ACTIVIDAD PRCTICA UTI-DREMR DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA FACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES OXIDATIVAS DE LA LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD (LDL): ANALISIS DE LA OXIDACION DEL COMPONENTE LIPIDICO Y PROTEICO.

Elaborado por:

Dr. Andr ! Tro!"#$an!%& Dra. Mad'a Tr()'llo Dra. La(ra Ca!"ro Dr. *o+,ro R(bbo

A-o!"o d, ./0/

In"rod(##'1n. Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) son partculas esfricas con un dimetro de 19-23 nm, constitu endo la poblaci!n de lipoprotenas "ue poseen una densidad entre 1,#19 1,#$3 %&ml' La (ip!tesis o)idati*a de la aterosclerosis postula "ue las placas de ateroma se forman a partir de clulas (principalmente macr!fa%os musculares lisas) car%adas con lpidos (steres de colesterol), como consecuencia de modificaciones o)idati*as de la LDL (LDL o)idada u o)-LDL)' Las LDL son internali+adas en las clulas a tra*s del receptor normal de LDL (receptor apo,&apo-) por endocitosis mediada por receptor' ,ste es un proceso re%ulado a la baja "ue impide la entrada e)cesi*a de lipoprotenas a las clulas. adems su re%ulaci!n est coordinada con la del metabolismo del coleterol impidiendo la acumulaci!n noci*a de este lpido' / diferencia de la LDL nati*a, la o)-LDL es reconocida por receptores barrenderos o 0sca*en%er1 a ni*el de las clulas endoteliales musculares lisas, monocitos macr!fa%os por un proceso no re%ulado' 2ientras la LDL es o)idada, la lipoprotena pierde su (abilidad de ser reconocida por el receptor de la LDL incrementndose a su *e+ la afinidad por el receptor sca*en%er' Durante la o)idaci!n de la LDL a una forma reconocida por los receptores sca*en%er, e)iste una disminuci!n de la cantidad de %rupos - amino libres de los residuos de lisina de las LDL lo cual e)plica el cambio en la especificidad del receptor' La acumulaci!n intracelular de lpidos, combinada con la disminuci!n de la de%radaci!n de los lpidos o)idados, resulta en la con*ersi!n de los macr!fa%os en clulas espumosas formndose la estra %rasa "ue constitu e una acumulaci!n focal de lpidos en la ntima arterial "ue representa la lesi!n ms preco+ del proceso' E!"r(#"(ra d, la LDL. La LDL (umana se define como la poblaci!n de lipoprotenas "ue pueden ser aisladas por ultracentrifu%aci!n en %radiente de densidad, con un ran%o de densidad entre 1,#19 a 1,#$3 %&ml'
Cara#",r2!"'#a! d, la! pr'n#'pal,! l'popro",2na! d,l pla!+a $(+ano.
Densidad (%&ml) 2o*ilidad ,lectrofortica Dimetro (nm) 9eso molecular (daltons) >elaci!n Lpido& 9rotena Lpidos ms /bundantes 9rincipales /poprotenas 3uilomicrones < #,97 8ri%en > :# #,;- 3# 1# 9 99 ? 1 @A ,)!%enos /-5, --;=, B-5,B-55, B555 4LDL #,97 -1,##$ 9re- beta 27 - :# 7 - 1# 1# $ 9# ? 1# 5DL 1,##$ - 1,#19 ,ntre beta - beta 22 - 2; ;-7 1# $ =7 ? 17 B, pre -eta 19 < 23 1,= - 2,= 1# $ =# ? 2# CB 9(l /lfa ; - 1# 1,= - 3,$ 1# 7 7# ? 7# B, LDL 1,#19 - 1,#$3 6DL 1,#$3 - 1,21#

@A end!%e-nos @A end!%enos Be --1##, B-5, -- 1##, , B-55,B-555,,

--1##

/-5, /-55

@A? triacil%licridos. B,? steres de colesterol. CB? colesterol libre. 9(l? fosfolpidos

