UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

CARRERA DE QUMICA FARMACUTICA

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE CUATRO PLANTAS NATIVAS DEL ECUADOR

Autor: Mayra Eugenia Paredes Gonzlez mayris_chiquita@hotmail.com

TESIS PARA OPTAR POR EL TTULO PROFESIONAL DE QUMICO FARMACUTICO

Tutor: Dra. Ximena Augusta ChiribogaPazmio xchiriboga@yahoo.com

Quito, Mayo del 2013

Paredes

Gonzlez,

Mayra

Eugenia

(2013).

Determinacin de la actividad antioxidante de cuatro plantas nativas del Ecuador. Trabajo de investigacin para optar por el grado de Qumica Farmacutica. Carrera de Qumica Farmacutica Quito: UCE. 120 p.

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DEDICATORIA

Considero que, los motores de mi esfuerzo y dedicacin son mis padres Luis y Rosa, porque son las personas ms grandiosas que tengo en este mundo, quienes me han dado el ejemplo de perseverancia. Por ltimo deseo dedicar mi trabajo a la Dra. Ximena Chiriboga, que ha estado durante el periodo de la elaboracin de esta tesis, proporcionndonos bases, retos, metas y dems objetivos para poder culminar la misma. Mayra

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AGRADECIMIENTOS

Doy gracias a Dios por guiar mis pasos a lo largo de mi vida.

Mi sincero agradecimiento a la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias Qumicas de manera especial a mis profesores que han sabido compartir sus conocimientos hacia m para formarme como un qumico farmacutico.

A todos mis amig@s con los que compart mi vida estudiantil, por haberme brindado siempre su apoyo, en los buenos y malos momentos.

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VI

VII

RESUMEN

Este trabajo de investigacin se desarroll para verificar la actividad antioxidante de las cuatro plantas nativas del Ecuador: Opuntia soederstromiana, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa

El inicio de la investigacin, se realiz la recoleccin del material vegetal, cada planta fue sometida a diferentes procesos: secado y molienda, para posteriormente realizar la obtencin del extracto etanlico total en el cual se realiz la investigacin fitoqumica.

Demostracin de la actividad antioxidante

del extracto hidroalcohlico de: Opuntia

soederstromiana, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa

Usando el mtodo de Capacidad Atrapadora del Radical o del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) a diferentes concentraciones de extracto de cada 50ug/mL planta: 200ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL,

Luego se procede a la investigacin y a la experimentacin farmacolgica y se efectu: la evaluacin de la actividad antioxidante.

Descriptores:
FITOQUMICA, Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes (Chonta) y Mauritia flexuosa (Morete), QUMICA VEGETAL, FARMACOGNOSIA.

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SUMMARY

This research was developed to verify the antioxidant activity of the four plants native to Ecuador: Opuntia soederstromiana, Dononea viscous Bactris gasipaes and Mauritia flexuosa

The beginning of the investigation, the time of collection of plant material, each plant was subjected to different processes: drying and grinding, later to make obtaining the total ethanol extract which was performed phytochemical research.

Demonstration of the antioxidant activity of hydroalcoholic extract of: Opuntia soederstromiana, Dononea viscous Bactris gasipaes and Mauritia flexuosa

Using the method of the Radical scavenger capacity or 2, 2-diphenyl-1-picrilhidrazilo (DPPH) at different concentrations of eachplant extract: 200ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL, 50ug/mL

Then comes the research and experimentation conducted pharmacological and: evaluation of antioxidant activity.

Descriptors:

PHYTOCHEMISTRY, Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Bactris gasipaes (Chonta) and Mauritia flexuosa

Dononea viscous (Chamana), PLANT CHEMISTRY,

(Morete)

PHARMACOGNOSY.

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CONTENIDO pg. DEDICATORIA ...............................................................................................................................III AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................... IV RESUMEN .................................................................................................................................... VIII SUMMARY ..................................................................................................................................... IX CAPTULO I ......................................................................................................................................1 EL PROBLEMA .................................................................................................................................1 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA..................................................................................... 1 1.2.FORMULACIN DEL PROBLEMA ..........................................................................................2 1.3.OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN .....................................................................................2 1.3.1.Objetivo general .........................................................................................................................2 1.3.2.Objetivos especficos .................................................................................................................2 1.4.IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION .........................................................................................2 1.5HIPTESIS DEL PROBLEMA ................................................................................................... 4 CAPTULO II .....................................................................................................................................5 MARCO TERICO ............................................................................................................................5 2.1.ANTECEDENTES........................................................................................................................5 2.2.FUNDAMENTO TERICO ........................................................................................................6 2.2.1 Fundamento Botnico y Taxonmico de: ................................................................................ 6 2.2.1.1 Tuna Roja Opuntia soederstromiana................................................................................. 6 2.2.1.1.1 Familia................................................................................................................................. 6 2.2.1.1.2 Nombre cientfico................................................................................................................ 6 2.2.1.1.3 Nombre comn ................................................................................................................... 6 2.2.1.1.4 Sinnimos ........................................................................................................................... 7 2.2.1.1.5 Distribucin geogrfica ...................................................................................................... 7 2.2.1.1.6 Hbitat ................................................................................................................................. 7 2.2.1.1.7 Descripcin botnica ........................................................................................................... 7 2.2.1.1.8 Composicin qumica .......................................................................................................... 7 2.2.1.2 Chamana Dononea viscosa ................................................................................................ 8 2.2.1.2.1 Familia............................................................................................................................... 8 2.2.1.2.2 Nombre cientfico .............................................................................................................. 8 2.2.1.2.3 Nombre comn ................................................................................................................... 8

pg. 2.2.1.2.4 SINONIMIA ...................................................................................................................... 8 2.2.1.2.5 Distribucin geogrfica ....................................................................................................... 8 2.2.1.2.6 Hbitat ................................................................................................................................. 8 2.2.1.2.7 Descripcin botnica .......................................................................................................... 8 2.2.1.2.8 Composicin qumica .......................................................................................................... 9 2.2.1.2.9 Etnofarmacologia y Usos ................................................................................................... 9 2.2.1.3 Palma de Chonta Bactris gasipaes ................................................................................... 10 2.2.1.3.1 Familia.............................................................................................................................. 10 2.2.1. 3.2 Nombre cientfico ............................................................................................................ 10 2.2.1.3.3. Nombre comun ................................................................................................................. 10 2.2.1.3.4. Sinnimos ......................................................................................................................... 10 2.2.1.3.5 Hbitat ............................................................................................................................... 10 2.2.1.3.6 Distribucin geogrfica ..................................................................................................... 10 2.2.1.3.7 Descripcin botnica ......................................................................................................... 11 2.2.1.3.8 Composicin qumica ........................................................................................................ 12 2.2.1.3.9 Etnofarmacologa y Usos ................................................................................................. 12 2.2.1.4 Mauritia flexuosa L.f. Morete ........................................................................................... 12 2.2.1.4.1. Familia............................................................................................................................. 12 2.2.1.4.2 Nombre Cientfico ............................................................................................................ 13 2.2.1.4.3 Nombre Comun ................................................................................................................. 13 2.2.1.4.4. Sinnimos ......................................................................................................................... 13 2.2.1.4.5 Hbitat ............................................................................................................................... 13 2.2.1.4.6 Distribucin Geogrfica .................................................................................................... 13 2.2.1.4.7 Descripcin Botnica ........................................................................................................ 13 2.2.1.4.8 Composicin qumica ...................................................................................................... 14 2.2.1.4.9 Etnofarmacologia y Usos ............................................................................................... 14 2.3FUNDAMENTO DE INVESTIGACION FITOQUMICO ........................................................15 2.3.1Metabolitos Secundarios .......................................................................................................... 15 2.3.1.1Alcaloides .............................................................................................................................. 15 2.3.1.2Compuestos Fenlicos........................................................................................................... 16 a)Clasificacin de Compuestos Fenlicos........................................................................................ 16 2.3.1.3Quinonas ............................................................................................................................... 16 2.3.1.4Flavonoides ........................................................................................................................... 16 b) Clasificacin de Flavonoides .................................................................................................... 17

XI

pg. 2.3.1.5Antocianos............................................................................................................................. 17 2.3.1.6Taninos .................................................................................................................................. 18 2.3.1.7Saponinas .............................................................................................................................. 19 2.3.1.8Glucsidos Cardiotnicos ..................................................................................................... 19 2.3.1.9Aceites Esenciales ................................................................................................................. 19 2.4.1Cromatografa .......................................................................................................................... 19 2.4.2Clasificacin ............................................................................................................................. 20 2.4.2.1Cromatografa en Capa Fina ................................................................................................. 20 2.4.2.2Cromatografa en Columna ................................................................................................... 20 2.5.1Definicin ................................................................................................................................. 20 2.5.2 Antioxidantes y las Reacciones de Oxidacin ........................................................................ 21 2.5.2.1 Antioxidantes Primarios ....................................................................................................... 21 2.5.2.2 Antioxidantes Secundarios ................................................................................................... 21 a)Tocoferoles.................................................................................................................................... 21 Vitamina E y efectos fisiolgicos ............................................................................................. 21 b)cido ascrbico. ........................................................................................................................... 22 Vitamina C y efectos fisiolgicos............................................................................................. 22 c)Carotenoides.................................................................................................................................. 23 2.5.2.3 Antioxidantes Terciarios ...................................................................................................... 24 2.5.3 Especies Reactivas del Oxigeno (RO) y Radicales Libres ...................................................... 24 2.5.4 Antioxidantes Vegetales .......................................................................................................... 25 2.6.1 Capacidad Atrapadora del Radical DPPH ............................................................................... 27 2.6.2 Ensayo de Decoloracin del Catin Radical ABTS ................................................................ 27 2.6.3 Determinacin del Poder Reductor/Antioxidante Frrico (FRAP). ........................................ 28 CAPTULO III ..................................................................................................................................30 METODOLOGA .............................................................................................................................30 3.1.TIPO DE INVESTIGACIN .....................................................................................................30 3.2.POBLACIN Y MUESTRA ......................................................................................................30 3.2.1 Poblacin ................................................................................................................................. 30 3.2.2 Muestra.................................................................................................................................... 30 3.3.DISEO EXPERIMENTAL ......................................................................................................30 3.3.1 Diseo Estadstico ................................................................................................................. 31 3.3.1.1 Caractersticas de los tratamientos ...................................................................................... 31 3.3.2 Variables: ............................................................................................................................... 31

XII

pg. Independientes: .................................................................................................................................31 Dependientes: ....................................................................................................................................31 3.3.3 Recoleccin de datos para el diseo es completamente al azar con muestreo (DBCA)...... 32 3.3.4 Cuadro de anlisis de varianza (ADEVA) para el clculo del diseo experimeltal ............... 32 3.3.5 Prueba F ................................................................................................................................. 33 3.3.6 Prueba t comparacin de la media de dos muestras ............................................................... 35 3.3.7Prueba de Correlacin .............................................................................................................. 35 3.4.TCNICAS E INSTRUMENTOS ANALTICOS .....................................................................35 4.2. ETAPA I.................................................................................................................................... 44 4.2.1 Recoleccin: ............................................................................................................................ 44 a)Nombre de las colectoras .............................................................................................................. 44 b)Lugar y fecha de recoleccin ........................................................................................................ 44 4.2.2 Identificacin Taxonmica ...................................................................................................... 45 a)Familia: CACTACEAE ................................................................................................................ 45 c)Nombre cientfico: Opuntia soederstromiana ............................................................................... 45 d)Nombre comn: Tuna roja ............................................................................................................ 45 b)Familia: SAPINDACEAE ............................................................................................................ 45 e)Nombre cientfico: Dodonaea viscosa .......................................................................................... 45 f)Nombre comn: Chamana ............................................................................................................. 45 c)Familia: ARECACEAE ................................................................................................................ 45 g)Nombre cientfico: Bactris gasipaes ............................................................................................ 45 h)Nombre comn: Palma de Chonta .............................................................................................. 45 d)Familia: ARECACEAE ................................................................................................................ 45 i)Nombre cientfico: Mauritia flexuosa L.f. ..................................................................................... 45 j)Nombre comn: Morete ................................................................................................................. 45 4.2.3 Secado del Material Vegetal ................................................................................................... 45 4.2.4 Investigacin Fitoqumica ....................................................................................................... 46 4.2.4.1 Obtencin del extracto etanlico total .................................................................................. 46 A.Tuna roja ...................................................................................................................................... 46 Marcha Fitoqumica ......................................................................................................................... 46 a)Investigacin de Alcaloides .......................................................................................................... 47 b)Investigacin de Esteroles............................................................................................................. 47 c)Investigacin de Flavonoides ........................................................................................................ 47 d)Investigacin de Antocianos ......................................................................................................... 48

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pg. e)Investigacin de Antraquinonas .................................................................................................... 48 f)Investigacin de Taninos ............................................................................................................... 48 g)Investigacin de Saponinas ........................................................................................................... 49 h)Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos ................................................................................... 49 i)Cromatografa ................................................................................................................................ 49 B.Chamana ....................................................................................................................................... 49 Marcha Fitoqumica ......................................................................................................................... 50 a)Investigacin de Alcaloides .......................................................................................................... 50 b)Investigacin de Esteroles............................................................................................................. 51 c)Investigacin de Flavonoides ........................................................................................................ 51 d)Investigacin de Antocianos ......................................................................................................... 51 e)Investigacin de Antraquinonas .................................................................................................... 52 f)Investigacin de Taninos ............................................................................................................... 52 g)Investigacin de Saponinas ........................................................................................................... 52 h)Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos ................................................................................... 52 i)Cromatografa ................................................................................................................................ 53 C.Palma de chonta ............................................................................................................................ 53 Marcha Fitoqumica ......................................................................................................................... 54 a)Investigacin de Alcaloides .......................................................................................................... 54 b)Investigacin de Esteroles............................................................................................................. 54 c)Investigacin de Flavonoides ........................................................................................................ 55 d)Investigacin de Antocianos ......................................................................................................... 55 e)Investigacin de Antraquinonas .................................................................................................... 55 f)Investigacin de Taninos ............................................................................................................... 56 g)Investigacin de Saponinas ........................................................................................................... 56 h)Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos ................................................................................... 56 i)Cromatografa ................................................................................................................................ 57 D.Morete .......................................................................................................................................... 57 Marcha Fitoqumica ......................................................................................................................... 57 a)Investigacin de Alcaloides .......................................................................................................... 58 b)Investigacin de Esteroles............................................................................................................. 58 c)Investigacin de Flavonoides ........................................................................................................ 59 d)Investigacin de Antocianos ......................................................................................................... 59 e)Investigacin de Antraquinonas .................................................................................................... 59

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pg. f)Investigacin de Taninos ............................................................................................................... 60 g)Investigacin de Saponinas ........................................................................................................... 60 h)Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos ................................................................................... 60 i)Cromatografa ................................................................................................................................ 61 4.2.5 Investigacin Farmacolgica................................................................................................... 64 4.2.5.1 Obtencin del Extracto Hidroalcohlico .............................................................................. 64 4.3.1 Evaluacin de la Actividad Antioxidante del Extracto .......................................................... 64 4.3.1.1 Clculos de la dosis de extracto a ensayar ........................................................................... 64 4.3.1.2 Clculo del volumen del extracto ........................................................................................ 65 4.3.1.3 Recoleccin de datos .......................................................................................................... 66 4.3.1.3 Clculo del % Inhibicin del radical libre de la Vitamina C (Actividad Antioxidante) ..... 67 4.4 ANLISIS ESTADSTICO ....................................................................................................... 76 4.4.1Dononea viscosa (Chamana) .................................................................................................... 77 Prueba t comparacin de la media de dos muestras ............................................................... 85

