenos de resistencia inducida e incluso con disfuncionalidades en ciertas biomolculas que conducen a toxicidad.3 Por tanto, es de inters ahondar en el conocimiento de su mecanismo de actuacin, as como en el anlisis de las especies formadas por posibles interacciones entre estos frmacos, o sus derivados hidrolizados, y las diferentes biomolculas que se encuentran en el organismo. De hecho, los avances logrados en los ltimos aos en anlisis bio-inorgnico en el rea de la metalmica, han contribuido de forma significativa a caracterizar la interaccin de estas drogas con el ADN y con biomolculas presentes en las clulas de la sangre, como la hemoglobina;6 en el plasma sanguneo, como albmina, transferrina e inmunoglobulinas;7 o en distintos componentes celulares, como el citoesqueleto, la membrana plasmtica, vesculas3 y protenas citoplasmticas.8

Metodologas analticas en metalmica

La metodologa para el anlisis bio-inorgnico en el campo de la metalmica ha evolucionado de forma notoria en los ltimos aos gracias al desarrollo de nuevos instrumentos de espectrometra de masas y a su acoplamiento a tcnicas separativas de gran resolucin, aplicable tanto a la caracterizacin elemental como a la caracterizacin molecular de las especies administradas y/o formadas en el medio biolgico.9 Mediante esta combinacin de tcnicas ha sido posible solucionar los principales problemas que entraan estos anlisis:concentraciones muy
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bajas de los complejos formados, matrices muy complejas, transformacin de especies, ruptura de los complejos metalbiomolcula, etc. Se requieren adems mtodos de preparacin de la muestra eficaces, pero poco agresivos, con capacidad para purificar y preconcentrar las especies de inters sin romper los complejos que forman estos frmacos con las biomolculas. Cuando los complejos a estudiar estn formados por metales y protenas, la metodologa analtica desarrollada se basa en la adaptacin de la empleada hoy en da en el campo de laprotemica, constituyendo la base de la metodologa metaloprotemica.10 Las tcnicas utilizadas son, fundamentalmente, de separacin de muestras complejas como la electroforesis en gel mono- o bi-dimensional, o la combinacin de distintas separaciones cromatogrficas en lo que se ha dado en llamar cromatografa multidimensional. La cromatografa de exclusin por tamaos (SEC)11 es una tcnica adecuada para el fraccionamiento de protenas debido a la recuperacin elevada que se obtiene. Sin embargo, la resolucin obtenida no es especialmente buena, y cada una de las fracciones recogidas de una columna SEC puede contener un nmero indeterminado de protenas si se trata de muestras biolgicas de elevada complejidad. A pesar de esto, puede ser muy til para desalar muestras, para resolver mezclas simples o como fraccionamiento previo a otras separaciones. No obstante, los acoplamientos de separaciones cromatogrficas ms utilizados combinan resolucin con ortogonalidad, tal es el caso de la combinacin de intercambio inico con fase inversa.12 La espectrometra de masas molecular (MS) con tcnicas de ionizacin blandas como electrospray (ESI) o desorcin/ ionizacin por lser asistida por una matriz (MALDI) poseen un potencial analtico considerable en la determinacin estructural de los complejos formados en metaloprotemica, ya que en muchos casos permiten que la estructura de las protenas y los enlaces metal-biomolcula se conserven.9 En los ltimos aos el empleo de la espectrometra de masas elemental con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) como detector selectivo elemental y su acoplamiento a las tcnicas cromatogrficas, ha supuesto un gran avance en metalmica, principalmente debido a su elevada sensibilidad y carcter multielemental, aportando informacin tanto del metal o metaloide como de otros no-metales de gran importancia biolgica como azufre o fsforo.9 Se han realizado con xito separaciones bidimensionales de biomolculas presentes en el extracto proteico de la fraccin citoslica de rin de ratas tratadas con cisplatino, carboplatino y oxaliplatino. Esto se ha logrado mediante la combinacin de SEC y cromatografa de intercambio inico (IEC) con preconcentracin en lnea (en cabeza de columna) y acoplamiento a ICP-MS,13 encontrndose que los frmacos pueden estar unidos a una gran variedad de protenas. As se pone de manifiesto la necesidad de separaciones que proporcionen un gran poder de resolucin, tales como nHPLC, previo a la elucidacin estructural de los complejos frmaco-protena formados. En este sentido el acoplamiento nHPLC-ICP-MS es una herramienta de gran ayuda para la deteccin especfica y cuantificacin de las biomolculas con platino, cuya estructura se determina en paralelo mediante nHPLC-ESI-MSn.9 La baja concentracin de los complejos metal-biomolcula en las muestras biolgicas hace necesario el empleo de procedimientos de preconcentracin previos al anlisis. Entre los mtodos ms utilizados cabe destacar la evaporacin de
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disolventes a vaco mediante liofilizacin o speed-vac, la ultrafiltracin por tamices moleculares o la concentracin en cabeza de columna previamente a la separacin cromatogrfica.10 La focalizacin en lnea se puede realizar mediante IEC o mediante cromatografa en fase inversa (RPC), con elevados factores de preconcentracin y baja manipulacin de la muestra. Con frecuencia, las fracciones cromatogrficas concentradas presentan un elevado contenido salino, que es incompatible con ESI-MS, por lo que las fracciones deben ser desaladas mediante dilisis, ultrafiltracin o microcolumnas de extraccin en fase slida. En general, los procedimientos mencionados han de mantener la integridad de los complejos originales metal-biomolcula. Por ello, se requiere el empleo de inhibidores de proteasas, el control riguroso de las condiciones experimentales de pH, temperatura, salinidad, tiempo de almacenamiento de las muestras y conocer el efecto de los reactivos del procedimiento analtico para evitar la ruptura de los complejos, la transformacin de las especies y la desnaturalizacin o agregacin de protenas.