Bomo muestra la tabla, las molculas de LDL son %randes partculas esfricas con un dimetro de 19 - 23 nm un peso molecular entre 1,= 2,= millones' @omando 2,7 millones como un *alor promedio del peso molecular de la lipoprotena cada partcula contiene alrededor de 1$## molculas de steres de colesterol 1:# molculas de tri%licridos "ue juntos forman un core central lipoflico' ,ste core central se encuentra rodeado por una monocapa formada principalmente por unas :## molculas de fosfolpidos (particularmente fosfatidilcolina) $## molculas de colesterol libre' Las cabe+as polares de los fosfolpidos se encuentran en la superficie de la partcula de LDL contribu endo a su solubilidad en la fase acuosa' ,l nDmero total de molculas de cidos %rasos unidos a las diferentes clases de lpidos de la LDL es en promedio de 2:##' De estos, alrededor del 7# E son cidos %rasos poliinsaturados, principalmente cido linoleico (1=?2)' ,l contenido de cidos %rasos su patr!n de distribuci!n *ara considerablemente de persona en persona probablemente por los distintos (bitos dietticos' La *ariaci!n en el contenido de cidos %rasos poliinsaturados la relaci!n saturados&poliinsaturados tiene un efecto si%nificati*o sobre el comportamiento o)idati*o de las distintas partculas de LDL a "ue estos cidos %rasos son ms susceptibles de o)idaci!n por mecanismos no en+imticos' ,n la capa e)terna de la molcula se encuentra la Dnica protena "ue forma parte de la LDL "ue recibe el nombre de apolipoprotena --1## (apo --1##)' La apo --1## es una protena constituida por ;73$ aminocidos un peso de 712 FDa' De su secuencia aminoacdica se destacan la presencia de triptofanos, tirosinas metioninas (3:,172 := mol&mol respecti*amente) as como cuatro residuos de cistena libres' ,s importante resaltar la presencia de di*ersos antio)idantes como componentes estructurales de la LDL' ,ntre ellos se destaca el -tocoferol con una concentraci!n en nmol&m% de LDL "ue e"ui*ale a apro)imadamente seis molculas de -tocoferol por partcula de LDL' Los dems antio)idantes, como ser el -tocoferol, -caroteno,- caroteno ubi"uinol-1# se encuentran en cantidades menores' Pro#,!o! d, o3'da#'1n l'p2d'#a. La lipopero)idaci!n es el proceso en el cual el o)%eno molecular es incorporado a molculas de lpidos insaturados (L6) para formar (idroper!)idos lipdicos (L886)' ,l proceso de ata"ue daGo o)idati*o "ue sufren los lpidos insaturados se debe a reacciones en cadena mediadas por radicales libres, iniciadas por la abstracci!n de un tomo de (idr!%eno del metileno bis- allico del lpido insaturado por un radical libre reacti*o se%uido por una secuencia de reacciones propa%adoras' La lipopero)idaci!n procede a tra*s de tres fases? iniciaci!n, propa%aci!n terminaci!n' La fase de iniciaci!n, el primer paso crtico, est promo*ida por al%Dn tipo de iniciador "ue sobrepasa la ener%a de

disociaci!n del enlace allico causando la abstracci!n del (idr!%eno entonces la formaci!n del radical al"uilo (L')' La o)idabilidad de un lpido est dada por la facilidad con la "ue el tomo de (idr!%eno inicial puede ser abstrado' H'9' Bos%ro*e et al propusieron una relaci!n entre la capacidad de los cidos %rasos insaturados (9IC/s) de o)idarse con respecto a la cantidad de dobles enlaces allicos presentes en la molcula' Ina *e+ "ue se form! el radical al"uilo %rupos ad acentes le pro*een estabili+aci!n por resonancia' Ji est presente el o)%eno molecular reaccionar rpidamente con el radical al"uilo para formar en el caso del 8 2 radical pero)ilo (L88')' ,l radical pero)ilo es un importante intermediario en la cadena de propa%aci!n por"ue una *e+ formado, continuar la cadena de reacciones o)idati*as abstra endo un tomo de (idr!%eno de otros %rupos al"uilo cercanos' ,ste ciclo de reacciones propa%adoras se repite a tra*s de la abstracci!n de (idr!%enos formaci!n de L88 ', siempre "ue se encuentran disponibles suficientes molculas de 8 2 sustratos lipdicos insaturados' La duraci!n del ciclo de reacciones de radicales pero)ilo es %obernado por *arias reacciones competidoras de terminaci!n' ,n teora, estas inclu en la reacci!n bimolecular de dos radicales al"uilo o de dos radicales pero)ilo para formar productos no radicalares' @ambin e)isten reacciones de tipo radical-radical entre los radicales lipdicos %enerados durante la propa%aci!n otras especies radicalares
L6

>L

>6 5M5B5/B58M

L L
82 L88
LL

688
L886

9>89/A/B58M

L88L

L6

LL N LL L88L N L88L LL N L88L K6 N LL K6 N L88L

LL L88L N 8 2 L88L KL N L6 KL N L886 @,>25M/B58M

,s"uema para las transformaciones "umicas en las tres fases de lipopero)idaci!n %enerali+ado para un lpido diinsaturado' L6? lpido. L'? radical (centrado en el carbono) lipdico. L886? (idroper!)ido lipdico. L88'? radical lipopero)ilo. K6? compuesto antio)idante'