CAPTULO V ...................................................................................................................................90 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................................90 5.1. Conclusiones: .............................................................................................................................90 5.2. Recomendaciones: .....................................................................................................................92 BIBLIOGRAFA ..............................................................................................................................93

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LISTA DE TABLAS

pg. Tabla2.1: Estructura de Tocoferoles .............................................................................................. 22 Tabla2.2: Resume las principales especies reactivas del Oxgeno ................................................... 24 Tabla3.3: Caractersticas de los tratamientos ................................................................................... 31 Tabla3.4: Combinaciones entre variables ........................................................................................ 32 Tabla3.5: Ecuaciones para el diseo experimental .......................................................................... 32 Tabla3.6: Identificacin de Alcaloides............................................................................................. 37 Tabla 3.7: Identificacin de Esteroles .............................................................................................. 37 Tabla 3.8: Identificacin de Flavonoides ......................................................................................... 38 Tabla 3.9: Identificacin de Antocianos........................................................................................... 38 Tabla3.10: Identificacin de Antraquinonas .................................................................................... 38 Tabla 3.11: Identificacin de Taninos .............................................................................................. 39 Tabla3.12: Identificacin de Saponinas ........................................................................................... 39 Tabla 3.13: Identificacin de Cardiotnicos .................................................................................... 39 Tabla3.14: Fase Mvil y Reveladores .............................................................................................. 40 Tabla4.15: Resultados de la Identificacin de Alcaloides ............................................................... 47 Tabla4.16: Resultados de la Identificacin de Esteroles .................................................................. 47 Tabla4.17: Resultados de la Identificacin de Flavonoides ........................................................... 47 Tabla4.18: Resultados de la Identificacin de Antocianos ............................................................ 48 Tabla4.19: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas ......................................................... 48 Tabla4.20: Resultados de la Identificacin de Taninos .................................................................... 48 Tabla4.21: Resultados de la Identificacin de Saponinas .............................................................. 49 Tabla4.22: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos ........................................ 49 Tabla4.23: Resultados de la cromatografa .................................................................................... 49 Tabla4.24: Resultados de la Identificacin de Alcaloides ............................................................... 50 Tabla 4.25: Resultados de la Identificacin de Esteroles ................................................................. 51 Tabla4.26: Resultados de la Identificacin de Flavonoides ............................................................. 51 Tabla4.27: Resultados de la Identificacin de Antocianos ............................................................ 51 Tabla4.28: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas ......................................................... 52 Tabla4.29: Resultados de la Identificacin de Taninos .................................................................... 52 Tabla4.30: Resultados de la Identificacin de Saponinas ................................................................ 52 Tabla4.31: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos ........................................ 53 Tabla4.32: Resultados de la cromatografa ...................................................................................... 53

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pg. Tabla4.33: Resultados de la Identificacin de Alcaloides ............................................................... 54 Tabla4.34: Resultados de la Identificacin de Esteroles .................................................................. 54 Tabla4.35: Resultados de la Identificacin de Flavonoides ............................................................. 55 Tabla4.36: Resultados de la Identificacin de Antocianos .............................................................. 55 Tabla4.37: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas ......................................................... 55 Tabla4.38: Resultados de la Identificacin de Taninos .................................................................... 56 Tabla4.39: Resultados de la Identificacin de Saponinas ................................................................ 56 Tabla4.40: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos ........................................ 56 Tabla4.41: Resultados de la cromatografa ...................................................................................... 57 Tabla4.42: Resultados de la Identificacin de Alcaloides.............................................................. 58 Tabla 4.43: Resultados de la Identificacin de Esteroles ................................................................. 58 Tabla4.44: Resultados de la Identificacin de Flavonoides ............................................................. 59 Tabla4.45: Resultados de la Identificacin de Antocianos .............................................................. 59 Tabla 4.46: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas ........................................................ 59 Tabla4.47: Resultados de la Identificacin de Taninos .................................................................... 60 Tabla4.48: Resultados de la Identificacin de Saponinas ................................................................ 60 Tabla 4.49: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos ....................................... 60 Tabla4.50: Resultados de la cromatografa ...................................................................................... 61 Tabla4.51: Resultados generales de Marcha Fitoqumica Opuntia soederstromiana (Tuna Roja). 61 Tabla4. 52: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Dononea viscosa (Chamana) ........... 62 Tabla4.53: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Bactris gasipaes (Palma de chonta)... 62 Tabla4.54: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Mauritia flexuosa (Morete) ............... 63 Tabla 4.55: Datos de la obtencin de los Extractos Hidroalcohlicos ............................................ 64 Tabla4.56: Concentracin de extracto de planta .............................................................................. 65 Tabla4.57: Volumen de Extracto de planta para preparar las diferentes concentraciones ............... 66 Tabla4.58: Absorbancias del blanco muestra Vitamina C ............................................................... 66 Tabla4.59: Absorbancias de muestra Vitamina C .......................................................................... 66 Tabla4.60: % Inhibicin de radical libre - Vitamina C .................................................................... 67 Tabla4.61: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Vitamina C ................... 67 Tabla4.62: Absorbancias de blanco de muestra - Opuntia soederstromiana (Tuna roja) ................ 69 Tabla4.63: Absorbancias de muestra - Opuntia soederstromiana (Tuna roja) ................................. 69 Tabla 4.64: Absorbancias de blanco de muestra - Dononea viscosa (Chamana) ............................. 70 Tabla4.65: Absorbancias de muestra - Dononea viscosa (Chamana) .............................................. 70 Tabla 4.66: % Inhibicin de radicales libres - Dononea viscosa (Chamana) ................................... 70 Tabla4.67: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Dononea viscosa ......... 71

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pg. Tabla4.68: Absorbancia del blanco muestra Mauritia flexuosa (Morete) ....................................... 72 Tabla4.69: Absorbancias de muestra - Mauritia flexuosa (Morete)................................................. 72 Tabla4.70: % Inhibicin de radicales libres - Mauritia flexuosa (Morete) ...................................... 72 Tabla4.71: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Mauritia flexuosa ........ 73 Tabla4.72: Absorbancias del blanco muestra Bactris gasipaes (Chonta) ....................................... 74 Tabla4.73: Absorbancias de muestra Bactris gasipaes (Chonta) ................................................... 74 Tabla4.74: % Inhibicin de radicales libres - Bactris gasipaes (Chonta) ....................................... 74 Tabla4.75: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Bactris gasipaes ......... 75 Tabla4.76: Relacin de Concentracin de extracto y el porcentaje de Inhibicin radicalaria ......... 77 Tabla4.77: Relacin de Concentracin de extracto y el % de Inhibicin radicalaria ....................... 80 Tabla4.78: Relacin de Concentracin de extracto y el porcentaje de Inhibicin radicalaria ......... 83 Tabla4.79: Datos para realizar Prueba t comparacin de la media de dos muestras ........................ 86 Tabla 4.80: Tabla de prueba F .......................................................................................................... 86

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LISTA DE FIGURAS pg. Figura 2.1:Estructura qumica de los flavonoides ............................................................................. 6 Figura2.2: Opuntia soederstromiana ................................................................................................ 7 Figura2.3:Dononea viscosa ............................................................................................................... 9 Figura2.4:Bactris gasipaes Palma de chonta ................................................................................... 11 Figura2.5: Mauritia flexuosa. .......................................................................................................... 14 Figura 2.6: Estructura qumica de antocianinas y antocianidinas ................................................... 17 Figura2.7: Pelargonidina, cianidina y delfinidina presentes en algunos gneros ............................ 18 Figura 2.8: Estructura qumica de los taninos condensados (A ) e hidrolizables (B) ...................... 18 Figura 2.9: Oxidacin del cido ascrbico a cido dehidroascrbico ............................................. 23 Figura 2.10: Mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) ....................................................... 27 Figura3. 11: % Inhibicin de Radical Libre - Concentracin de Extracto ....................................... 35 Figura 3.12: Diagrama de Actividad Antioxidante .......................................................................... 43 Figura 4.13: Absorbancia vs Concentracin Vitamina C ................................................................ 68 Figura 4.14: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin - Vitamina C ................................. 68 Figura 4.15: Absorbancia vs Concentracin Opuntia soederstromiana (Tuna roja) ....................... 69 Figura 4.16: Absorbancia vs Concentracin Dononea viscosa (Chamana) ..................................... 71 Figura 4.17: % Inhibicin de radicales libres vs Concentracin - Dononea viscosa (Chamana) ..... 71 Figura 4.18: Absorbancia vs Concentracin - Mauritia flexuosa (Morete)...................................... 73 Figura 4.19: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin- Mauritia flexuosa (Morete) ......... 73 Figura 4.20: Absorbancia vs Concentracin - Bactris gasipaes (Chonta) ....................................... 75 Figura 4.21: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin- Bactris gasipaes (Chonta) ........... 75 Figura 4.22: Actividad Antioxidante ................................................................................................ 76 Figura 4.23: Comparacin de Actividad Antioxidante .................................................................... 79 Figura 4.24: Comparacin de Actividad Antioxidante .................................................................... 82 Figura 4.25: Comparacin de Actividad Antioxidante .................................................................... 85

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CAPTULO I EL PROBLEMA

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En los seres vivos aerobios se generan continuamente radicales libres y especies reactivas de oxgeno tales como anin superxido, radical hidroxilo y oxgeno singlete, derivados de procesos fisiolgicos normales, como la fosforilacin oxidativa y como resultado de la exposicin diaria a la radiacin ionizante, la contaminacin atmosfrica, el humo del cigarrillo, entre otros.(Halliwell, 2000)

Los radicales libres son especies muy reactivas que pueden daar biomolculas como carbohidratos, protenas, lpidos, y ADN y, por consiguiente, afectar la membrana plasmtica y organelos, como la mitocondria y el ncleo celular (Choksi, Acta 2004). La clula se protege de los radicales libres mediante la accin de sistemas enzimticos antioxidantes como la superxido dismutasa (SOD), la lactoferrina, la catalasa y la glutatin peroxidasa, y de sistemas no enzimticos donde se incluyen antioxidantes como las vitaminas E y C, flavonoides y carotenoides provenientes de la dieta (Yilmaz S, Ozan S, 2003; Szeto YT, Collins AR, Benzie LFF. 2002). Sin embargo, cuando los radicales libres producidos en el organismo sobrepasan la capacidad de la clula para protegerse o repararse por s misma, conducen al estrs oxidativo, el cual est asociado a enfermedades degenerativas o crnicas como el cncer, la arterioesclerosis, la artritis reumatoide a, el mal de Parkinson, diabetes mellitus, envejecimiento y la infertilidad masculina. (Mark R, McCalland B, & Diner Y, 2003) La accin oxidativa causada por los radicales libres puede ser neutralizada mediante el uso de antioxidantes naturales o sintetizados qumicamente. Algunos antioxidantes como la quercetina, el -tocoferol, el -caroteno y el cido ascrbico han demostrado efecto protector contra una variedad de enfermedades como cncer de esfago, lcera estomacal y duodenal, infertilidad masculina y dao oxidativo inducido por endotoxinas. (Sierens J, Da Silva J, & LC., 2005)

El butilhidroxianisol (BHA), y el butil hidroxitolueno (BHT) son los antioxidantes sintticos de mayor uso en la industria de alimentos y farmacutica; sin embargo, se han encontrado efectos secundarios en humanos, como el aumento del colesterol, hepatomegalia e induccin de cncer heptico, entre otras. Por lo anteriormente expuesto, de ah que existe, un creciente inters en buscar nuevas molculas antioxidantes que no presenten efectos citotxicos ni genotxicos, siendo las plantas poseedoras de molculas de origen natural una muy buena fuente de antioxidantes que no tienen efectos nocivos.

1.2.

FORMULACIN DEL PROBLEMA evaluar la actividad antioxidante de cuatro plantas

El inters de esta investigacin radica en

nativas del Ecuador, utilizando un modelo in vitro que se basa en la capacidad oxidante del compuesto 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) que acta como radical libre, lo que permite la capacidad de los extractos de planta de estabilizar a este radical libre. 1.3. 1.3.1. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN Objetivo general Determinar la actividad antioxidante de cuatro plantas nativas del Ecuador. 1.3.2. Objetivos especficos

Seleccionar, colectar e identificar cuatro plantas nativas del Ecuador en base a sus caractersticas de endofarmacolgico y alimenticio. Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohlico de cuatro plantas nativas del Ecuador: Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Mauritia flexuosa (Morete), Bactris gasipaes (Chonta). Evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Mauritia flexuosa (Morete), Bactris gasipaes (Chonta) por medio de la tcnica 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). Establecer el porcentaje de Inhibicin del radical libre, de los extractos hidroalcohlicos de cuatro plantas nativas del Ecuador: Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Mauritia flexuosa (Morete), Bactris gasipaes (Chonta). Realizar una comparacin de la actividad antioxidante presente en los extractos hidroalcohlicos de plantas similares en base a las caractersticas de su regin proveniente. 1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIN En la sociedad actual por su nuevo estilo de vida ha desencadenado que se constituyan factores determinados que provoquen un mayor estrs oxidativo lo que, desencadena la formacin de especies reactivas de oxigeno (ROS), capases de daar macromolculas rompiendo el equilibrio normal de la clula, lo que se traduce en efectos fisiopatolgicos como: inflamacin, cncer, envejecimiento, etc. . Es por ello que en el ao 2004, en Orlando Florida, USA, se realiz el primer congreso Internacional sobre Metodologas Antioxidantes, para asegurar la calidad de alimentos, extractos de plantas, nutracuticos y otros suplementos dietarios. En esta reunin se propuso la necesidad de realizar varias tcnicas para asegurar la capacidad antioxidante,

debido a que un buen antioxidante, para su correcta evaluacin, debe cumplir con muchos requisitos como: una alta solubilidad en el medio, una correcta orientacin para interactuar con los radicales libres, orientarse adecuadamente en un sistema emulsificado (alimento), proteger los lpidos oxidables, ser un buen reductor y funcionar con alta reactividad, efectividad a diferentes pH y, en general, debido a los diversos mecanismos del antioxidante en el sitio de accin(Prior RL, 2005) El isoespintanol (2-Isopropil-3,6-dimetoxi-5-metilfenol) es un monofenol extrado del extracto etreo de las hojas de Oxandra cf xylopioides, familia ANNONACEAE. Se encontr que este compuesto, a las 3 horas, redujo en un 43 % la inflamacin inducida por carragenina, en las patas de ratones. Adems, redujo la produccin de 1L-1 (interleuquinas) en un 72 % e inhibi significativamente la sntesis de mRNA de IL-1 .De otro lado, el isoespintanol, terica y experimentalmente, se comport como mejor captador de radicales y mejor reductor que el timol (anlogo biosinttico). (Rojano, 2007)

Debido al porcentaje tan alto encontrado para un producto natural como el isoespintanol (1.5%) y sus caractersticas estructurales adecuadas como un antioxidante promisorio para usar en diferentes medios, en este trabajo se estudiaron comparativamente el isoespintanol y el BHT por diferentes tcnicas. (Hocquemiller R, Corts D, Arango GJ,J Nat Prod 1991 ).