subfracciones citoslicas de los distintos rganos, se realizaron mediante la preparacin de extractos de tejidos en 10mM TrisHCl + 25 mM NaCl y posterior fraccionamiento por mtodos de ultracentrifugacin y ultrafiltracin. En las distintas fracciones y subfracciones se analiz el contenido total de platino por ICP-MS. La distribucin del platino en cada una de las fracciones celulares y citoslicas ofrece resultados muy similares para los tres frmacos. En rin, la fraccin citoslica, y en concreto la fraccin inferior a 50 kDa, es la que presenta un mayor contenido del elemento. Por tanto esta fraccin es la ms interesante para abordar los estudios de interaccin Pt-biomolculas con objeto de descubrir qu compuestos podran estar ms relacionados con la nefrotoxicidad producida por platino. Precisamente, en este intervalo de masas se encuentran biomolculas de notable inters como el GSH o las MTs, molculas relacionadas con los mecanismos de destoxificacin.

Acumulacin de cisplatino, carboplatino y oxaliplatino en organismos vivos y su distribucin en fracciones celulares

Los estudios se realizaron en ratas Wistar con dosis farmacolgicas de cisplatino, carboplatino y oxaliplatino inyectadas por va intraperitoneal. El platino acumulado en los rganos que en principio son susceptibles a un mayor dao, se determin mediante ICP-MS. Los rganos en estudio fueron el rin (el cisplatino produce nefrotoxicidad), hgado (rgano de acumulacin), cerebro (el platino puede atravesar la barrera cerebral) y odo interno (el cisplatino produce ototoxicidad).14 Las principales conclusiones de los resultados de acumulacin obtenidos en los diferentes rganos fueron las siguientes: el rin fue el rgano que ms platino acumul a los tres das del tratamiento seguido por el hgado, el odo y el cerebro. Esto ocurri independientemente del frmaco administrado. El mximo de acumulacin para todos los frmacos se obtuvo a los siete das; a partir de este tiempo el contenido en platino empieza a disminuir en todos los rganos. Se observ que la capacidad de acumulacin de los tres frmacos no es la misma. As, las ratas tratadas con oxaliplatino presentaron mayor acumulacin de platino en relacin con la dosis administrada, seguidas delas tratadas con cisplatino y carboplatino. El hecho de que el oxaliplatino no sea el frmaco que en principio produce ms toxicidad hace que no se pueda establecer una relacin directa entre acumulacin del elemento y toxicidad. Los estudios realizados sobre la acumulacin del cisplatino en diferentes partes del rin de ratas muestran una acumulacin unas ocho veces superior en la corteza en comparacin con la mdula renal. Estos datos concuerdan con el hecho de que, en la filtracin del cisplatino en el rin, la exposicin al frmaco es nueve veces superior en el tbulo proximal respecto a la de la mdula renal y del tbulo distal y colector. Como resultado, la corteza es la zona del rin que presenta mayor dao, y por lo tanto en la que se han de centrar los estudios metalmicos. Los estudios de distribucin de los tres frmacos en diferentes fracciones celulares (ncleo, mitocondrias y citosol) y
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Estudio de la reaccin in vitro entre cisplatino y biomolculas citoslicas o protenas del suero sanguneo
El GSH es el principal responsable de mantener el estado redox en el interior celular, con un papel fundamental en la defensa contra el estrs oxidativo. Es tambin un importante
MS 726,18 (GSH-32H+2Pt+NH3)+ 711,00 100 90 710,00 80 712,00 70 60 + (GSH-3H+2Pt+NH -CO ) 50 3 2 667,00 709,00 40 668,00 713,00 30 666,00 (GSH-3H+2Pt)+ 20 669,00 693,91 692,91 695,00 10 682,91 691,00 670,45 677,00 699,91 703,45 718,00 0 665 670 675 680 685 690 695 700 705 710 715 m/z
2

MS cisPt:GSH (2:1)