Pro"o#olo ,3p,r'+,n"al. Ob),"'4o!. ,studiar la o)idaci!n de la LDL por Bu(55) utili+ando diferentes metodolo%as e)perimentales, anali+ando las modificaciones sufridas por los tres principales componentes de la lipoprotena? lpidos, apolipoprotena --1## antio)idantes' Purificacin de LDL. / partir de plasma (umano fresco se purifica la fracci!n de LDL por ultracentrifu%aci!n' 1) 2; ml de plasma se me+clan con O-r para lle*ar la soluci!n a una densidad final de 1'3 %&ml' 9ara ello se a%re%an #'2= % de O-r por ml de plasma' Je obtiene una soluci!n de una fase a%itando sua*emente al plasma' 2) ,n cada tubo de ultracentrifu%aci!n se a%re%an 1'; ml de la soluci!n de plasma 2'2 ml de MaBl #'17 2 (isot!nico)'
No"a: ,l NaCl !, a-r,-a !obr, la! par,d,! d,l "(bo para ,4'"ar 5(, !, +,6#l,n a+ba! !ol(#'on,! & al#an6ar ,7'#',n",+,n", ,l -rad',n", d, d,n!'dad.

3) Je centrifu%a a =#### rpm por 9# minutos a ;PB' ;) Je separa la banda de color naranja "ue se obser*a en el tercio superior del tubo e*itando arrastrar fracciones superiores' 7) Je mide la concentraci!n proteica a 2=# nm ( Q 1 m%&ml), la LDL se %uarda a ;PB' Oxidacin de la LDL. La o)idaci!n de la LDL se lle*ar a cabo a 27PB en presencia de Bu(55) de acuerdo a -att( an B' et al (/rc(' -ioc(em' -iop( s', 2###)' Los procesos de o)idaci!n lipdica en la LDL sern anali+ados por consumo de o)%eno espectrofotometra (consumo de antio)idantes) mientras "ue las modificaciones en la apoliporotena --1## sern anali+adas por electroforesis' 8)idaci!n lipdica-Bonsumo de o)%eno' ,l consumo de o)%eno se reali+a en una cmara de ; ml de *olumen final a a%itaci!n constante' B/L5->/B58M? el aparato se calibra al 1##E de o)%eno mediante el burbujeo con pipeta pasteur durante al%unos minutos para saturar con aire la cmara "ue contiene a%ua solamente' 9osteriormente esperar a "ue se estabilice la medida lle*ar a 1##E con la perilla de B/L' ,l 1##E depende de la temperatura? @emperatura (PB) 8 2 nmoles&ml 7 39: 1# 371 17 31; 2# 2=;

27 2= 3# 37 3: Ina *e+ calibrado se puede empe+ar a trabajar'

27= 2;; 23: 222 21:

OB8ERVACIONE8: no ol4'dar la4ar d,!p( ! d, #ada +,d'da & #a+b'ar la +,+brana #(ando !, 4a a "raba)ar #on +a",r'al d'7,r,n", al ("'l'6ado ,n la 9l"'+a #orr'da. No ol4'dar d,)ar #on a-(a la #:+ara (na 4,6 5(, !, ",r+'na d, "raba)ar.

9ara la o)idaci!n de la LDL? 1) Je incuba, en un *olumen final de ; ml, la LDL (#'1 m%&ml, concentraci!n final) en buffer fosfato 7# m2, p6 :'; con BuJ8 ; en una relaci!n LDL&Bu(55) de 1?:7' 2) Je re%istra el consumo de o)%eno por 1## minutos, detectando las fases de latencia, propa%aci!n terminaci!n' Bonsumo de antio)idantes end!%enos de la LDL? o)idaci!n de carotenoides' 1) Determinaci!n de la lon%itud de onda de trabajo' >eali+ar el espectro de absorci!n de la LDL' 9ara ello incubar LDL (2 m%&ml, concentraci!n final) en una cubeta de espectrofot!metro reali+ar medidas de absorbancia cada 7 nm entre 3=# nm 77# nm' La lon%itud de onda de trabajo se corresponde con a"uella donde la soluci!n presenta ma or absorbancia' 2) Je incuba la LDL (2 m%&ml, concentraci!n final) en una cubeta de espectrofot!metro (*olumen 1 ml), con BuJ8 ; en una relaci!n LDL&Bu(55) de 1?:7' 3) Je reali+an medidas de absorbancia cada 3 minutos, durante $# minutos, a la lon%itud de onda seleccionada en 1' 8)idaci!n de la LDL- ,lectroforesis en a%arosa' Materiales y mtodos' a) Ael de a%arosa al #,7E en buffer de corrida (@ris-Alicina 1) p6Q=,3), apro)imadamente $# ml #,; %r de a%arosa b) -uffer de muestra 7) ? #,7= ml de %licerol N #,;2 ml de 628 N 1 ml de buffer corrida 1#) c) -uffer corrida? @ris-Alicina 1) p6Q=,3, apro)imadamente 7## ml' Je prepara por diluci!n de un stocF 1#)? 11;,2 %r %licina N 3#,3 %r @ris, disol*er en =## ml de 628, ajustar p6 a =,3 lle*ar a 1 litro' d) Joluci!n de fijaci!n? 27# ml de etanol?actico?a%ua ($#?1#?3#) 17# ml de ,t86 N 27 ml actico N :7 ml de 628 e) Joluci!n de tinci!n? Boomasie -rillant -lue >-27# #,17E en Destain' 9reparar apro)' 12# ml #,1= %r coomasie