La regin andina y amaznica de nuestro pas posee una variada flora y dentro de ella, muchas especies con reconocida en la medicina tradicional. De aqu la importancia de la bsqueda de fuentes de antioxidantes naturales se seleccion en base a la informacin endomdica, estas plantas procedentes de estas regiones con el objetivo de determinar algunas especies vegetales que presentan actividad antioxidante.

La Opuntia soederstromiana, el zumo del corazn machado se usa para tratar las inflamacin de los pies. La flor de la planta sirve generalmente para tratar la tos. (De La Torre, 2008)

Dononea viscosa, que se la utiliza en forma de infusin de las hojas. Para tratar desrdenes nerviosos: Las hojas machacadas en forma de emplasto se usan para torceduras, esguinces, e inflamaciones. (De La Torre, 2008)

La Bactris gasipaes, el fruto es comestible, se consume tostado, asado o cocido con sal, se lo usa para preparar chicha, jugos y conservas en leche. (De La Torre, 2008)

Mauritia flexuosa, desde tiempos inmemoriales la poblacin nativa hace un uso mltiple de esta palma, especialmente el pueblo Achuar de la amazonia ecuatoriana consumen los frutos cuya pulpa es altamente nutritiva y contiene protenas, grasa, vitaminas y carbohidratos. Se come fresca directamente o se usa para fabricar bebidas como el carato de moriche e incluso para hacer un dulce llamado turrn de moriche; y para extraer aceite. De las hojas se extraen fibras para fabricar cordeles, cestas, chinchorros y otros objetos. (De La Torre, 2008)

Por esta razn es importante el investigar y desarrollar nuevos compuestos con actividad antioxidante a partir de plantas que se encuentran en nuestro pas.

1.5

HIPTESIS DEL PROBLEMA Los extractos hidroalcohlicos de las cuatro plantas seleccionadas pueden tener actividad antioxidante.

CAPTULO II MARCO TERICO

2.1.

ANTECEDENTES

Los antioxidantes son molculas capaces de retardar o prevenir la oxidacin de otras molculas. La oxidacin es una reaccin qumica de transferencia de electrones de una sustancia a un agente oxidante. Las reacciones de oxidacin pueden producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que daan las clulas. Esto se produce debido a que los radicales libres son tomos o grupos de tomos que tienen un electrn desapareado con capacidad de aparearse, por lo que son muy reactivos, por lo tanto, recorren nuestro organismo intentando robar un electrn de las molculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroqumica y lograr su funcin especfica en la clula. La vida biolgica del radical libre es de microsegundos, pero tiene la capacidad de reaccionar con todo lo que est a su alrededor provocando un estrs oxidativo que puede conducir a diversas enfermedades, tales como envejecimiento, problemas del sistema cardiovascular (arterosclerosis), problemas en el sistema nervioso, dao gentico (mutaciones y cnceres). Algunas de las sustancias antioxidantes naturales ms conocidas son el caroteno (provitamina A), la vitamina C (cido ascrbico), la vitamina E (tocoferol), el selenio, etc. (Prior RL, 2005) Las evidencias epidemiolgicas que asocian el consumo de vegetales y frutas con una menor incidencia de enfermedades crnicas, junto con la mayor preocupacin de los consumidores por mantener un estado de salud adecuado, estn llevando a las industrias alimentarias a disear alimentos funcionales que supongan un aporte extra de estos antioxidantes naturales. Muchos de los efectos beneficiosos asociados al consumo de alimentos de origen vegetal se atribuyen en gran medida a la actividad antioxidante de los compuestos fenlicos los mismos que constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios de las plantas, en donde desempean diversas funciones fisiolgicas como intervenir en el crecimiento y reproduccin de las plantas y en procesos defensivos frente a patgenos, predadores y radiacin ultravioleta. La actividad antioxidante de estos compuestos fenlicos radica en la gran facilidad que poseen para ceder tomos de hidrgeno de un grupo hidroxilo aromtico a un radical libre. Como antioxidantes, los polifenoles pueden proteger las clulas contra el dao oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de varias enfermedades degenerativas asociadas al estrs oxidativo causado por los radicales de oxgeno.

Entre los compuestos fenlicos ms importantes se encuentran los flavonoides, que son sintetizados en cantidades substanciales por las plantas. Los compuestos fenlicos comprenden alrededor de 4 000 compuestos identificados, son derivados hidroxilados, metoxilados y glicosilados, que consiste en dos anillos benceno combinados por mediacin del oxgeno contenido en el anillo pirano.Dentro de los compuestos fenlicos se encuentran los flavonoides, los cuales que, adems de su comprobada actividad antioxidante, se les ha atribuido una gran diversidad de efectos teraputicos, tales como actividades cardiotnica, antiinflamatoria, hepatoprotectora, antineoplstica, antimicrobial, vasodilatadora, etc.La estructura base, un esqueleto C6-C3-C6, puede sufrir posteriormente muchas modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que los flavonoides son una familia muy diversa de compuestos, aunque todos los productos finales se caracterizan por ser polifenlicos y solubles en agua.

Figura 2.1: Estructura qumica de los flavonoides Por: (Gilberto, 2003)

La propuesta para el desarrollo de la tesis es evaluar la actividad la antioxidante en cuatro extractos hidroalcohlicos de plantas nativas del Ecuador, para validar el uso de un nuevo antioxidante de origen natural. 2.2. FUNDAMENTO TERICO

2.2.1 Fundamento Botnico y Taxonmico de: 2.2.1.1 Tuna Roja Opuntia soederstromiana 2.2.1.1.1Familia CACTACEAE 2.2.1.1.2 Nombre cientfico Opuntia soederstromiana 2.2.1.1.3 Nombre comn Tuna roja

2.2.1.1.4 Sinnimos Opuntia dobbieana 2.2.1.1.5 Distribucin geogrfica En el Ecuador se encuentra distribuida en Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Esmeraldas. En especial Opuntia. soederstromiana crece abundantemente en los valles de Guayllabamba y Chota. Considerada Vulnerable. (Balslev, 1999) 2.2.1.1.6 Hbitat La Opuntia soederstromiana es endmica del continente americano que se desarrollan principalmente en las regiones ridas y semiridas (Flores et al. 1995). (Alonso, 2004) 2.2.1.1.7 Descripcin botnica Arbusto: de alrededor de 1 m de altura, hojas con puntas rojas de hojas verdes con espinas largas y pequeas como pelos, que se despegan fcilmente y penetran en la piel de quien las toca. Las flores: amarillas y rojas atraen abejas, aves y murcilagos. Fruto: Es un elemento de las cercas vivas, apetecida por los frutos oval-redondos presentan espinosa, de 3-4 cm de dimetro, son de color rojo oscuro, dulces y jugosos. 2.2.1.1.8 Composicin qumica No hay reportes en la bibliografa 2.2.1.1.9 Etnofarmacologia y Usos Etnofarmacologia

En la medicina tradicional el jugo se utiliza para tratar enfermedades bronquiales e intestinales Usos

Los tallos son utilizados como forraje para el ganado

Figura2.2: Opuntia soederstromiana Por: Imagen tomada en el Parque Jerusaln en Pichincha

2.2.1.2 Chamana Dononea viscosa 2.2.1.2.1Familia SAPINDACEAE 2.2.1.2.2Nombre cientfico Dodonaea viscosa 2.2.1.2.3 Nombre comn Chamana 2.2.1.2.4 SINONIMIA Dodonaea arabica Hochst. & Steud. Dodonaea arborea Herter Dodonaea aspleniifolia var. arborescens Hook.f. Dodonaea bialata Kunth Dodonaea candolleana Blume Dodonaea cuneata Rudge Dodonaea dioica Roxb. ex DC. Dodonaea ehrenbergii Schltdl. Dodonaea elaeagnoides Rudolphi ex Ledeb. & Adlerstam Dodonaea eriocarpa Sm.

Dodonaea fauriei H.Lv.(Alonso, 2004)

2.2.1.2.5 Distribucin geogrfica La Dononea viscosa se origina en el norte de Suramrica, es nativa de nuestro pas. En el Ecuador se encuentra en: Galpagos, Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Caar, Azuay, Loja. Esta planta dentro de la provincia de Pichincha se encuentra en todos los terrenos secos de Cotocollao, Pomasqui y San Antonio. 2.2.1.2.6 Hbitat La Dononea viscosa vive en bosques secos montaosos bajos (Mostacero, 2002) 2.2.1.2.7 Descripcin botnica Arbusto: verde de 2-3 (-5) m de altura, dioico o polgamo-dioico, con los tallos glabros, rojizos, cuando jvenes glandulosos, acostillados.

Hojas: simples, de oblongo-lanceoladas a linear-lanceoladas o subespatuladas, de 5-12 x 1,5-5 cm, con la base normalmente atenuada en un corto pecolo, el margen entero y el pice agudo o redondeado; son glabras, cubiertas densamente de glndulas en ambas superficies, hace vscidas. Inflorescencias: en tirsos o cimas axilares o terminales, ms cortos que las hojas, sobre un pednculo muy cort. Flores: unisexuales, amarillentas, de unos 5 mm de dimetro, sobre pedicelos de 2-5 mm de longitud, acrescentes en la fructificacin, llegando hasta 12 mm de longitud. Cliz de 4 spalos libres, ovado-triangulares, de 2-3 mm de largo; corola ausente. Androceo con (4-) 8 (-12) estambres, con los filamentos muy cortos y las anteras curvadas, de 2-3 mm de largo. Ovario elipsoide, con 2-3 lculos; estilo de 4-6 mm de largo, con el pice lobulado. Fruto: en cpsula comprimida, membrancea, de unos 2 x 2 cm, con (2-) 3-4 alas orbiculares, de 46 (-10) mm de ancho; semillas 2-4, lenticulares, negras, sin arilo.(Mostacero, 2002)

Figura2.3: Dononea viscosa Por: Imagen tomada en el Parque Jerusaln en Pichincha

2.2.1.2.8 Composicin qumica No hay reportes en la bibliografa 2.2.1.2.9 Etnofarmacologia y Usos Etnofarmacolga

Se usa medicinalmente para detener hemorragias (hemosttico), aliviar problemas de huesos y respiratorios. Usos

Tambin se usa en actividades silviculturales para ayudar en la regeneracin de suelos con alto grado de erosin, y es inductor de procesos de restauracin de bosques secundarios. (Barriga Garca, 1992)

2.2.1.3 Palma de Chonta Bactris gasipaes

2.2.1.3.1 Familia ARECACEAE 2.2.1. 3.2 Nombre cientfico Bactris gasipaes 2.2.1.3.3. Nombre comn Palma de Chonta 2.2.1.3.4. Sinnimos Bactris ciliata (Ruiz & Pav.) Mart. Bactris insignis (Mart.) Baill. Bactris speciosa (Mart.) H.Karst. Bactris utilis (Oerst.) Benth. & Hook.f. ex Hemsl. 2.2.1.3.5 Hbitat El chontaduro o conocido como Bactris gasipaes, crece muy bien en alturas que van desde el nivel del mar hasta los 1000 metros. Se adapta fcilmente a suelos permeables que faciliten el buen drenaje. (Shiguango, 1997) 2.2.1.3.6 Distribucin geogrfica Bactris gasipaes, nativa de las regiones tropicales y subtropicales de Amrica. Se aprovecha su fruto, una drupa de gran valor alimentario, su madera y el cogollo tierno, que se cosecha para extraer palmito. En Colombia, en la inmensa mayora del pas se le llama chontaduro, mientras que en las zonas del eje cafetero se le llama y/o se le conoce como "cachipay". El Tambo (Colombia), en el Departamento del Cauca, es el mayor productor de chontaduro en el pas. Las temporadas de cosecha son, la primera entre enero y mayo, y la segunda entre agosto y noviembre. En la primera cosecha del ao 2005 la regin aport unas seis mil toneladas, equivalentes al 50% de la produccin nacional de chontaduro. En Venezuela, especficamente en la regin al sur del Orinoco (Estados Bolvar y Amazonas) se le denomina "pijiguao" o "pichiguao" a esta especie de palma, incluso existe una poblacin con el nombre "Los Pijiguaos" originado por la abundancia de esta especie. En Costa Rica son muy populares y se consumen con mayonesa, son conocidos popularmente como 'pejibayes'. En Panam donde es muy abundante en las tierras bajas, se le conoce con los nombres "pif", "pib" y "pixbae", de la palma se consume el fruto, que se cocina previamente en agua con sal y se

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expende en tiendas, mercados y kioscos. En la ciudad de Panam es popularmente ofrecido por vendedores ambulantes, quienes pregonan su producto por las calles, esquinas y semforos. Es comn consumirlo caliente, con sal y mayonesa. En el Ecuador se encuentra en la zona oriental, donde muchas etnias indgenas (por ej. Shuar, Quichua) utilizan la Palma de Chonta para la preparacin de la chicha. Tambin se consume el palmito y las hojas para colorar canastos. En el Per es abundante en la selva baja de la Amazona Peruana Se desarrolla en zonas con altitudes desde el nivel del mar hasta los 1.200 m en el Per y Ecuador. (Shiguango, 1997) 2.2.1.3.7Descripcin botnica La palma: es de porte erecto puede alcanzar hasta 20 m de altura, siendo lo ms frecuente observar plantas con 12 a 15 m y un dimetro entre 15 y30 cm. Los tallos: presentan espinas, las que se ubican en los anillos entre las cicatrices de las hojas viejas y son de color negro, salen ms o menos perpendicular al tronco, miden hasta 8cm de longitud y son quebradizas cuando han completado su desarrollo. El tallo est coronado por 15 a 25 anillos foliares, con las hojas curvadas insertadas en espiral. Las hojas: miden entre 1.5 y 4.0 m en las palmas adultas, con un ancho entre 30 y 50 cm. Los foliolos se insertan en la fronda, con un plano de insercin diferente, formando un abanico que posiblemente le permite mayor eficiencia para captar la radiacin solar. (Balslev, 1999)

Figura2.4: Bactris gasipaes Palma de chonta Por: (Fernndez Vsquez, 2002)

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2.2.1.3.8 Composicin qumica El fruto de Bactris gasipaes, es una fuente importante de carbohidratos, calcio, fsforo, grasa, bajo en fibra y fuente de vitaminas (composicin por cada 100 g de mesocarpio de la fruta: agua 56%, caloras 194, protena 3.01%, grasa 6.14%, carbohidratos 33.05%, fibra 1.02%, ceniza 0.88%, calcio 44.6 mg, fsforo 101.84 mg, tiamina 0.030 mg, niacina 0.455 mg, rivoflavina 0.068 mg, caroteno 1.28 mg. (Johnson, 2003) 2.2.1.3.9 Etnofarmacologa y Usos

Etnofarmacologa

La cscara del fruto constituye un remedio popular contra enfermedades hepticas. (Barriga Garca, 1992) Usos