-2NH3 120 110 728,18 100 90 80 729,09 727,18 70 60 -NH3 730,09 -3NH3 50 745,09750,09 726,18 751,09 40 731,18 711,09 732,09 744,18 752,18 30 710,09 712,09 717,09 733,73 709,09 722,64 754,09 743,09 20 10 0 705 710 715 720 725 730 735 740 745 750 755 m/z
O O HO O N NH3 Pt N S Pt NH3 O OH NH3+

Abundancia relativa

Abundancia relativa

NH3

NH3

(GSH-2H+2Pt+4NH3)+ m/z 762

Figura 2. Espectro ESI-MS de una disolucin de cisplatino 100 nM incubada con GSH 50 mM durante 48 h, y espectro MS2 del in precursor a m/z 726.18732.09, que corresponde a la estructura propuesta [GSH-3H+2Pt+2NH3].
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destoxificador de agentes carcinognicos, por lo que cuando se encuentra en concentraciones altas en algunos tumores puede incrementar la resistencia a la quimioterapia. El cociente entre la especie reducida y la oxidada GSH/GSSG es un factor importante en la proteccin contra la apoptosis, proceso deseable como efecto de la administracin de frmacos anticancergenos como el cisplatino.5 Es sabido que el cisplatino en medio fisiolgico puede encontrarse en su forma molecular original, en forma de dmero, o sustituir los cloros de su molcula por molculas deagua u OH- dando lugar a diversos acuocomplejos que son las formas ms reactivas para asociarse a las protenas. Para estudiar la reactividad del cisplatino con GSH, se incubaron ambas molculas en las concentraciones farmacolgicas Pt:GSH, que cabe esperar en el citosol celular (1:500). Posteriormente, la separacin y deteccin de los aductos formados, se realiz mediante SEC-ICP-MS. Estos estudios han mostrado la formacin, con distintas cinticas, de diversos complejos cisplatino-GSH.8 No obstante, siempre permanece en el medio de reaccin una cantidad
MT1 MT1
195

Pt

2h

4h

5,0

7,5 Tiempo de retencin (min)

10,0

48h

66

Zn

2h 4h 5,0 7,5 Tiempo de retencin (min) 10,0 48h

importante de distintas especies de cisplatino libre, que demuestra la reactividad limitada con GSH. El anlisis mediante nESI-MS/MS de los complejos formados permiti la caracterizacin estructural de un complejo con estequiometra cisplatino:GSH 2:1 (Figura 2).8 Otras biomolculas importantes del citosol celular con una gran capacidad de destoxificacin de posibles contaminantes metlicos, son las MTs. Estas protenas son capaces de coordinar metales txicos a sus mltiples residuos cistenicos, desplazando de su estructura otros metales previamente coordinados. Se incubaron MTs que contenan Zn y Cd con 10 nM de cisplatino en la proporcin cisplatino:MTs 1:10 y las muestras fueron analizadas mediante SEC-ICP-MS. De forma anloga al estudio anterior, los resultados obtenidos han demostrando la gran afinidad que presentan estas protenas por el cisplatino.8 En tan slo 4h todo el frmaco se incorpor a las MTs, desplazando al Zn de las mismas, pero no al Cd (Figura 3). Este hecho pone de manifiesto la mayor estabilidad de los complejos de Pt2+ y Cd2+ con los residuos cistenicos, en comparacin con los formados con el Zn2+. En la incubacin simultnea de cisplatino con GSH y MTs, como era de esperar, predomina el complejo cisplatino:MTs, aun en presencia de un gran exceso de GSH. Asimismo, citosoles de rin de ratas tratadas con cisplatino y citosoles de ratas no tratadas que fueron incubados con el frmaco, muestran la presencia de los complejos anteriormente mencionados, tanto con GSH como con MTs, lo que indica una formacin similar de los aductos biomolcula-cisplatino in vivo e in vitro.8 Para conocer la reactividad del cisplatino con las protenas de la sangre que estn implicadas en los procesos de transporte del frmaco al interior de las clulas, se realizaron incubaciones en condiciones fisiolgicas de cisplatino con las protenas de suero humano: albmina (HSA), transferrina (TF) e inmunoglobulina G. El anlisis de los aductos formados se realiz mediante cromatografa de intercambio aninico acoplada a ICP-MS. Se observ la formacin preferente del aducto cisplatino-HSA.7 Mucho menos intensa y ms lenta fue la formacin del aducto cisplatino-TF. La incubacin de un suero sanguneo humano con cisplatino corrobora que la especie platinada mayoritaria es el aducto cisPt-HSA y queesta interaccin ocurre en gran extensin.