f) Joluci!n de Destain? 2e86?actico?628 (37?27?;#)' Je prepara 1 litro Procedimiento La LDL se o)ida con cobre como pre*iamente' Je sacan muestras a los #, 17, 7# 9# minutos para anali+ar los cambios en la mo*ilidad electrofortica de la LDL' /dems se lo compara con una muestra de plasma' a' Je siembran por pocillo (asta 2# Rl de soluci!n de muestra (; Rl de buffer de la muestra 7) N 1$ Rl de muestra) con una cantidad final de protena entre 1# a 2# R%' b' Borrida? ;# minutos a $7 *oltios constante (apro)'3# m/) N 17 minutos a 9# *oltios c' Cijaci!n? 1#-2# minutos en soluci!n de fijaci!n (antes de fijar poner en el con%elador la soluci!n de fijaci!n el coomasie) d' Des(idratar el %el por peso entre papel de filtro seco' e' Boloraci!n? 1# minutos en soluci!n de tinci!n f' Decoloraci!n? 1 (ora (o (asta "ue e)ista buen contraste bandas&fondo) en destain con cambios sucesi*os de la soluci!n %' Jecado? 1) Bon papel de filtro sin peso 2) Bon papel de filtro con peso 3) Jecador de %eles entre papel celofn An:l'!'! d, lo! da"o!. 1) ,n los casos de la o)idaci!n lipdica de antio)idantes %raficar las medidas reali+adas en funci!n del tiempo identificando, donde amerite, las fases de latencia, propa%aci!n terminaci!n' 2) 5ndicar para cada fase los principales intermediarios in*olucrados "ue funci!n cumplen? reductor u o)idante' 3) 9ara el caso de la electroforesis, de acuerdo a la literatura, identificar las especies presentes en cada carril' ;) 6ipoteti+ar la ra+!n por la cual se obser*an cambios en la mo*ilidad electrofortica de la LDL incubada con Bu(55) como se relaciona con la formaci!n de las clulas espumosas' SBules seran los o)idantes responsables de la o)idaci!n de LDL in *i*oT

R,7,r,n#'a!. 6errera ,' 2etabolismo de las Lipoprotenas' 5n? AraU-6ill 52, ed' ,lementos de -io"umica, 1993' ,sterbauer 6, AebicFi H, 9u(l 6, Hur%ens A' @(e role of lipid pero)idation and antio)idants in o)idati*e modification of LDL' Cree >adic -iol 2ed 1992. 13?3;1-9#' Vest(u +en H' @(e o)idation ( pot(esis of at(erosclerosis? an update' /nn Blin Lab Jci 199:. 2:?1-1#' Bos%ro*e H9, B(urc( DC, 9r or V/' @(e Finetics of t(e auto)idation of pol unsaturated fatt acids' Lipids 19=:. 22?299-3#;' @rostc(ansF , /', -att( an , B', -otti, 6', >adi, >', Denicola, /', and >ubbo, 6' Cormation of lipid-protein adducts in loU-densit lipoprotein b flu)es of pero) nitrite and its in(ibition b nitric o)ide' Arch. Biochem. Biophys. ;<=: 227-232'. 2##1 @rostc(ansF , /', Cerrer-Jueta, A', -att( an , B', -otti, 6', -atinic-6aberle, 5', >adi, >', and >ubbo, 6' 9ero) nitrite-mediated LDL o)idation is in(ibited b man%anese porp( ris in t(e presence of uric acid' Free. ad. Biol. Med. ;=: 1293-13##. 2##3