El fruto se consume despus de ser hervido en agua salada durante 30 minutos, del mesocarpio del fruto tambin se extrae aceite para cocinar. Las semillas se pueden consumir como frutos secos. La harina del fruto de chonta se fermenta para hacer chicha, una cerveza casera de buen sabor y propiedades nutritivas, o se usa tambin para pan, pasteles y masas y como substituto de la patata en guisos de carne y pescado. La parte central tierna del tallo de la planta, conocida como palmito, es un alimento que se comercializa fresco, seco y enlatado para su uso en ensaladas, sopas y rellenos, o como trocitos asados. El ensilado de los frutos se considera una excelente manera de almacenarlos para alimento de cerdos, aunque tambin se usa para vacunos o caballos. Las hojas proporcionan cubierta para los tejados de casas y material para hacer cestos. En algunos pases la planta es muy apreciada como ornamental. La inflorescencia es una buena fuente de polen para las abejas y las flores masculinas cocinadas sirven como condimento. La palma, incluyendo la hoja y partes del tallo, produce buena fibra para fabricar papel. Tambin se puede producir celulosa para celofn y rayn. El tronco es un material duradero para arcos, flechas, caas de pescar, arpones y tallas de madera. La parte blanda del tallo puede usarse para hacer licor. La madera es dura pero elstica, y tiene un amplio rango de usos, incluyendo construccin de casas, pisos, muebles y mangos de herramientas. De las hojas se obtiene un colorante verde para teir tejidos. Las races proporcionan un veneno para gusanos. En plantaciones, las hojas y partes del tallo que no se usan se emplean como fertilizante orgnico. (Cordero, 2003) 2.2.1.4 Mauritia flexuosa L.f. Morete 2.2.1.4.1. Familia ARECACEAE

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2.2.1.4.2 Nombre Cientfico Mauritia flexuosa L.f. 2.2.1.4.3 Nombre Comn Morete 2.2.1.4.4. Sinnimos Mauritia vinifera, Mauritia minor (Alonso, 2004) 2.2.1.4.5 Hbitat Mauritia flexuosa L.f., el hbitat donde se desarrolla es muy variado, desde tierras bajas inundadas permanentemente o estacionalmente hasta los terrenos bajos de tierra firme; desde el nivel del mar en la costa Atlntica hasta los 1000 msnm., en la ladera de los Andes; en suelos pantanosos, frtiles o arenosos, por lo que se puede afirmar que es una palmera con amplia plasticidad fisiolgica (Barriga Garca, 1992) 2.2.1.4.6 Distribucin Geogrfica La Mauritia flexuosa est ampliamente distribuida en toda la Amazonia desde el occidente por Colombia, Ecuador, Per y Bolivia; hacia el oriente a travs de las cuencas del Amazonas y del Orinoco por Venezuela, las Guayanas, Trinidad y los estados brasileos de Baha, Gois, Mato Grosso, Minas Gerais y Sao Paulo (Del CastilloT, 2006) En Ecuador se encuentra en la regin Amaznica, en las provincias de Morona-Santiago, Napo, Sucumbos, dentro de las reas protegidas de Jatun Sacha y el parque nacional Yasun. (Balslev, 1999) 2.2.1.4.7 Descripcin Botnica El Morete o aguaje es una palmera de hasta 40 m, de altura y 30 a 60 cm., de dimetro, con hojas palmadas de 8 a 20 dispuestas en espiral, vaina abierta con una capa fibrosa, pecolo de 1.6 a 4 m, de longitud, lamina cerca de 2.5 m, de longitud y 4.5 m, total, separados en cerca de 200 foliolos pendulados que miden de 4 a 5 cm, de ancho. La inflorescencia: es interfoliar, con flores simples, estaminadas densamente coronados en la raquila, spalos de 3.5 a 4.5 cm, ptalos lanceolados de 1 a 11 cm, de longitud. Flores: pistiladas de 8 mm, de longitud, spalos de 0.8 cm. El fruto es una drupa, oblongos o elipsoides hasta 7 cm, de longitud y 5 cm, de dimetro, el peso vara 40 a 80 g., el epicarpio es

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escamoso de color pardo a rojo oscuro, el mesocarpio suave, amilceo y aceitoso, de color amarillo, anaranjado rojizo, generalmente con una semilla. (Gonzlez San Jos, 2001)

Figura2.5: Mauritia flexuosa. Por: (Wilson, 2002)

2.2.1.4.8 Composicin qumica El fruto es comestible con una pulpa es altamente nutritiva que contiene minerales, protenas, grasa, vitaminas y carbohidratos, posee mayor reserva de beta-caroteno, vitamina A. Su alto contenido de vitamina A lo convierte en un recurso inigualable para la dieta de nios y madres gestantes, pues ayuda a la formacin y el mantenimiento de dientes sanos, de tejidos blandos y seos, de las membranas mucosas y de la piel. Esta vitamina contribuye a mejorar la visin, especialmente ante la luz tenue y tambin es necesaria durante la reproduccin y la lactancia. (Bernal, 1990)

El contenido en 100g es de: caloras 526, protena 11.0%, grasa 38.6%, carbohidratos 46.0%, fibra 41.9%, ceniza 4.4%, calcio 415.4 mg, fsforo 69.9 mg, tiamina 0.11 mg, niacina 2.57 mg y rivoflavina 0.85 mg; (Rojas, 2005) 2.2.1.4.9 Etnofarmacologia y Usos Etnofarmacologia

Su contenido en vitamina A hace recomendable su consumo para la prevencin de la xeroftalmia

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Usos

En la actualidad, ninguna fruta en la Amazona es comercializada en tantas diferentes formas como el Morete: maduro, verde, pulpa, aguajina (refresco en Per), chupetes, helados, mermeladas y yogures En el mercado de Iquitos el morete, se expende en diversas formas: como fruto entero, de color rojo vinoso; como masa amarilla o anaranjada, obtenida del mesocarpo y como bebida fermentada llamada chicha del mesocarpo cocido y fermentado, que posee un alto valor nutritivo La masa sirve tambin para preparar helados y pasteles. Las hojas sirven a menudo para confeccionar techos y tabiques de viviendas rurales o para la fabricacin de esterillas para puertas, cortinas y hamacas con la fibra del rbol (Alvarado, 1956). Otro uso frecuente es la confeccin de juguetes, as como de tapones para los botellones de aguardiente, utilizando en este caso la parte mediana del peciolo. Existen propuestas para utilizar los peciolos en la produccin de pasta de papel (Brunenton, 2001) Una vez derribada la palmera, larvas de colepteros (Rhynchophorus palmarum) se desarrollan en ella, estos gusanos blancos, gordos y sebosos no son otra cosa que una manteca viva que es una vianda muy sabrosa y sustancial. Tambin se extraa el vino de palma, como se hace actualmente en frica. (Barriga Garca, 1992) 2.3 FUNDAMENTODE INVESTIGACIONFITOQUMICO 2.3.1 Metabolitos Secundarios

Las plantas, organismos auttrofos, adems del metabolismo primario presente en todos los seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les permite producir y acumular compuestos de naturaleza qumica diversa. Estos compuestos derivados del metabolismo secundario se denominan metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonmicos, presentan propiedades biolgicas, muchos desempean funciones ecolgicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros. Reciben tambin la denominacin de productos naturales. (Zeiger, 2006) 2.3.1.1 Alcaloides

Los alcaloides son una gran familia de ms de 15.000 metabolitos secundarios que tienen en comn tres caractersticas: sabor amargo, se forman a partir de aminocidos, contienen nitrgeno heterocclico, lo que les confiere propiedades bsicas. La mayora son heterocclicos aunque algunos son compuestos nitrogenados alifticos (no cclicos) como la mescalina o la colchicina, por ejemplo. (Brunenton, 2001)

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2.3.1.2

Compuestos Fenlicos

Son compuestos orgnicos en cuyas estructuras moleculares contienen al menos un grupo fenol, un anillo aromtico unido a al menos un grupo funcional. Muchos son clasificados como metabolitos secundarios de las plantas, aquellos productos biosintetizados en las plantas que poseen la caracterstica biolgica de ser productos secundarios de su metabolismo. En general son sintetizados por una de dos vas biosintticas: la ruta del cido shikmico o la va del cido malnico (o por las dos, por ejemplo los flavonoides). Los compuestos fenlicos de las plantas son un grupo heterogneo de productos con ms de 10.000 compuestos. Algunos son solubles en solventes orgnicos, otros son glucsidos o cidos carboxlicos y por lo tanto solubles en agua, y otros son polmeros muy grandes e insolubles. Este grupo tambin juega una variedad muy heterognea de roles en las plantas, roles que son atribuidos en general a los productos secundarios de las plantas: muchos son productos de defensa ante herbvoros y patgenos, otros proveen soporte mecnico a la planta, otros atraen polinizadores o dispersores de frutos, algunos de ellos absorben la radiacin ultravioleta, o actan como agentes alelopticos (por ejemplo reducen el crecimiento de plantas competidoras que estn cerca). (Brunenton, 2001) a) Clasificacin de Compuestos Fenlicos Fenoles simples cidos fenlicos Derivados del cido benzoico Derivados del cido cinmico Fenil propanoides. (Bruneton, 2001) 2.3.1.3 Quinonas

Son compuestos aromticos derivados del benceno o de hidrocarburos de mltiples anillos como naftaleno o antraceno. Clasificacin de Quinonas Benzoquinonas: con una estructura derivada del benceno. Naftoquinonas: con una estructura derivada del naftaleno. Antraquinonas: con una estructura derivada del antraceno. Fenantraquinonas: con una estructura derivada del fenantreno. (Kuklinski, 2003) 2.3.1.4 Flavonoides

Son pigmentos naturales no nitrogenados, universalmente distribuidos en los vegetales, responsables de la coloracin de las flores, frutos y a veces de las hojas.

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Su esqueleto carbonado contiene 15 carbonos ordenados en dos anillos aromticos unidos por un puente de tres carbonos. b) Clasificacin de Flavonoides
Flavonoides mayores Flavonas Flavonoles Flavonoides menores Flavanonas Dihidroflavonoles Biflavonoides Chalconas y auronas. (Brunenton, 2001)

2.3.1.5

Antocianos

Las antocianinas son flavonoides pigmentados responsables de la mayora de los colores de las flores y los frutos. Por ello son importantes en la polinizacin y en la dispersin de semillas. Son glicsidos con un azcar en posicin 3. Cuando las antocianinas carecen de azcar se denominan antocianidinas.

Figura 2.6: Estructura qumica de antocianinas y antocianidinas Por: (Brunenton, 2001)

El color de las antocianinas depende del nmero de grupos hidroxilo y metoxilo en el anillo B y del pH de las vacuolas en las que se almacenan. Algunos ejemplos son pelargonidina (rojo-naranja), cianidina (rojo prpura) y delfinidina (azul prpura).

17

Figura2.7: Pelargonidina, cianidina y delfinidina presentes en los gneros Geranium, Rosa y Delphinium Por: (Brunenton, 2001)

2.3.1.6

Taninos

Los taninos son compuestos fenlicos polimricos que se unen a protenas desnaturalizndolas. El nombre de tanino procede de la antigua prctica de utilizar extractos vegetales para convertir la piel animal en cuero (en el curtido, se unen al colgeno aumentando su resistencia al calor, al agua y a microorganismos). Existen dos categoras: taninos condensados y taninos hidrolizables Los taninos condensados son polmeros de unidades de flavonoides unidas por enlaces C-C, los cuales no pueden ser hidrolizados pero s oxidados por un cido fuerte para rendir antocianidinas. Los taninos hidrolizables son polmeros heterogneos que contienen cidos fenlicos, sobre todo cido glico y azcares simples; son ms pequeos que los condensados y se hidrolizan ms fcilmente.

Figura 2.8: Estructura qumica de los taninos condensados (A) e hidrolizables (B) Por: (Brunenton, 2001)

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2.3.1.7

Saponinas

Son glicsidos naturales, llamadas as por su capacidad para formar espuma con el agua, es decir forman soluciones similares a las jabonosas. (Agapito, 2004) Son poderosos surfactantes, causan hemlisis y son potentes toxinas plasmticas venenosas para los peces. Forman espuma debido a que las saponinas disminuyen la tensin superficial del agua, son tensioactivos naturales. 2.3.1.8 Glucsidos Cardiotnicos

Son sustancias constituidas de una porcin esteroide, una porcin glicosdica y un anillo de lactona, -insaturada o lactona, -saturada, que actan sobre el msculo cardiaco. Son compuestos hetersidos (azcar + aglicn) capaces de modular el funcionamiento del corazn, actan directamente sobre la contractilidad del msculo cardaco (miocardio) y sobre la circulacin aurcula-ventrculo. Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa y desoxiazcares como digitoxosa, cimarosa, etc. 2.3.1.9 Aceites Esenciales

Los aceites esenciales son mezclas de varias sustancias qumicas biosintetizadas por las plantas, que dan el aroma caracterstico a algunas flores, rboles, frutos, hierbas, especias, semillas y a ciertos extractos de origen animal (almizcle, civeta, mbar gris). Se trata de productos qumicos intensamente aromticos, no grasos (por lo que no se enrancian), voltiles por naturaleza (se evaporan rpidamente) y livianos (poco densos). Son insolubles en agua, levemente solubles en vinagre, y solubles en alcohol, grasas, ceras y aceites vegetales. Se oxidan por exposicin al aire. Se han extrado ms de 150 tipos, cada uno con su aroma propio y virtudes curativas nicas. Proceden de plantas tan comunes como el perejil y tan exquisitas como el jazmn. Para que den lo mejor de s, deben proceder de ingredientes naturales brutos y quedar lo ms puro posible.

2.4

FUNDAMENTO CROMATOGRFICO 2.4.1 Cromatografa

La cromatografa es un mtodo muy utilizado y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin general como la cromatografa La cromatografa es difcil definir ya que es aplicado a varios sistemas y tcnicas. Sin embargo todos esos mtodos tienen en comn el uso de una Fase Estacionaria y una Fase Mvil. Los componentes de una mezcla son transportados a travs de la fase estacionaria por el flujo de una

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fase mvil, y las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre los distintos componentes de la mezcla. (Lederer, 2003) 2.4.2 Clasificacin Cromatografa en Capa Fina

2.4.2.1

La fase estacionaria est sostenida sobre una placa plana o en los poros de un papel. Aqu la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad. (Skoog, 2008) 2.4.2.2 Cromatografa en Columna

La fase estacionaria est contenida en un tubo estrecho y fuerza el paso de la fase mvil a travs del tubo, ya sea a presin o gravedad. (Skoog, 2008)

2.5

FUNDAMENTO DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

La Investigacin de cmo la vitamina E prevena el proceso de peroxidacin de lpidos condujo a la identificacin de antioxidantes como agentes reductores que previenen reacciones oxidativas, a menudo depurando especies reactivas del oxgeno antes de que puedan daar las clulas. (Prior RL, 2005) Los posibles mecanismos de accin de los antioxidantes, fueron investigados por primera vez cuando se reconoci que una sustancia con actividad antioxidante probablemente era una que se oxidaba a s misma fcilmente.

2.5.1

Definicin

Un antioxidante es cualquier sustancia que cuando est presente a bajas concentraciones en presencia de un sustrato oxidable, retrasa o previene la oxidacin del mismo. En el organismo, los antioxidantes pueden existir como sistemas antioxidantes que existen en la propia clula, constituyen un grupo complejo y variado de molculas que protegen los sitios biolgicos clave mediante la neutralizacin o estabilizacin de las mismas, contra lesiones oxidativas es as que la salud del organismos depende en gran medida de eficaces sistemas de defensa antioxidante que actan contra el dao producido por radicales libres y otras especies de oxigeno reactivo. Para estudiar esta actividad, que slo se hace evidente a largo plazo, es necesario recurrir a estudios de tipo epidemiolgico. De una forma simplificada, entre los antioxidantes principales y mayoritarios contenidos en los alimentos se encuentran tocoferoles, cido ascrbico, carotenoides (incluyendo la vitamina A), compuestos fenlicos y fitoesteroles.