Aproximaciones protemicas bottom-up y top-down en la caracterizacin estructural de protenas ligadas a frmacos de platino
La identificacin y caracterizacin de protenas puede realizarse mediante dos posibles aproximaciones protemicas conocidas como: bottom-up (de abajo a arriba) y top-down (de arriba a abajo). En la aproximacin bottom-up, las protenas dela muestra se separan mediante electroforesis bidimensional, y las manchas proteicas de inters se someten a digestin in-gel generalmente trptica. El posterior anlisis de los pptidos obtenidos mediante MALDI-TOF-MS permite la identificacin de la protena sobre la base de su huella peptdica. Otra alternativa del bottom-up es la identificacin de las protenas a partir de los espectros de fragmentacin de sus pptidos mediante ESI-MS/MS, y la asignacin de las secuencias mediante bsqueda en las bases de datos de protenas con ayuda de programas especializados. La aproximacin proAn. Qum. 2012, 108(1), 2128

111

Cd

2h

4h

48h 5,0 7,5 Tiempo de retencin (min) 10,0

Figura 3. Cromatogramas SEC-ICP-MS de una disolucin 10 nM de MT de hgado de conejo incubada con cisplatino 1 nM durante 2, 4 y 48 h. Iones monitorizados 195Pt, 66Zn y 111Cd.

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temica top-down, consiste bsicamente en la identificacin de las protenas una vez separadas mediante combinacin de diferentes metodologas y sin previa digestin. Se utilizan a este efecto instrumentos de alta resolucin como FTICR-MS (espectrometra de masas por resonancia ciclotrnica de iones con transformada de Fourier) acoplados a distintas fuentes de ionizacin, generalmente ESI. La aproximacin top-down es menos utilizada, ya que los espectros de fragmentacin obtenidos son muy complejos. Estos mtodos permiten no slo identificar las protenas en cuestin en muestras reales, sino tambin los puntos de unin especficos del platino enla protena. De hecho existe una gran actividad cientfica en este campo. La metodologa bottom-up es recomendable ya que proporciona espectros de masas ms fcilmente interpretables que los generados utilizando la metodologa top-down. Adems, para pptidos de masa molecular por debajo de 5000-6000 Da, la diferenciacin entre iones platinados o no, es posible gracias al perfil caracterstico del platino, que por encima de estas masas se atena. Ambas metodologas se han evaluado en estudios de anlisis de los productos de la incubacin de cisplatino con insulina. Esta protena es un buen modelo para el estudio debido a su tamao (54 aminocidos), que permite observar el perfil isotpico debido al platino en estudios top-down en instrumentos de espectrometra de masas de resolucin media como la trampa lineal de iones (LIT). La estructura de la insulina tambin presenta aspectos interesantes, como es la presencia de distintos aminocidos susceptibles de ligar platino en una molcula formada por dos cadenas polipeptdicas unidas a travs de dos puentes disulfuro, y que por tanto pueden separarse en condiciones reductoras. Las incubaciones fueron realizadas en condiciones fisiolgicas y analizadas mediante nESI-LIT-MS/MS. En la aproximacin top-down15 el an1491,14 100 1491,38 90 1490,64 [Insulina+Pt(NH 3) 2(H 2O)+2H]4+ 4+ 1495,40 [Insulina+Pt(NH 3) 2+2H] 80 1491,62 1495,64 70 1494,90 60 1495,90 1490,38 1491,88 50 1494,64 1496,14 [Insulina+Pt +2H]4+ 40 [Insulina+Pt(NH 3) 2Cl+3H]4+ 1492,14 [Insulina+Pt(NH 3)+2H]4+ 1496,38 30 1500,60 1496,60 1492,38 1486,62 1500,10 20 1492,64 1486,12 1499,60 1482,62 1484,14 1499,34 10 0

[Insulina+Pt (NH 3) 2 Cl + 3H]4+

100 95 90 85 80 75 70 65 Abundancia relativa 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1500,09 1499,85 1500,34 1500,58 1499,61 1500,82

1499,35

1501,08 1501,33 1501,56 1502,07 1501,81 1502,30 1502,56 1502,82

1499,11

1498,86 1498,61
1499,0 1499,5 1500,0 1500,5 m/z 1501,0

1498,5

1501,5

1502,0

1502,5

1503,0

100 90 Abundancia relativa 80 70 60 50 40 30 20 10 0

1498,95

1499,71 1499,46

1499,96 1500,21

b
Abundancia relativa

100 90 80 70 60 50 40 30 20 1499,15

1500,15 1499,90 1500,40 1499,65 1500,65 1500,90 1499,40 1501,16 1501,41

1500,46 1499,21 1500,71 1500,96 1501,21 1501,46 1501,71

1499,0 1499,5 1500,0 1500,5 1501,0 1501,5 1502,0 1502,5 1503,0 m/z

1501,66 1501,91 10 1498,90 1502,161502,41 0 1498,5 1499,0 1499,5 1500,0 1500,5 1501,0 1501,5 1502,0 1502,5 1503,0 m/z

Figura 5. a) Anlisis nESI-LIT MS en modo de barrido Ultrazoom, adquirido entre m/z 1498,5 y 1503,0, mostrando el perfil isotpico del aducto [[insulina+Pt(NH3)2Cl+3H]4+, observado en una incubacin de insulina-cisplatino 1:5 en TFA 0,1%, tras 96 h de evolucin. Los perfiles isotpicos tericos de pptidos que presentan la misma masa, sin y con platino, se muestran en b) y c), respectivamente, a efectos comparativos.

1482

1484

1486

1488

1490

1492 m/z

1494

1496

1498

1500

1502

Figura 4. Espectro de masas adquirido mediante nESI LIT MS en modo de barrido zoom en el intervalo m/z 1482-1502, correspondiente a los monoaductos platinados de insulina observados en una incubacin de insulina-cisplatino 1:1 tras 96 h de evolucin en un medio salino a pH 7,4.

lisis preliminar mediante SEC-ICP-MS permiti detectar selectivamente los aductos de insulina-cisplatino en las incubaciones. Posteriores anlisis mediante MALDI-TOF-MS y nESI-LIT-MS de las protenas complejadas mostraron la presencia en las incubaciones de mono-, di- e incluso triaductos de platino (Figura 4). El modo zoom scan de la LIT presenta suficiente resolucin para distinguir el perfil isotpico de los iones formados, lo que permiti localizar los iones que contenan platino (Figura 5). Los puntos de unin del platino en la insulina se identificaron mediante fragmentacin disociacin inducida por colisin (CID)-MSn y fueron, en la cadena B, el aminocido N-terminal y los residuos His5, His10 y Cys7.
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En el anlisis bottom-up de los aductos cisPt-insulina el objetivo fue evaluar si las condiciones qumicas de la digestin enzimtica en disolucin, afectan a los enlaces cisplatino-protena.16 Los estudios se realizaron mediante nESI-LIT-MSn. Se comprob que los aductos cisplatinoinsulina resisten la digestin clsica que incluye desnaturalizacin con urea, reduccin de los puentes disulfuro con ditiotreitol (DTT), alquilacin de los grupos tioles libres con yodoacetamida (IAA) y finalmente digestin con tripsina en disolucin reguladora Tris-HCl durante ms de doce horas. El anlisis de los pptidos obtenidos mediante nESI-LIT-MSn aport, adems de los puntos de unin anteriormente mencionados en la aproximacin topdown (Figura6), otros adicionales en la cadena A, la Cys6, Cys7 y Cys20, y en la cadena B la Cys19, demostrndose la adecuacin de la aproximacin bottom-up para el anlisis de las protenas con platino e identificacin de los puntos

Abundancia relativa

Cadena B FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA Cadena A GIVEQCCASVCSLYQLENYCN

Figura 6. Secuencia de aminocidos de la insulina bovina. En rojo se han marcado los aminocidos que se han reconocido como capaces de coordinarse al platino tanto por la aproximacin top-down como con la bottom-up. En azul se han resaltado los aminocidos que ligan platino encontrados exclusivamente mediante la aproximacin bottom-up.

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de unin especficos del frmaco en una protena. Los datos obtenidos con esta aproximacin son ms completosquelos que se obtienen con la aproximacin top-down, ya que los puntos de unin minoritarios del platino son ms difciles de asignar en los complejos espectros MS/MS de los aductos Pt-insulina intactos. Cuando la protena se incub con cisplatino, despus de una reduccin de los puentes disulfuro con DTT, se demostr que las cistenas libres presentan una reactividad muy superior a la de los grupos N-dadores (N-terminal, His). En caso de encontrarse implicadas las cistenas en puentes disulfuro, la reactividad est disminuida, siendo comparable a la de otros aminocidos. En cuanto a la metodologa analtica de la preparacin de la muestra, se demostr la posibilidad de acelerar la digestin trptica de los aductos cisplatino-protena mediante el empleo de una microsonda de ultrasonidos focalizados, permaneciendo el platino unido a los pptidos correspondientes. La informacin estructural fue similar, pero con un ahorro muy importante en el tiempo de digestin de 12horas a 5 minutos.16 En la secuenciacin de los pptidos con platino mediante ESI-MSn se compararon las prestaciones de los mtodos de fragmentacin de pptidos mediante el mtodo de fragmentacin clsico, CID, y el ms novedoso de disociacin