20

Precisamente por sus reconocidas propiedades antioxidantes, los compuestos fenlicos de frutas y vegetales han surgido como una alternativa al uso de antioxidantes sintticos en la industria alimentaria. 2.5.2 Antioxidantes y las Reacciones de Oxidacin 2.5.2.1 Antioxidantes Primarios Previenen la formacin de nuevos radicales libres, esto lo consiguen convirtiendo los radicales libres existentes en molculas menos perjudiciales antes de que puedan reaccionar o evitando la formacin de radicales libres a partir de otras molculas, por ejemplo: Superxido dismutasa (SOD): convierte O2 en perxido de hidrgeno. Glutatin peroxidasa (GPx): convierte el perxido de hidrgeno y los perxidos lipdicos en molculas inofensivas antes de que formen radicales libres. Protenas de unin a metales (Ferritina, Ceruloplasmina): Limitan la disponibilidad de Fe necesaria para formar el radical OH.

2.5.2.2 Antioxidantes Secundarios Son protectores no enzimticos o captadores deradicales que intervienen cuando hay superproduccin de radicales libres y los sistemas enzimticos estn desbordados, previniendo as las reacciones en cadena. Por ejemplo: Vitamina E (- tocoferol), Vitamina C (ascorbato), caroteno, cido rico, Bilirrubina, Albmina. a) Tocoferoles.-Dan proteccin de membranas lipdicas. Bloqueo de la cadena de reacciones de peroxidacin. Ejemplo: Vitamina E ( tocoferol) Vitamina E y efectos fisiolgicos La vitamina E es el descriptor genrico de dos familias de compuestos, los tocoferoles y los tocotrienoles, todos tienen diferente potencia biolgica pero el -tocoferol es el compuesto natural que revela mayor actividad de vitamina , est ampliamente distribuido en la naturaleza, se cidos grasos

encuentra en aceites vegetales especialmente en los de mayor contenido en

poliinsaturados, como girasol, maz, etc. Asimismo se encuentra en cereales y alimentos de origen vegetal. La vitamina E (-tocoferol) tiene un OH fenlico responsable de la actividad antioxidante. En lo que respecta a sus propiedades fsicas, la vitamina E es insoluble en agua y soluble en grasa y solventes orgnicos. La vitamina E captura radicales libres formado por el ataque oxidativo de los cidos grasos poliinsaturados, antes de que puedan establecer una reaccin en cadena en la membrana. El radical formado a partir de la vitamina E es respectivamente inerte, y extingue la reaccin en cadena. El

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radical de la vitamina E es inactivado y la vitamina activa se vuelve a formar, por reaccin con la vitamina C. La principal funcin fisiolgica de esta vitamina es la de actuar como un poderoso antioxidante es clulas de mamfero y sangre, numerosos estudios, tanto in vitro como in vivo, demuestran que el -tocoferol acta como un potente antioxidante lipoflico y supresor del dao oxidativo en membranas biolgicas, lipoprotenas y tejidos mediante la eliminacin de radicales libres, tales como el oxgeno singlete, radical superoxido, radical hidroxilo y radical peroxilo. Adems se le atribuyen otras propiedades beneficiosas para el organismo, como es la de actuar como un estabilizador de membrana y regulador de fluidez de la misma, modulador de la actividad de varias enzimas de membrana, efecto protector ante la hemolisis, modulador del sistema inmune, etc. Estos efectos pueden ser, mayoritariamente, consecuencia de la poderosa actividad antioxidante presentada por esta vitamina. (Johnson, 2003)

Tabla2.1: Estructura de Tocoferoles

Tocoferoles R
1

Nom -tocoferol -tocoferol -tocoferol -tocoferol

CH3 CH3 H H Nota: (Brunenton, 2001)

CH3 H CH3 H

CH3 CH3 CH3 CH3

b) cido ascrbico. Ayudan a la regeneracin de tocoferoles. Ejemplo: Vitamina C (ascorbato). La vitamina C (cido ascrbico) es probablemente el antioxidante ms importante del medio extracelular, con funciones de cofactor enzimtico. Su funcin antioxidante deriva de su capacidad de actuar como donante de electrones Vitamina C y efectos fisiolgicos El termino vitamina C es utilizada para englobar todos los compuestos con la actividad bilgica del cido L-ascrbico (cido 2,3-enediol, L-gulnico). Puede ser sintetizada por algunos animales a partir de glucosa, sin embargo, en humanos y otras especies, esta sntesis no puede ser realizada, por lo que deben adquirirla a travs de la alimentacin, frutas, verduras y hortalizas constituyen la mayor fuente de vitamina C en la dieta siendo esta la razn por la que en estas especies dicho compuesto adquiere el carcter de vitamina. Se encuentra principalmente en alimentos de origen vegetal y puede presentarse en dos formas qumicas interconvertibles: cido ascrbico (forma reducida) y cido dehidroscorbico (forma oxida), siendo ambas formas funcionales biolgicamente y mantenindose en equilibrio fisiolgico.

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Figura 2.9: Oxidacin del cido ascrbico a cido dehidroascrbico Por: (Brunenton, 2001) El cido ascrbico muestra la capacidad de poder sufrir consecutivamente dos procesos oxidativos monovalentes, con la formacin del radical semidehidroascorbato (Asc) como intermediario, siendo este un radical relativamente estable. Estas caractersticas hacen de esta vitamina un excelente antioxidante hidrosoluble donador, siendo para algunos autores el antioxidante plasmtico ms eficaz, al ser el primero ms consumido, constituyendo por lo tanto la reaccin inicial de defensa. Esta molcula es capaz de interaccionar directamente con anin superxido, radical hidroxilo, oxigeno singlete, radicales centrados en el nitrgeno y en el sulfuro y radicales lipdicos, siendo otro mecanismo antioxidante de gran importancia la regeneracin de -tocoferol. Esta interaccin es posible gracias a la disposicin del grupo fenol activo del tocoferol en la zona polar de las membranas biolgicas. (Tapia, 2004) c) Carotenoides Bloquean la cadena de reacciones de peroxidacin. Ej.caroteno. La principal funcin biolgica de los carotenoides es la de servir como pigmentos accesorios en la recoleccin de la luz durante el proceso fotosinttico, y como sustancias fotoprotectoras, inhibiendo la propagacin de especies reactivas de oxgeno y otros radicales libres, por tanto impidiendo la accin nociva de stos a nivel celular. (Yufera, 1995) Adems de la contribucin de los carotenoides al color atractivo de las frutas y verduras, destaca, por su importancia a nivel fisiolgico y diettico, la propiedad de algunos de ellos de tener actividad como provitamina A (Isler, 1971. y Simpson, 1983). La vitamina A es esencial para la visin nocturna y para mantener sanos la piel y los tejidos superficiales. La actividad antioxidante de estos pigmentos depende de su estructura qumica (tamao, nmero de sustituyentes, configuracin cis o trans, etc.), su concentracin, la presin parcial de oxgeno o su interaccin con otros antioxidantes, sobre todo las vitaminas C y E . En un principio, se llevaron a cabo estudios basndose principalmente en el -caroteno; el mecanismo de la actividad antioxidante de este compuesto est relacionado con su carcter hidrofbico y con su capacidad para "retirar" el oxgeno y desactivar radicales libres. Se ha sugerido asimismo que el -caroteno

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puede pasar de ser antioxidante a pro-oxidante en funcin de la concentracin y la presin de oxgeno, entre otros factores. Existen estudios in vitro que apuntan que la actividad antioxidante de este compuesto es mayor que la -tocoferol. Tambin se ha demostrado que otros carotenoides, como la astaxantina, lutena, zeaxantina, cantaxantina y licopeno son buenos antioxidantes. (Jeremy M. Berg, 2008) 2.5.2.3 Antioxidantes Terciarios Reparan las biomolculas daadas por los radicales libres. Incluyen enzimas reparadoras de ADN y la metionina sulfxido reductasa.

2.5.3 Especies Reactivas del Oxigeno (RO) y Radicales Libres El trmino especies reactivas del oxgeno (ROS) es un trmino colectivo que incluye radicales libres y ciertas especies no radicales que son oxidantes y/o se convierten fcilmente en radicales libres, como por ejemplo: HClO, HBrO, O3, ONOO,O2 o H2O2 .35 Tabla2.2: Resume las principales especies reactivas del Oxgeno

Nota: Los radicales libres (RL) son tomos o grupos de tomos que tienen uno o ms electrones desapareados lo cual los hace altamente inestables y reactivos. Por: (Yufera, 1995)

Estos radicales recorren nuestro organismo intentando robar un electrn de las molculas estables, con el fin de alcanzar su estabilidad electroqumica mediante reacciones de xidoreduccin.

24

Una vez que el RL ha conseguido robar el electrn que necesita para aparear su electrn libre, la molcula estable que se lo cede se convierte a su vez en un nuevo RL, por quedar con un electrn desapareado, inicindose as una verdadera reaccin en cadena que destruye nuestras clulas.

La vida biolgica media del RL es de microsegundos; pero tiene la capacidad de reaccionar con todo lo que est a su alrededor provocando un gran dao a las molculas y a las membranas celulares. (Youngson, 2003)

Ante la presencia de radicales libres, el organismo debe neutralizarlos y defenderse, para as evitar la lesin de los tejidos. El problema propiamente dicho, aparece cuando la concentracin de estos radicales libres es muy elevada, ya que cuando los mismos se encuentran presentes en el organismo en cantidades adecuadas aportan algunos beneficios, como ser: la lucha contra bacterias y virus, regulacin de la estructura y funcin de las protenas, control del tono muscular, etc. (Youngson, 2003) Las consecuencias del exceso de radicales libres en el organismo, afectan directamente nuestro estado de salud favoreciendo el envejecimiento prematuro y problemas en el sistema cardiovascular y nerviosos, entre otros. Existen dos tipos de fuentes de radicales libres

Internos Ejercicio muy intenso Estrs Algunos procesos metablicos Ciertos medicamentos Contaminacin Exceso de exposicin solar (Youngson, 2003)

Externos Mala alimentacin Consumo de tabaco Consumo de alcohol

2.5.4 Antioxidantes Vegetales El estudio cientfico de las plantas medicinales ha contribuido en gran medida a un mejor conocimiento de las propiedades qumicas, fsicas y biolgicas que stas poseen, permitiendo determinar las concentraciones adecuadas o los componentes directamente responsables de la funcionalidad evidenciada en medicina, en la industria farmacutica o alimentaria. (Valderrama, 2009) Los compuestos antioxidantes en los vegetales segn su naturaleza de solubilizacin se han dividido en Hidroflicos (compuestos fenlicos y vitamina C) y lipoflicos (carotenoides y vitamina E).

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La capacidad antioxidante de los compuestos fenlicos se debe principalmente a sus propiedades rdox, las cuales les permiten actuar como agentes reductores, donadores de hidrgeno y electrn ese inhibidores de oxgeno individual, mientras que la accin antioxidante de la vitamina C se debe a que posee dos electrones libres que pueden ser captados por los ROS los mismos que carecen de un electrn en su estructura molecular. Los carotenoides son desactivadores de molculas sensibilizadoras excitadas electrnicamente, las cuales estn involucradas en la generacin de radicales y oxigeno individual; y la actividad antioxidante de la vitamina E se caracteriza por la donacin de hidrgeno Los mecanismos de accin por lo cules se ha incrementado el uso de los vegetales se deben a que contribuyen con un amplio espectro de propiedades a la prevencin de ciertas enfermedades, un ejemplo de esto son los polifenoles; adems, disminuyen la incidencia de enfermedades como el cncer, arterioesclerosis, etc. Los resultados de innumerables estudios epidemiolgicos de los que se infiere el valor protector de ciertas plantas, el redescubrimiento de prcticas ancestrales en varias regiones del mundo, y la fascinacin que eso produce en quienes quieren vivir ms y mejor nos est impulsando a retomar la medicina tradicional.

2.6 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Existen diversos mtodos para evaluar la actividad antioxidante, ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias ms aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromgenas de naturaleza radical; la perdida de color ocurre de forma proporcional con la concentracin. Alternativamente, diversos compuestos cromgenos ABTS (acido 2,2-azino bis(3ettibenzotiazolin)-6-sulfonico), DPPH (2,2- Difenil-1-picrilhidrazilo), DMPD (dicloridrato de N,N- Dimetil-p-fenilendiamina),y FRAP ( Ferric Reducing Antioxidant Power), son utilizados para determinar la capacidad de los compuestos fenlicos que contienen los frutos para captar los radicales libres generados, operando as en contra de los efectos perjudiciales de los procesos de oxidacin, que implican a especies reactivas de oxgeno. Los mtodos ms aplicados son ABTS y DPPH, ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones, aunque muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una preparacin previa mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reaccin que pueda ser qumica, enzimtica o tambin electroqumica. Con el ABTS se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofilica y lipofilica, mientras que el DPPH solo puede disolverse en medio orgnico, y el DMPD solo en medio acuoso.

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El radical ABTS, tiene adems la ventaja que su espectro presenta mximos de absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohlico, mientras que el DPPH presenta un pico de absorbancia a 515 nm, y el DMPD a 505 nm. (Mora, 2006)

2.6.1 Capacidad Atrapadora del Radical DPPH Brand-Williams et al., (1995) evaluaron la actividad de compuestos especficos o extractos usando el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) en una solucin metanlica. La reduccin del DPPH se monitorea por la disminucin en la absorbencia a una longitud de onda caracterstica. En su forma de radical libre, el DPPH absorbe a 517 nm y cuando sufre reduccin por un antioxidante, esta absorcin desaparece. En consecuencia, la desaparicin del DPPH proporciona un ndice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuacin:

DPPH + (AH)n

DPPH H + (A)n

Figura 2.10: Mtodo del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Donde AH es un antioxidante que acta como antirradical donando tomos de hidrgeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares estables que detendrn la reaccin en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A) puede interactuar con otro radical para formar molculas estables (DPPH-A, A-A). La reaccin entre el DPPH y un compuesto depende de la conformacin estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas no siempre son apropiadas. (Vuarant, 2006)

2.6.2 Ensayo de Decoloracin del Catin Radical ABTS (Mtodo del cido 2,2- azinobis-(3-etilbenzotioazolino-6-sulfonico)) Se utiliza el mtodo espectrofotomtrico del ABTS (mtodo de cido 2,2 azinobis-(3-