por transferencia electrnica (ETD), aportando CID mejores resultados.16 Cuando se estudian protenas de mayor masa que dan lugar a mezclas de pptidos ms complejas, es necesaria la separacin por HPLC previa a su anlisis mediante ESI-MS/MS. Un ejemplo de los resultados obtenidos mediante el acoplamiento nLC-ESI-LIT-MS/MS se muestra en el cromatograma de la Figura 7, correspondiente a los aductos". mioglobina-cisplatino digeridos con tripsina. Los estudios realizados con HSA y TF incubadas con cisplatino y anlisis mediante ESI-Q-TOF muestran la formacin de los aductos cisplatino-HSA de estequiometra 1:1 y cisplatino-Tf 1:1 y 1:2.7 Las digestiones trpticas de los aductos formados y anlisis mediante nHPLC-ICP-MS empleando una columna de fase inversa C18 confirman la robustez del enlace cisplatino-protena. El anlisis estructural mediante nHPLCESI-Q-TOF-MS permiti localizar pptidos con perfil isotpico de platino en cada uno de los digeridos. Resultados similares se obtuvieron con los digeridos de los complejos aislados de las muestras de suero sanguneo incubadas con cisPt. La metodologa desarrollada en nuestro estudio, en principio se podra aplicar a la caracterizacin de complejos formados entre cualquier frmaco de platino y protenas, y por extensin a cualquier metalodroga que forme complejos estables con biomolculas.

46,28 100 95 nLC-ESI-MS TIC tr= 19,1 min 90 tr= 38,2 min 85 34,75 80 22,92 75 22,99 70 65 60 100 33,97 22,73 55 23,09 90 46,10 50 80 34,81 45 70 39,97 40 20,33 60 23,35 35 40,06 30 50 34,91 23,49 19,79 23,66 28,24 25 39,87 40,14 40 41,95 27,68 28,60 17,02 20 23,80 31,51 35,34 30 29,88 44,99 27,44 15 16,71 35,52 24,02 20 42,35 10 50,40 51,9 10 5 1,39 2,628,148,469,71 13,91 42,87 46,59 0 0 855,0 40 0 5 10 15 20 25 30 35 45 50
Abundancia relativa

Abundancia relativa

857,20

Zoom
856,72

scan

856.28 (2+)
857,74

856,26 858,24 858,66

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

1056,90 1056,48

Abundancia relativa

1056,00 (2+)
1057,90 1058,36 1058,88 1059,34

Zoom scan

1055,98

856,0

857,0

858,0 m/z

859,0

860,0

Time (min)

0 1055,0 1056,0 1057,0 1058,0 1059,0 1060,0 m/z

e
x20

m/z

100 90 80

2+

MS 2 -856,26 [119 HPGDFGADAQGA MTK133 +Pt(NH 3 )]2+

100 90 80

x20

(b 13 +Pt)

[YLEFISDAIIHVLHSK+Pt] 2+

MS 2 -1056,00 [103 YLEFISDAIIHVLHSK 118 +Pt(NH 3 )2 ]2+

(b 6 +Pt) + y8 +

(b 10 +Pt) + (b 11 +Pt) + (y11 + Pt) + (b 12 +Pt) + (y12 +Pt) + (b 13 +Pt) +

b 4+ y4 + y5 + (y3 +Pt) + (b 4 +Pt) + y6 + (b 5 +Pt) + y7 +

2+

(y5 +Pt+NH 3 )+

(b 13 +Pt)

(y8 +Pt) + (b 9 +Pt) +

(y13 +Pt) + (b 14 +Pt) + (y14 +Pt) +

40 30 20 10 0

40 30 20 10 0

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

400

600

800

b 8 + (y6 +Pt) (y6 +Pt+2NH 3 )+

(b 7 +Pt) + (b 8 +Pt) +

y3 + b 3+ y4 + b 4+ (y3 +Pt) + b 5+ (y4 +Pt) + b 6+ (y5 +Pt) +

y2 +

y3 +

y9 +

50

50

b 7+

60

60

1000

Figura 7. a) Cromatograma nLC-ESI-LTQ MS obtenido en modo TIC correspondiente a un digerido en disolucin de aductos de mioglobina-cisplatino. A tiempos de retencin de 19,1 min y 38,2 min se reconocieron sendos pptidos con platino a tenor de su perfil isotpico observado durante barridos en modo zoom, a m/z 856,28 (b) y a 1056,0 (c), respectivamente. Los espectros de fragmentacin (CID-MS2) de estos iones permitieron su identificacin y la localizacin de los puntos de unin del Pt en ellos (d y e), como los residuos de His y Met (marcado en rojo en su secuencia).

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(y8 +Pt) + (y +Pt+2NH )+ 3 b 10 + 8 (y9 +Pt) + (y9 +Pt+NH 3 )+ b 11 + (y10 +Pt) + (y10 +Pt+2NH 3 )+ b 12 + (y11 +Pt) + (b 11 +Pt) + + b 13 + (b 11 +Pt+NH 3 ) + (y +Pt) (b 12 +Pt) + 12 (y13 +Pt) + (b 13 +Pt) + (y14 +Pt) + (b 14 +Pt) + (b 14 +Pt+NH 3 )+ (b 15 +Pt+) + (b 15 +Pt+2NH 3 )+
1200 m/z 1400 1600 1800 2000

Abundancia relativa

70

(HPGDFGADAQGAMTK+Pt) 2+

Abundancia relativa

70

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Estrategias bioanalticas en estudios metalmicos de frmacos de platino