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etibenzotioazolino-6-sulfinico)), (C_18 H_24 N_6 O_6 S_4) o TEAC (Capacidad Antioxidante equivalente de Trolox), para determinar la capacidad antioxidante de la muestra. Actualmente el mtodo ABTS ha sido ampliamente usado tanto para materiales biolgicos, compuestos puros o extractos de plantas de naturaleza hidrfila o lipoflica. El compuesto cromgeno ABTS presenta color verde azulado con mximo de absorcin a 342nm, es muy soluble en agua y qumicamente estable. El radical ABST^+ una vez generado por medio de enzimas (peroxidasa, mioglobina) o qumicamente (dixido de manganeso, per sulfato potsico, presenta nuevas caractersticas con mximos de absorcin a 414,645, 754 y 815 nm. Generar el radical ABST+ qumicamente con per sulfato potsico desarrollado por RE et al., es el mtodo ms usado, fue validado por su estabilidad y por ser una alternativa mucho ms viable econmicamente. Por presentar absorcin mxima prxima a la regin infrarroja (754nm) reduce las posibilidades de interferencias de compuestos coloreados que absorben en la regin del visible o compuestos resultantes de reaccin secundaria. El mtodo ABTS est basado en la captacin del radical catin ABST^+ por loa antioxidantes generados en medio de reaccin. El ABST^+tiene un color verde azulado, y a medida que disminuye la concentracin de este la solucin pierde su color. La inhibicin del color es proporcional a la capacidad antioxidante de la muestra. Como patrn se emplea Trolox, acido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametillcroman-2-carboxilo(C_14 H_18 O_4), un anlogo sinttico hidrosoluble de vitamina E. Debido a las dificultades en la medicin de los componentes individuales de antioxidantes de una mezcla compleja, la equivalencia Trolox se utiliza como referencia para la capacidad antioxidante de esta mezcla. Se mide el porcentaje de inhibicin del color y, a partir de la recta de calibrado se calcula la capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox, un polifenol. Para el desarrollo del mtodo se suelen emplear dos estrategias; inhibicin y decoloracin. En la primera los antioxidantes se aaden previamente a la generacin del radical ABST^+ y lo que se determina es la inhibicin de la formacin del radical que se traduce en un retraso en la aparicin de la coloracin verde azulada. En la segunda estrategia, los antioxidantes se aaden una vez que el ABST^+ se ha formado y se determina entonces la disminucin de la absorbancia debida a la reduccin del radical es decir la decoloracin de este. (Youngson, 2003)

2.6.3 Determinacin del Poder Reductor/Antioxidante Frrico (FRAP). El anlisis de FRAP fue introducido por Benzie y Strain (Benzie y Strain, 1996; Pulido-Bravo y Saura-Calixto, 2000) para medir la actividad antioxidante total y se basa en la capacidad de los polifenoles para reducir Fe3+ a Fe2+. Este mtodo fue modificado recientemente para su uso en

28

microplacas de 96-pozos (Tsao y Deng, 2004), dando una reproducibilidad mejor y un rendimiento de procesamiento ms alto de muestras. El anlisis se basa en el poder reductor de un antioxidante que reduce el ion frrico (Fe3+) al ion ferroso (Fe2+); formando un complejo azul. Una absorcin alta a una longitud de onda de 700 nm indica un poder de reduccin alto del fitoqumico, es decir una actividad antioxidante alta (Roginsky y Lissi, 2005). El valor de FRAP se ha usado para determinar la actividad antioxidante de vinos rojos (Arnous et al., 2001). El trabajo de Schleisier et al., (2002) fue diseado para determinar la actividad antioxidante en jugos y extractos de t en equivalentes de Fe2+. El ndice inicial absoluto de la reduccin de la ferrilmetilmioglobina determinado por espectroscopia en la regin visible fue sugerido para caracterizar la actividad antioxidante de flavonoides individuales (Silva et al., 2002). (Cordoval, 2008)

29

CAPTULO III METODOLOGA

3.1.

TIPO DE INVESTIGACIN

La investigacin es de tipo experimental debido a que se realiza la identificacin, extraccin y determinacin de la actividad antioxidante de los extractos de: Opuntia soederstromiana , Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa 3.2. POBLACIN Y MUESTRA 3.2.1 Poblacin Poblacin vegetal constituida por todas las plantas con actividad antioxidante existentes en el Ecuador. . 3.2.2 Muestra Esta constituidas por cuatro plantas nativas del Ecuador las mismas que se detallan a continuacin: Opuntia soederstromiana (Tuna), Dononea viscosa (Chamana), colectas en la Provincia de Pichincha el Bosque Protector Jerusaln, y en la Provincia de Napo, Cantn Tena, las plantas Bactris gasipaes (Chonta) y Mauritia flexuosa (Morete). 3.3. DISEO EXPERIMENTAL

La investigacin fue dividida en dos etapas:

Etapa I: El inicio de la investigacin, se realiz la recoleccin del material vegetal, cada planta fue sometida a procesos de: secado y molienda, posteriormente se realiza la obtencin de los extractos etanlicos totales, en estos extractos se realiz la investigacin Fitoqumica, en la cual se determinan los posibles metabolitos secundarios.

Etapa II: Investigacin la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohlicos de: Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes (Chonta) y Mauritia flexuosa (Morete). Se determina la actividad antioxidante de los extractos hidroacohlicos de cada planta a cuatro concentraciones de:200ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL, 50ug/mL , usando el mtodo de Capacidad Atrapadora del Radical o del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), mediante una reaccin de

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Oxido-reduccin, donde se produce un cambio cualitativo, el cual consiste en un cambio de color del radical (DPPH), de violeta a amarillo, la misma que, se evidencia cuantitativamente mediante la disminucin de la absorbencia a una longitud de onda caracterstica de 517 nm.

3.3.1 Diseo Estadstico El tipo de diseo de bloques es completamente al azar con muestreo (DBCA), con su respectivo anlisis de varianza (ADEVA). Caractersticas del experimento: 4 tratamientos de muestras de planta variando la concentracin de extracto. 4 repeticiones de cada tratamiento

3.3.1.1Caractersticas de los tratamientos Tabla3.3: Caractersticas de los tratamientos Tratamiento T1 T2 T3 T4 Tipo de Extracto Extracto 50 ug/ml Extracto 100 ug/ml Extracto 150 ug/ml Extracto 200 ug/ml

3.3.2 Variables: Independientes: Extractos hidroalcoholico de plantas Concentracin de: Opuntia soederstromiana (Tuna), Dononea viscosa(Chamana), Bactris gasipaes(Chonta), Mauritia flexuosa(Morete). Dependientes: - Actividad Antioxidante

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3.3.3 Recoleccin de datos para el diseo es completamente al azar con muestreo (DBCA) Tabla3.4: Combinaciones entre variables BLOQUES Extracto hidroalcohlico

TRATAMIENTOS

Referencia

REPETICIONES REPETICIONES 1 T1 (200 ug/mL) T2(150 ug/mL) T3 (100 ug/mL) T4(50 ug/mL) 2 3 4 1 2 3 4

3.3.4 Cuadro de anlisis de varianza (ADEVA) para el clculo del diseo de bloques completamente al azar.

Tabla3.5: Ecuaciones para el diseo experimental ORIGEN DE LAS VARIACIONES TRATAMIENTOS BLOQUES FILAS COLUMNAS ERROR TOTAL FC SUMA DE LOS CUADRADOS (X2i/t)- FC (X2J/b)- FC Dif.(total- T-B) (X2ij)- FC (X)2/T*B (T-1) (B-1) (T-1)(B-1) (T*B)-1 GRADOS DE LIBERTAD PROMEDIO DE LOS CUADRADOS SCT/GLT SCB/GLB SCE/GLE

Hiprtesis: H0: No hay diferencia significativa en el porcentaje de inhibicin de radical libre entre cada uno de los extractos de plantas: Opuntia soederstromiana,, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa y la Vitamina C.

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H1: S hay diferencia significativa en el porcentaje de inhibicin de radical libre entre cada uno de los extractos de plantas: Opuntia soederstromiana,, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa y la Vitamina C. 3.3.5 Prueba F A diferencia de otras pruebas de medias que se basan en la diferencia existente entre dos valores, el anlisis de varianza emplea la razn de las estimaciones, dividiendo la estimacin intermediante entre la estimacin interna

El valor estadstico de prueba resultante se debe comparar con un valor tabular de F, que indicar el valor mximo del valor estadstico de prueba que ocurra si H0 fuera verdadera, a un nivel de significacin seleccionado. Antes de proceder a efectuar este clculo, se debe considerar las caractersticas de la distribucin F. Caractersticas de la distribucin F

Existe una distribucin F diferente para cada combinacin de tamao de muestra y nmero de muestras. Por tanto, existe una distribucin F que se aplica cuando se toman cinco muestras de seis observaciones cada una, al igual que una distribucin F diferente para cinco muestras de siete observaciones cada una. A propsito de esto, el nmero distribuciones de muestreo diferentes es tan grande que sera poco prctico hacer una extensa tabulacin de distribuciones. Por tanto, como se hizo en el caso de la distribucin t, solamente se tabulan los valores que ms comnmente se utilizan. En el caso de la distribucin F, los valores crticos para los niveles 0,05 y 0,01 generalmente se proporcionan para determinadas combinaciones de tamaos de muestra y nmero de muestras. La razn ms pequea es 0. La razn no puede ser negativa, ya que ambos trminos de la razn F estn elevados al cuadrado.

Por otra parte, grandes diferencias entre los valores medios de la muestra, acompaadas de pequeas variancias muestrales pueden dar como resultado valores extremadamente grandes de la razn F.

33

La forma de cada distribucin de muestreo terico F depende del nmero de grados de libertad que estn asociados a ella. Tanto el numerador como el denominador tienen grados de libertad relacionados. Determinacin de los grados de libertad Los grados de libertad para el numerador y el denominador de la razn F se basan en los clculos necesarios para derivar cada estimacin de la variancia de la poblacin. La estimacin intermediante de variancia (numerador) comprende la divisin de la suma de las diferencias elevadas al cuadrado entre el nmero de medias (muestras) menos uno, o bien, k - 1. As, k - 1 es el nmero de grados de libertad para el numerador.

En forma semejante, el calcular cada variancia muestral, la suma de las diferencias elevadas al cuadrado entre el valor medio de la muestra y cada valor de la misma se divide entre el nmero de observaciones de la muestra menos uno, o bien, n - 1. Por tanto, el promedio de las variancias muestrales se determina dividiendo la suma de las variancias de la muestra entre el nmero de muestras, o k. Los grados de libertad para el denominador son entonces, k(n -l).

Para calcular F se debe seguir el siguiente procedimiento:

Determinar la varianza de cada muestra, utilizando la formula

Obtener la estimacin interna de varianza (varianza promedio de la muestra), mediante la formula

Calcular la varianza de las medias muestrales, utilizando la formula

Multiplicar la varianza de la medias muetreales por n

Razn F

(Ibujes, 2012)

34

3.3.6 Prueba t comparacin de la media de dos muestras Cuando las desviaciones estndar no son significativamente diferentes.

Ecuacin 1: Valor de t y los grados de libertad son: ( n1+ n2 2) Ecuacin 2: Valor de grados de libertad 3.3.7 Prueba de Correlacin

% INHIBICIN DE RADICAL LIBRE - CONCENTRACION DE EXTRACTO

% INHIBICIN DE RADICAL LIBRE 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 CONCENTRACIONES DE EXTRATO

Figura3. 11: % Inhibicin de Radical Libre - Concentracin de Extracto

3.4.

TCNICAS E INSTRUMENTOS ANALTICOS Primera Fase 3.4.1.1 Obtencin del extracto etanlico de: Opuntia soederstromiana,, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa. 3.4.1.2 Recoleccin: Materiales usados: tijeras de podar, machete, guantes, costales de yute, papel peridico, libreta de anotaciones, lpiz y prensa. 3.4.1.3 Secado: Materiales usados: estufa, papel empaque, bandejas, fundas de papel.

35

3.4.2 3.4.2.1

Investigacin Fitoqumica Obtencin de los extractos a) MACERACIN

Materiales Planta seca y molida Frasco de vidrio mbar con boca ancha y tapa hermtica.

Reactivos Alcohol de 70GL

Procedimiento Pesar 50 g de: Opuntia soederstromiana, Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes (Chonta) y Mauritia flexuosa(Morete). seca y molida. Depositar en diferentes frascos de vidrio y aadir el alcohol de 70 GL, hasta cubrir sobre las partes de la planta. Dejar en contacto la planta con cada disolvente por 48 horas. Realizar agitacin permanente. Filtrar al vaco Reflujar por 1 hora Concentrar en el rotavapor a la mitad de su volumen en presin reducida y temperatura controlada(A). Guardar el concentrado en un frasco de vidrio mbar. De esta forma se obtiene el extracto etanlico total para la investigacin fitoqumica.

3.4.2.2 Marcha Fitoqumica a) Investigacin de alcaloides Extraccin:

Tomar la cantidad de A correspondiente a 15 gramos de planta. Aadir HCl 5% y llevar a pH cido. Adicionar luego NaOH al 20% y llevar a pH bsico. Transferir el extracto alcalinizado a un embudo de separacin y extraer con di cloro
metano.

Separar la fase orgnica Concentrar hasta eliminar el solvente (B). Separando una porcin para cromatografa. El residuo se acidifica con HCl 5% y se realiza las pruebas de identificacin de alcaloides.

36

Tabla3.6: Identificacin de Alcaloides Nombre de la reaccin Draggendorff Mayer Wagner Color de Precipitado Precipitado rojo ladrillo Precipitado blanco Precipitado caf
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

b) Identificacin de esteroles, flavonoides, antraquinonas, taninos y saponinas: Esteroles Tomar una cantidad de A equivalente a 9 gramos de planta y colocar en un embudo de separacin. Adicionar una cantidad igual de ter de petrleo y separar el extracto etreo (C), guardar una porcin para cromatografa. La fraccin acuosa se har la extraccin de flavonoides, taninos, saponinas y antraquinonas (D), guardar una porcin para cromatografa.

Tabla 3.7: Identificacin de Esteroles Nombre de la reaccin Reaccin de Zack Procedimiento 1 ml de C + gotas de cido actico + gotas cido sulfrico conc + gotas de FeCl3 20% Reaccin de Lieberman 1 ml de C + gotas de anhdrido actico + gotas cido sulfrico conc. Formacin de un anillo de color azul en el punto de contacto Coloracin de la reaccin Color verde

Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Flavonoides Tomar una alcuota de D

37

Tabla 3.8: Identificacin de Flavonoides Nombre de la reaccin Procedimiento Coloracin de la reaccin Reaccin de Shidona Adicionar HCl conc y limaduras de magnesio Reaccin de Cianidina Adicionar alcohol con HCl y limaduras de magnesio. Reaccin en medio alcalino Gotas de KOH en etanol al 5% Coloracin amarillo naranja y al aadir gotas de FeCl3 al2% da coloracin verdosa
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Espuma abundante y/o coloracin roja intensa Coloracin roja o rosa

Antocianos Tomar una alcuota de D. Tabla 3.9: Identificacin de Antocianos Nombre de la reaccin Gotas de HCl Gotas de HCl conc agitar y dejar en reposo Coloracin roja y al adicionar amonaco cambia a azul Procedimiento Coloracin de la reaccin

Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Antraquinonas Tomar una alcuota de D. Tabla3.10: Identificacin de Antraquinonas Nombre de la reaccin Reaccin de Bomtrager Adicionar 5 ml de cido sulfrico 1N, llevar a ebullicin por 10 minutos, separar por filtracin y adicionar igual cantidad de benceno sobre el filtrado, agitar y dejar en reposo, separar la fase orgnica y adicionar 1 ml de hidrxido de amonio.
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Procedimiento

Coloracin de la reaccin Coloracin rosa en la capa acuosa

38

Taninos Tomar una alcuota de D Tabla 3.11: Identificacin de Taninos Nombre de la reaccin Cloruro frrico 5% Gotas de FeCl3 Adicionar gelatina salada
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Procedimiento

Coloracin de la reaccin

Azul si son hidrolizables y verde si no es hidrolizable

Gelatina salada

Precipitado blanco floculento

Saponinas Tomar una alcuota de D. Tabla3.12: Identificacin de Saponinas Nombre de la reaccin Con agua Adicionar agua y agitar Observar la presencia de espuma permanente por un minuto
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Procedimiento

Coloracin de la reaccin

c) Identificacin de cardiotnicos: Extraccin: Tomar una alcuota de A correspondiente a 9 gramos de planta y precipitar con una solucin de acetato de plomo 25%, filtrar y el filtrado extraer con cloroformo, el extracto clorofrmico tratarlo con sulfato de sodio anhidro, filtrar, este es el extracto (E), guardar una parte para cromatografa. Cardiotnicos Tabla 3.13: Identificacin de Cardiotnicos Nombre de la reaccin Procedimiento Coloracin de la reaccin Reaccin de Baljet Aadir gotas de Baljet + gotas de KOH al 10% en etanol. Reaccin de Kedde Aadir gotas de reactivo de Kedde + gotas de KOH al 10% en etanol
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

Color rojo naranja estable

Color rojo prpura estable

39

3.4.2.3 Cromatografa en Capa Fina Procedimiento: Usando un tubo capilar se procede a sembrar la muestra Se coloca la lmina de material en un recipiente de vidrio. La parte inferior de la placa es colocada en una reserva del solvente, el solvente se mueve hacia arriba de la placa por accin capilar. Cuando el frente del solvente llega al otro extremo de la placa esta es retirada de la reserva de solvente. Los puntos separados son visualizados con luz ultravioleta. Tabla3.14: Fase Mvil y Reveladores PRINCIPIO ACTIVO Alcaloides FASE MVIL Cloroformo-metanol (19:1) Esteroles ter de petrleo-acetona (80:20) Flavonoides Butanol-cido acticoagua (75:24:1) Antraquinonas Benceno-acetato de etilocido actico (60:40) Glucsidos cardiotnicos Acetato de etilodiclorometano (5:5)
Nota: Chiriboga, Ximena;(2012), Marcha Fitoqumica, Materia: Productos Naturales

REVELADOR Reactivo de Dragendorff Anhdrido actico+H2SO4+etanol UV fluorescencia

KOH 10%

Reactivo de Kedde

3.4.3 3.4.3.1

Investigacin Farmacolgica Obtencin de los Extractos Hidroalcohlicos

a) MACERACIN Materiales Plantas secas y molidas Frascos de vidrio mbar con boca ancha y tapa hermtica.

Reactivos Etanol Procedimiento Pesar 100 g de cada planta, Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes(Chonta) y Mauritia flexuosa(Morete), secas y molidas. Depositar en los frascos de vidrio y aadir cada disolvente hasta cubrir sobre las partes de la plantas. Dejar en contacto las plantas con etanol, realizar agitacin permanente.

40

 Las soluciones se concentraran hasta la total eliminacin del solvente, utilizando un Rotavapor. Los extractos secos, fueron estandarizados teniendo en cuenta el porcentaje de slidos totales p/v, utilizando para ello una balanza analtica. Determinacin de la Actividad antioxidante por el mtodo DPPH. Procedimiento 1. Preparar 100 ml de una solucin de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) en metanol a una concentracin de 20 mg/L. 2. Preparar una solucin metanlica de los extractos de planta en una concentracin de 200 ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL y de 50 ug/mL 3. El Blanco preparar con: metanol agua 2:1 para ajustar el espectrofotmetro a cero. 4. Preparar la muestra con 0.75 mL de cada extracto de planta con 1.5 mL de 2,2-difenil-1picril hidrazilo (DPPH), dejar por espectrofotmetro. 5. Realizar cuatro repeticiones para cada concentracin de extracto. 6. Preparar concentraciones de: 50, 100, 150 y 200 ug/mL, de, vitamina E. la cual va hacer utilizado como patrn de control, el mismo que se preparar de igual forma que las muestras 7. Medir la absorbancia del patrn de referencia y del blanco de la muestra. 9. Posteriormente, con los valores de las absorbancias obtenidas determinar el % de captacin de radicales libres 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) mediante la siguiente frmula: 30 min al ambiente. Leer a 517 nm en el

Ecuacin 3: % Inhibicin del Radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) % Inhibicin de Radical Libre Dnde: Ar= Absorbancia del patrn de referencia Abr= Absorbancia blanco del patrn de referencia Am= Absorbancia de la muestra Abm= Absorbancia del blanco de muestra (Brand-WilliamsW., 1995) Otro de modelo matemtico que sigue este ensayo es la siguiente ecuacin:

)
Ecuacin 4: % Decoloracin o Inhibicin del radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)

41

Dnde: Am= Absorbancia de la muestra Am= Absorbancia del blanco de muestra Abm= Absorbancia del reactivo (2,2-difenil-1-picril hidrazilo) DPPH Nota: Para el desarrollo de los clculos de esta investigacin se aplicara la segunda ecuacin puesto que es factible.

42

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Preparar 100 ml de una solucin de DPPH en metanol a una concentracin de 20 mg/L.

El Blanco preparar con: metanol agua 2:1 para ajustar el espectrofotmetro a cero

Preparar una solucin metanlica de los extractos de planta a una concentracin de 200 ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL y de 50 ug/mL

Preparar concentraciones de: 50, 100, 150 y 200 ug/mL, de, vitamina C. la cual va hacer utilizado como patrn de control, el mismo que se preparar de igual forma que las muestras

Medir la absorbancia del patrn de referencia y del blanco de la muestra.

Posteriormente, con los valores de las absorbancias obtenidas determinar el % de captacin de radicales libres (DPPH)

Preparar la muestra con 0.75 mL de cada extracto de planta con 1.5 mL de DPPH, dejar por 30 min al ambiente. Leer a 517 nm en el espectrofotmetro.

Realizar cuatro repeticiones para cada concentracin de extracto.

Figura 3.12: Diagrama de Actividad Antioxidante

43

CAPTULO IV

ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

4.1.

PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN

Etapa I: El inicio de la investigacin, se realiz la recoleccin del material vegetal, cada planta fue sometida a procesos de: secado y molienda, posteriormente se realiza la obtencin de los extractos etanlicos totales, en estos extractos se realiz la investigacin Fitoqumica, en la cual se determinan los posibles metabolitos secundarios.

Etapa II: Investigacin la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohlicos de: Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes (Chonta) y Mauritia flexuosa (Morete). Se determina la actividad antioxidante de los extractos hidroacohlicos de cada planta a cuatro concentraciones de:200ug/mL, 150ug/mL, 100ug/mL, 50ug/mL , usando el mtodo de Capacidad Atrapadora del Radical o del 2, 2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), mediante una reaccin de Oxidoreduccin, donde se produce un cambio cualitativo, el cual consiste en un cambio de color del radical (DPPH), de violeta a amarillo, la misma que, se evidencia cuantitativamente mediante la disminucin de la absorbencia a una longitud de onda caracterstica de 517 nm.

4.2. ETAPA I Obtencin del extracto hidroalcohlico para actividad farmacolgica y extracto total para investigacin fitoqumica, de Opuntia soederstromiana,, Dononea viscosa, Bactris gasipaes y Mauritia flexuosa. 4.2.1 Recoleccin: a) Nombre de las colectoras Mayra Paredes Yolanda Cargua

b) Lugar y fecha de recoleccin Pas: Ecuador Provincia: Pichincha y Napo

44

 Cantn: Quito y Tena Parroquia: Guayllabamba y Comunidad de Agua Santa Coordenadas geogrficas: Tena: Latitud: 010400S; Longitud: 773100W; altitud 340 m.s.n.m. Parque Jerusaln son: Latitud:-00'52"N; Longitud: 7822'15"W y su altitud entre los 2 000 y 2 500 metros sobre el nivel del mar Fecha: 26 de Mayo del 2012 Fecha: 19 de Mayo del 2012 4.2.2 Identificacin Taxonmica a) Familia: CACTACEAE c) d) Nombre cientfico: Opuntia soederstromiana Nombre comn: Tuna roja

b) Familia: SAPINDACEAE e) f) Nombre cientfico: Dodonaea viscosa Nombre comn: Chamana

c) Familia: ARECACEAE g) h) Nombre cientfico: Bactris gasipaes Nombre comn: Palma de Chonta

d) Familia: ARECACEAE i) j) Nombre cientfico: Mauritia flexuosa L.f.

Nombre comn: Morete

4.2.3Secado del Material Vegetal Para la investigacin se utiliz las hojas deOpuntia soederstromiana (Tuna roja) Dononea viscosa (Chamana), Bactris gasipaes (Palma de chonta) y Mauritia flexuosa (Morete). Mtodo: secado a la sombra Temperatura: ambiente Duracin: 20 das

El material vegetal fue

seco durante 20 das a la sombra, sobre papel peridico cambiado

45

peridicamente, evitando el contacto directo de los rayos de sol. Una vez seco se moli en molino manual se tamizo y se conserv en fundas de papel identificado y pesado. 4.2.4Investigacin Fitoqumica 4.2.4.1 Obtencin del extracto etanlico total A. Tuna roja Nombre cientfico: Opuntia soederstromiana Peso de planta seca y molida: 50 g Volumen de etanol (macerado):200 ml Tiempo de maceracin: 24 horas Volumen concentrado: 100 ml Tiempo de reflujo: 1 hora

Para la obtencin del extracto etanlico total se utiliz 50 g de planta seca y molida en un frasco de boca ancha de color mbar con 200 ml de alcohol de 70GL, el tiempo de maceracin fue de 24 horas, se filtra y se concentra a la mitad del volumen, al residuo se le coloca en el boln y se lo lleva a reflujo por una hora con la cantidad de alcohol adecuada para cubrir el material vegetal, luego se procede a filtrar y a concentrar hasta la tercera parte, se une al extracto anterior obtenido, medir el volumen obtenido y este extracto se denomina extracto total (A). Marcha Fitoqumica Significado de la interpretacin: ++++ muy abundante +++ ++ + +/(-) abundante moderado medianamente escaso escaso nada

46

a) Investigacin de Alcaloides Tabla4.15: Resultados de la Identificacin de Alcaloides Reaccin Mayer Resultados Observaciones No hay formacin de precipitado de color blanco amarillento. Wagner No hay formacin precipitado amarillo plido. Draggendorff No hay formacin precipitado anaranjado.

Se determina que no existe

presencia de alcaloides en la planta, porque no hay formacin de

precipitados en las diferentes reacciones realizadas. b) Investigacin de Esteroles Tabla4.16: Resultados de la Identificacin de Esteroles Reaccin Reaccin de Lieberman Reaccin de Zack Resultados ++++ +++ Observaciones Formacin de anillo azul Formacin de un anillo verde oscuro ms o menos abundante

Se determina la presencia de esteroles por la formacin de un anillo de color azul en la reaccin de Lieberman y un anillo de color verde en la reaccin de Zack, resultado que se comprueba mediante cromatografa en capa fina, los esteroles al revelar la placa se presentan como una mancha de color morado. c) Investigacin de Flavonoides
Tabla4.17: Resultados de la Identificacin de Flavonoides

Reaccin Reaccin de Shidona

Resultados ++++

Observaciones Presencia de espuma abundante y coloracin roja

Reaccin de Cianidina Reaccin en medio alcalino

+++ +++

Coloracin roja Coloracin naranja en pequea cantidad, que luego cambia a verde

47

Se determina la presencia de flavonoides por la formacin de espuma y/o el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Shidona, por el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Cianida al adicionar limaduras de magnesio, y por la formacin de una coloracin naranja que cambia a verde al aadir FeCl3. Resultado que se comprueba con la cromatografa en capa fina, al revelar la placa se observa una mancha de color amarillo, en luz UV y visible que se intensifica o cambia de color al someter a la placa a vapores de amonaco d) Investigacin de Antocianos Tabla4.18: Resultados de la Identificacin de Antocianos Reaccin Con HCl Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antocianos, en la reaccin con HCl no se observa cambio de coloracin se mantiene de color verde. e) Investigacin de Antraquinonas Tabla4.19: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas Reaccin Reaccin de Bomtrager Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antraquinonas, con la reaccin de Bomtrager, ya que no hay un cambio de coloracin. f) Investigacin de Taninos Tabla4.20: Resultados de la Identificacin de Taninos Reaccin Cloruro frrico 5% Resultados ++++ Observaciones Coloracin verde si no es un tanino hidrolizable Gelatina salada +++ Precipitado blanco floculento

Al identificar taninos con cloruro frrico 5% se observa una coloracin verde lo que comprueba le existencia de taninos no hidrolizables, en la reaccin con gelatina salada el resultado es un precipitado blanco, lo que indica la existencia de taninos.

48

g) Investigacin de Saponinas Tabla4.21: Resultados de la Identificacin de Saponinas Reaccin Con agua Resultados +/Observaciones Escasa espuma

Se determina la escasa presencia de saponinas por la formacin de espuma en la reaccin con agua. h) Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos Tabla4.22: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos Reaccin Reaccin de Baljet Reaccin de Kedde Resultados Observaciones No hay cambio de color No hay cambio de color

No se determina la presencia de glicsidos cardiotnicos, porque no se produce el cambio de coloracin esperado en las pruebas realizadas. i) Cromatografa Tabla4.23: Resultados de la cromatografa PRINCIPIO ACTIVO Alcaloides Esteroles Antraquinonas Flavonoides Cardiotnicos Cumarinas SOLUCIN REVELADORA Draggendorf actico H2SO4- Vainillina KOH al 10% UV Fluorescencia Vapores de NH3 Raimond Vainillina sulfrica OBSERVACIONES Mancha morada Mancha amarilla -

Presencia de esteroles, flavonoides. B. Chamana Nombre cientfico: Dononea viscosa Peso de planta seca y molida: 50 g Volumen de etanol (macerado): 200 ml

49

Tiempo de maceracin: 24 horas Volumen concentrado: 150 ml Tiempo de reflujo: 1 hora Para la obtencin del extracto etanlico total se utiliz 50 g de planta seca y molida en un frasco de boca ancha de color mbar con 200 ml de alcohol de 70GL, el tiempo de maceracin fue de 24 horas, se filtra y se concentra a la mitad del volumen, al residuo se le coloca en el boln y se lo lleva a reflujo por una hora con la cantidad de alcohol adecuada para cubrir el material vegetal, luego se procede a filtrar y a concentrar hasta la tercera parte, se une al extracto anterior obtenido, medir el volumen obtenido y este extracto se denomina extracto total (A). Marcha Fitoqumica Significado de la interpretacin: ++++ muy abundante +++ ++ + +/(-) abundante moderado medianamente escaso escaso nada a) Investigacin de Alcaloides Tabla4.24: Resultados de la Identificacin de Alcaloides Reaccin Mayer Resultados Observaciones No hay formacin de precipitado de color blanco amarillento Wagner No hay formacin de precipitado amarillo plido Draggendorff No hay formacin de precipitado anaranjado

Se determina que no existe presencia de alcaloides en la planta, debido a que no hay presencia de precipitados en las diferentes reacciones realizadas.