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Separaciones multidimensionales de protenas ligadas a platino

En muestras complejas, tales como extractos de clulas o tejidos, pueden encontrarse muchas protenas ligadas al platino que no pueden ser separadas adecuadamente incluso mediante la combinacin de procedimientos cromatogrficos consecutivos. Adems, la utilizacin de cromatografa en fase inversa, que puede proporcionar una gran resolucin, puede no ser adecuada para muchas protenas, que quedan retenidas irreversiblemente. Sin embargo, cuando se trabaja con pptidos, las posibilidades de separacin y recuperacin aumentan considerablemente. En este caso, la cromatografa en fase inversa es muy adecuada para su separacin, obtenindose recuperaciones generalmente muy buenas. Por esto, el anlisis y caracterizacin de muestras muy complejas de protenas tiende a hacerse actualmente despus de su digestin trptica, tras la cual los pptidos producidos se separan mediante dos o ms procesos cromatogrficos siguiendo una metodologa conocida como identificacin de protenas mediante separacin multidimensional, MudPIT, en sus siglas en ingls.17 Una alternativa a las tcnicas cromatogrficas, es la electroforesis bidimensional (2-DE) aplicada directamente a los extractos de protenas. La 2-DE consiste en dos separaciones electroforticas ortogonales, la primera mediante isoelectroenfoque (IEF) y la segunda mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE). La combinacin de estas dos tcnicas electroforticas presenta un alto grado de resolucin y puede utilizarse a escala micropreparativa. Es as posible la separacin e identificacin de hasta centenares, e incluso miles de protenas, por lo que es ampliamente utilizada en protemica, siendo, en principio, una buena alternativa en metaloprotemica. No obstante, para la separacin de protenas unidas a platino, se hace necesaria la utilizacin de reactivos que no afecten a la integridad del enlace Pt-protena. Algunos reactivos habitualmente utilizados para IEF o SDS-PAGE, como son la tiourea o los agentes reductores, deben restringirse o utilizarse con precaucin.18 Los estudios se realizaron con protenas modelo como la HSA, TF, citocromo C, anhidrasa carbnica y mioglobina incubadas con cisPt18 en un primer estudio de SDS-PAGE. Al finalizar la electroforesis, los minigeles (10cmx10cm) se cortaron en pequeas bandas de unos 15x7,5mm, se digirieron con HNO3 y H2O2, seguido de agua regia y HCl, y el contenido de platino se analiz por ICP-MS. Los mejores resultados se obtuvieron en condiciones no-reductoras (en ausencia de BME o DTT, donde las protenas con platino se separan en bandas estrechas en el intervalo 0-3-2,0 ng, y las recuperaciones de platino son cuantitativas. Los lmites de deteccin obtenidos (2,4-14 pg de Pt) son adecuados para su aplicacin a muestras biolgicas. Estudios paralelos realizados con carbo- y oxaliplatino en las condiciones seleccionadas anteriormente aportaron resultados similares en el caso del oxaliplatino. Sin embargo, el carboplatino muestra prdidas significativas del platino unido a las protenas, por lo que las separaciones electroforticas de las protenas ligadas a este frmaco se han de realizar en condiciones nativas. En el segundo estudio, sobre las protenas separadas por SDS-PAGE se realizan de forma secuencial procesos de fijacin, teido y desteido del gel y se realiza la digestin trptica
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Citosol de rin de rata tratada con cisPt16 mg/m 2. Sacrificada a los 3 das Precipitacin de las protenas (acetona a -20C) y redisolucin en la disolucin OFFGEL
Muestra distribuida en los 24 pocillos (150 L por pocillo) Tira de gel IPG

Corriente mxima 50A, 500-4000V hasta 50 kV/h. T: 20 C

3 60 50 40 30 ng Pt 20 10 0

Punto 10 isoelctrico Recogida de fracciones individuales: 1) Ultrafiltracin a 3 kDa 2) Anlisis por ICPMS de la fraccin 3 kDa

3,48 4,01 4,53 5,06 5,58 6,11 6,63 7,16 7,68 8,21 8,73 9,26 Punto isoelctrico medio

Figura 8. Esquema de la separacin mediante isoelectroenfoque OFFGEL en condiciones no reductoras de un citosol de rin. Perfil de Pt proteico obtenido mediante anlisis ICP-MS de las fracciones lquidas recogidas.

in-gel de las bandas seleccionadas. Los resultados obtenidos para los digeridos in-gel de las protenas seleccionadas incubadas con cisplatino y analizadas por nHPLC-ESI-MS/MS indican que el proceso de digestin in-gel es tambin adecuado para mantener los enlaces Pt-protena, y por tanto para la caracterizacin estructural de estos complejos y sus puntos de unin.18,19 Recientemente se ha desarrollado una nueva tcnica de isoelectroenfoque en disolucin (sIEF, conocida como OFFGEL IEF), en la cual las protenas separadas se recogen en disolucin en unos pocillos situados encima de la tira de gel IEF. La ventaja es que mediante este procedimiento se simplifica el tratamiento de la muestra para su anlisis posterior mediante nLCESI-MS. Los ensayos OFFGEL IEF realizados con protenas modelo ligadas a cisplatino muestran buenas separaciones y recuperaciones cuantitativas prescindiendo del uso de tiourea yen condiciones no reductoras.18 Por otra parte, se ha demostrado la utilidad del OFFGEL IEF para la separacin de protenas de citosoles de rin de ratas tratadas con cisplatino.18 Se observa que el platino no se distribuye de forma uniforme a travs de los 24 pocillos del sistema, sino que la mayor parte del platino ligado a protenas se localiza en 4 pocillos (Figura8), lo que facilita la posterior identificacin estructural mediante nLC-ESI-MS/MS de las fracciones enriquecidas en platino.

Distribucin de las protenas unidas a platino mediante el anlisis de geles de electroforesis por LA-ICP-MS
La combinacin de la electroforesis, SDS-PAGE o 2D, con ablacin lser (LA) acoplada a ICP-MS, LA-ICP-MS, es una herramienta muy prometedora para la obtencin de los mapas de distribucin de metales o heterotomos ligados a protenas, habindose aplicado con xito a la deteccin de protenas fosforiladas20 o ligadas a Zn o Cd.21 En nuestro caso, el empleo de las tcnicas 2-DE (IEF seguido de SDS-PAGE) junto con LA-ICP-MS permite el aislamiento y localizacin rpida y precisa de las bandas (1D) o puntos (2D) donde se encuentren las protenas ligadas a platino. Posteriormente los trozos de gel que contienen Pt pueden cortarse, digerirse con tripsina, y las protenas platinadas identificarse mediante nLC-ESI-MS/ MS de los pptidos producidos (Figura 9).
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Cultivos celulares de tbulo proximal de rin Precipitacin de protenas Separacin de protenas 1D: Separacin protenas por enfoque isoelctrico (OFFGEL-IEF) Limpieza y preconcentracin por ultrafiltracin (3 kDa) de fracciones con mayor contenido de Pt 2D: Separacin protenas por peso molecular (SDS-PAGE)
Pm F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 Antes Despus

Fracciones 1 a 8 de tira pH=3 a 10 alta resolucin

tcnicas de separacin cromatogrficas y electroforticas en combinacin con tcnicas de espectrometra de masas atmica y molecular constituyen herramientas complementarias para la deteccin e identificacin sensible y selectiva de los complejos frmaco-protena formados en los medios biolgicos y muestras clnicas durante el tratamiento. Cabe esperar que en un futuro este tipo de estrategias sean de gran ayuda en estudios de distribucin, metabolismo, efectos txicos, etc. de metalodrogas en general.

F8

Pm

250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa

Agradecimientos
Los autores agradecen la financiacin recibida del Ministerio de Ciencia e Innovacin en el proyecto CTQ2008-04873.

Bibliografa
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Determinacin de Pt

Anlisis LA-ICP-MS 1) Mapas de contorno de Pt 2) Deteccin protenas ligadas a Pt Digestin trptica de las manchas de protenas con Pt

Identificacin de protenas

Anlisis nLC-ESI-LIT-MS/MS

Identificacin y anlisis estructural de protenas ligadas a Pt

Figura 9. Esquema de la separacin de protenas citoslicas por electroforesis bidimensional, deteccin de las bandas con Pt por LA-ICPMS e identificacin estructural de las protenas ligadas a Pt mediante nLC-ESI-LIT-MS/MS. Los intervalos de pH de las diferentes fracciones son: F1 (3,35-3,61), F2 (3,61-3,88), F3 (3,88-4,14), F4 (4,144,40), F5 (4,40-4,66), F6 (4,66-4,93), F7 (4,93-5,19) y F8 (5,19-5,45).

La aplicabilidad de esta metodologa a protenas ligadas a platino se ha evaluado primero con una mezcla de protenas incubadas in vitro con cisplatino y a continuacin con citosoles de cultivos de clulas epiteliales del tbulo proximal de rin (RPTECs) de cerdo en miniatura incubados con cisplatino. Con objeto de obtener la distribucin de las protenas con platino en el gel y su abundancia relativa, se crearon mapas de contorno de platino mediante el programa MATLAB. Se observa, como era de esperar, que no aparece platino en todas las manchas donde hay protenas, y que la intensidad de la seal de platino es independiente de la concentracin de protena, lo que indica cierta especificad del frmaco en sus interaccin con las protenas.22 Estos resultados son muy prometedores en trminos de selectividad, sensibilidad y rapidez del anlisis.

Conclusiones
Los avances logrados en los ltimos aos en anlisis bio-inorgnico han permitido abordar estudios metalmicos in vivo de frmacos de platino. El empleo de
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