50

b) Investigacin de Esteroles Tabla 4.25: Resultados de la Identificacin de Esteroles Reaccin Reaccin de Lieberman Reaccin de Zack Resultados ++++ +++ Observaciones Formacin de anillo azul Formacin de un anillo verde oscuro ms o menos abundante

Se determina la presencia de esteroles por la formacin de un anillo de color azul en la reaccin de Lieberman y un anillo de color verde en la reaccin de Zack, resultado que se comprueba mediante cromatografa en capa fina, los esteroles al revelar la placa se presentan como una mancha de color morado. c) Investigacin de Flavonoides Tabla4.26: Resultados de la Identificacin de Flavonoides Reaccin Reaccin de Shidona Resultados ++++ Observaciones Presencia de espuma abundante y coloracin roja Reaccin de Cianidina Reaccin en medio alcalino +++ +++ Coloracin roja Coloracin naranja en pequea cantidad, que luego cambia a verde

Se determina la presencia de flavonoides por la formacin de espuma y/o el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Shidona, por el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Cianidida al adicionar limaduras de magnesio, y por la formacin de una coloracin naranja que cambia a verde al aadir FeCl3. Resultado que se comprueba con la cromatografa en capa fina, al revelar la placa se observa una mancha de color amarillo, en luz UV y visible que se intensifica o cambia de color al someter a la placa a vapores de amonaco d) Investigacin de Antocianos Tabla4.27: Resultados de la Identificacin de Antocianos Reaccin Con HCl Resultados Observaciones No existe cambio de color

51

Se determina que no existe presencia de antocianos, en la reaccin con HCl no se observa cambio de coloracin se mantiene de color verde. e) Investigacin de Antraquinonas Tabla4.28: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas Reaccin Reaccin de Bomtrager Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antraquinonas, con la reaccin de Bomtrager, ya que no hay un cambio de coloracin. f) Investigacin de Taninos Tabla4.29: Resultados de la Identificacin de Taninos Reaccin Cloruro frrico 5% Resultados ++++ Observaciones Coloracin verde si no es un tanino hidrolizable Gelatina salada +++ Precipitado blanco floculento

Al identificar taninos con cloruro frrico 5% se observa una coloracin verde lo que comprueba le existencia de taninos no hidrolizables, en la reaccin con gelatina salada el resultado es un precipitado blanco, lo que indica la existencia de taninos. g) Investigacin de Saponinas Tabla4.30: Resultados de la Identificacin de Saponinas Reaccin Con agua Resultados +++ Observaciones Abundante espuma

Se determina presencia de abundante saponinas por la formacin de espuma en la reaccin con agua. h) Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos

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Tabla4.31: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos Reaccin Reaccin de Baljet Reaccin de Kedde Resultados Observaciones No hay cambio de color No hay cambio de color

No se determina la presencia de glicsidos cardiotnicos, porque no se produce el cambio de coloracin esperado en las pruebas realizadas. i) Cromatografa Tabla4.32: Resultados de la cromatografa PRINCIPIO ACTIVO Alcaloides Esteroles Antraquinonas Flavonoides Cardiotnicos Cumarinas SOLUCIN REVELADORA Draggendorf actico H2SO4- Vainillina KOH al 10% UV Fluorescencia Vapores de NH3 Raimond Vainillina sulfrica OBSERVACIONES Mancha morada Mancha amarilla -

Presencia de esteroles, flavonoides. C. Palma de chonta Nombre cientfico: Bactris gasipaes Peso de planta seca y molida: 50 g Volumen de etanol (macerado):150 ml Tiempo de maceracin: 24 horas Volumen concentrado: 100 ml Tiempo de reflujo: 1 hora Para la obtencin del extracto etanlico total se utiliz 50 g de planta seca y molida en un frasco de boca ancha de color mbar con 150 ml de alcohol de 70GL, el tiempo de maceracin fue de 24 horas, se filtra y se concentra a la mitad del volumen, al residuo se le coloca en el boln y se lo lleva a reflujo por una hora con la cantidad de alcohol adecuada para cubrir el material vegetal, luego se procede a filtrar y a concentrar hasta la tercera parte, se une al extracto anterior obtenido, medir el volumen obtenido y este extracto se denomina extracto total (A).

53

Marcha Fitoqumica Significado de la interpretacin: ++++ muy abundante +++ ++ + +/(-) abundante moderado medianamente escaso escaso nada a) Investigacin de Alcaloides Tabla4.33: Resultados de la Identificacin de Alcaloides Reaccin Mayer Resultados Observaciones Precipitado de color blanco amarillento en pequea cantidad Wagner Draggendorff Ligero precipitado amarillo plido Precipitado anaranjado ms o menos abundante.

Se determina que no existe

presencia de alcaloides en la planta, porque no hay formacin de

precipitados en las diferentes reacciones realizadas. b) Investigacin de Esteroles Tabla4.34: Resultados de la Identificacin de Esteroles Reaccin Reaccin de Lieberman Reaccin de Zack Resultados ++ ++ Observaciones Formacin de anillo azul Formacin de un anillo verde oscuro ms o menos abundante

Se determina la presencia de esteroles por la formacin de un anillo de color azul en la reaccin de Lieberman y un anillo de color verde en la reaccin de Zack, resultado que se comprueba mediante cromatografa en capa fina, los esteroles al revelar la placa se presentan como una mancha de color morado.

54

c) Investigacin de Flavonoides Tabla4.35: Resultados de la Identificacin de Flavonoides Reaccin Reaccin de Shidona Resultados ++++ Observaciones Presencia de espuma abundante y coloracin roja Reaccin de Cianidina Reaccin en medio alcalino +++ +++ Coloracin roja Coloracin naranja en pequea cantidad, que luego cambia a verde

Se determina la presencia de flavonoides por la formacin de espuma y/o el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Shidona, por el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Cianida al adicionar limaduras de magnesio, y por la formacin de una coloracin naranja que cambia a verde al aadir FeCl3. Resultado que se comprueba con la cromatografa en capa fina, al revelar la placa se observa una mancha de color amarillo, en luz UV y visible que se intensifica o cambia de color al someter a la placa a vapores de amonaco d) Investigacin de Antocianos Tabla4.36: Resultados de la Identificacin de Antocianos Reaccin Con HCl Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antocianos, en la reaccin con HCl no se observa cambio de coloracin se mantiene de color verde. e) Investigacin de Antraquinonas Tabla4.37: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas Reaccin Reaccin de Bomtrager Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antraquinonas, con la reaccin de Bomtrager, ya que no hay un cambio de coloracin.

55

f) Investigacin de Taninos Tabla4.38: Resultados de la Identificacin de Taninos Reaccin Cloruro frrico 5% Gelatina salada Resultados +/++ Observaciones No hay coloracin azul clara Precipitado blanco floculento

Al identificar taninos con cloruro frrico 5% se observa una coloracin verde lo que comprueba le existencia de taninos no hidrolizables, en la reaccin con gelatina salada el resultado es un precipitado blanco, lo que indica la existencia de taninos. g) Investigacin de Saponinas Tabla4.39: Resultados de la Identificacin de Saponinas Reaccin Con agua Resultados Observaciones No hay espuma

Se determina que no existe presencia de saponinas en la reaccin con agua. h) Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos Tabla4.40: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos Reaccin Reaccin de Baljet Reaccin de Kedde Resultados Observaciones No hay cambio de color No hay cambio de color

No se determina la presencia de glicsidos cardiotnicos, porque no se produce el cambio de coloracin esperado en las pruebas realizadas.

56

i)

Cromatografa Tabla4.41: Resultados de la cromatografa

PRINCIPIO ACTIVO Alcaloides Esteroles Antraquinonas

SOLUCIN REVELADORA Draggendorf actico H2SO4- Vainillina KOH al 10% UV Fluorescencia

OBSERVACIONES Mancha morada -

Flavonoides Cardiotnicos Cumarinas

Vapores de NH3 Raimond Vainillina sulfrica

Mancha amarilla -

Presencia de esteroles, flavonoides. D. Morete Nombre cientfico: Mauritia flexuosa Peso de planta seca y molida: 50 g Volumen de etanol (macerado): 200 ml Tiempo de maceracin: 24 horas Volumen concentrado: 100 ml Tiempo de reflujo: 1 hora

Para la obtencin del extracto etanlico total se utiliz 50 g de planta seca y molida en un frasco de boca ancha de color mbar con 200 ml de alcohol de 70GL, el tiempo de maceracin fue de 24 horas, se filtra y se concentra a la mitad del volumen, al residuo se le coloca en el boln y se lo lleva a reflujo por una hora con la cantidad de alcohol adecuada para cubrir el material vegetal, luego se procede a filtrar y a concentrar hasta la tercera parte, se une al extracto anterior obtenido, medir el volumen obtenido y este extracto se denomina extracto total (A). Marcha Fitoqumica Significado de la interpretacin: ++++ muy abundante +++ ++ abundante moderado

57

+ +/(-)

medianamente escaso escaso nada a) Investigacin de Alcaloides Tabla4.42: Resultados de la Identificacin de Alcaloides Reaccin Mayer Resultados Observaciones No hay formacin de precipitado de color blanco amarillento Wagner No hay formacin precipitado amarillo plido Draggendorff No hay formacin precipitado anaranjado

Se determina que no existe

presencia de alcaloides en la planta, porque no hay formacin de

precipitados en las diferentes reacciones realizadas. b) Investigacin de Esteroles Tabla 4.43: Resultados de la Identificacin de Esteroles Reaccin Reaccin de Lieberman Reaccin de Zack Resultados ++ + Observaciones Formacin de anillo azul Formacin de un anillo verde oscuro

Se determina la presencia de esteroles por la formacin de un anillo de color azul en la reaccin de Lieberman y un anillo de color verde en la reaccin de Zack, resultado que se comprueba mediante cromatografa en capa fina, los esteroles al revelar la placa se presentan como una mancha de color morado.

58

c) Investigacin de Flavonoides Tabla4.44: Resultados de la Identificacin de Flavonoides Reaccin Reaccin de Shidona Resultados +++ Observaciones Presencia de espuma abundante y coloracin roja Reaccin de Cianidina Reaccin en medio alcalino +++ +++ Coloracin roja ms o menos abundante Coloracin naranja en pequea cantidad, que luego cambia a verde

Se determina la presencia de flavonoides por la formacin de espuma y/o el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Shidona, por el aparecimiento de una coloracin roja en la reaccin de Cianida al adicionar limaduras de magnesio, y por la formacin de una coloracin naranja que cambia a verde al aadir FeCl3. Resultado que se comprueba con la cromatografa en capa fina, al revelar la placa se observa una mancha de color amarillo, en luz UV y visible que se intensifica o cambia de color al someter a la placa a vapores de amonaco d) Investigacin de Antocianos Tabla4.45: Resultados de la Identificacin de Antocianos Reaccin (MarcadorDePosicin1)Con HCl Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antocianos, en la reaccin con HCl no se observa cambio de coloracin se mantiene de color verde. e) Investigacin de Antraquinonas Tabla 4.46: Resultados de la Identificacin de Antraquinonas Reaccin Reaccin de Bomtrager Resultados Observaciones No existe cambio de color

Se determina que no existe presencia de antraquinonas, con la reaccin de Bomtrager, ya que no hay un cambio de coloracin.

59

f) Investigacin de Taninos Tabla4.47: Resultados de la Identificacin de Taninos Reaccin Cloruro frrico 5% Gelatina salada Resultados Observaciones No hay cambio de color No hay formacin de precipitado blanco floculento

Se determina que no existe presencia de taninos, ya que no hay un cambio de coloracin ni formacin de precipitado. g) Investigacin de Saponinas Tabla4.48: Resultados de la Identificacin de Saponinas Reaccin Con agua Resultados +/Observaciones Escasa espuma

Se determina la escasa presencia de saponinas por la formacin de espuma en la reaccin con agua. h) Investigacin de Glicsidos Cardiotnicos Tabla 4.49: Resultados de la Identificacin de Glicsidos Cardiotnicos Reaccin Reaccin de Baljet Reaccin de Kedde Resultados Observaciones No hay cambio de color No hay cambio de color

No se determina la presencia de glicsidos cardiotnicos, porque no se produce el cambio de coloracin esperado en las pruebas realizadas.

60

i)

Cromatografa Tabla4.50: Resultados de la cromatografa

PRINCIPIO ACTIVO Alcaloides Esteroles Antraquinonas

SOLUCIN REVELADORA Draggendorf actico H2SO4- Vainillina KOH al 10% UV Fluorescencia

OBSERVACIONES Mancha morada -

Flavonoides Cardiotnicos Cumarinas Presencia de esteroles, flavonoides.

Vapores de NH3 Raimond Vainillina sulfrica

Mancha amarilla -

Tabla4.51: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Opuntia soederstromiana (Tuna Roja) PRINCIPIO ACTIVO ALCALOIDES REACCION Dragendorff, Wagner, Mayer Reaccin de Lieberman-Buchard Reaccin de Zack Reaccin de Shidona Reaccin en medio alcalino Reaccin de cianidina Gotas de HCl Reaccin de Bomtrager Con Cloruro frrico 5% Con Gelatina salada Con agua Reaccin de Bajlet Reaccin de Kedde RESULTADOS ++++ +++ ++++ +++ +++ ++++ +++ +/INTERPRETACIN Nulo Nulo Nulo Muy abundante Abundante Muy abundante Abundante Abundante Nulo Nulo Muy abundante Abundante Escaso Nulo Nulo

ESTEROLES

FLAVONOIDES

ANTOCIANOS ANTRAQUINONAS TANINOS SAPONINAS HETERSIDOS CARDIOTNICOS Interpretacin

Mediante la investigacin fitoqumica y cromatografa en capa fina, del el extracto etanlico total deOpuntia soederstromiana (Tuna roja), se determina la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides y taninos en abundante concentracin, saponinas concentracin en baja

61

Tabla4. 52: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Dononea viscosa (Chamana) PRINCIPIO ACTIVO ALCALOIDES REACCION Dragendorff, Wagner, Mayer Reaccin de Lieberman-Buchard Reaccin de Zack Reaccin de Shidona Reaccin en medio alcalino Reaccin de cianidina Gotas de HCl Reaccin de Bomtrager Con Cloruro frrico 5% Con Gelatina salada Con agua Reaccin de Bajlet Reaccin de Kedde RESULTADOS ++++ +++ ++++ +++ +++ ++++ +++ +++ INTERPRETACIN Nulo Nulo Nulo Muy abundante Abundante Muy abundante Abundante Abundante Nulo Nulo Muy abundante Abundante Abundante Nulo Nulo

ESTEROLES

FLAVONOIDES

ANTOCIANOS ANTRAQUINONAS TANINOS SAPONINAS HETERSIDOS CARDIOTNICOS Interpretacin

Mediante la investigacin Fitoqumica y la cromatografa de capa fina del extracto etanlico total deDononea viscosa (Chamana), se determina la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides, taninos y saponinas en abundante concentracin. Tabla4.53: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Bactris gasipaes (Palma de chonta) PRINCIPIO ACTIVO ALCALOIDES REACCION Dragendorff, Wagner, Mayer Reaccin de Lieberman-Buchard Reaccin de Zack Reaccin de Shidona Reaccin en medio alcalino Reaccin de cianidina Gotas de HCl Reaccin de Bomtrager Con Cloruro frrico 5% Con Gelatina salada Con agua Reaccin de Bajlet Reaccin de Kedde RESULTADOS ++ ++ ++++ +++ +++ +/++ INTERPRETACIN Nulo Nulo Nulo Moderado Moderado Muy abundante Abundante Abundante Nulo Nulo Escaso Moderado Nulo Nulo Nulo

ESTEROLES

FLAVONOIDES

ANTOCIANOS ANTRAQUINONAS TANINOS SAPONINAS HETERSIDOS CARDIOTNICOS

62

Interpretacin Mediante la investigacin fitoqumica y cromatografa de capa fina del el extracto etanlico total deBactris gasipaes (Palma de chonta), se determina la presencia de los siguientes metabolitos

secundarios: flavonoides en abundante concentracin al igual que los taninos hidrosolubes , esteroles saponinas en baja concentracin.

Tabla4.54: Resultados generales de la Marcha Fitoqumica Mauritia flexuosa (Morete) PRINCIPIO ACTIVO ALCALOIDES REACCIN Dragendorff, Wagner, Mayer Reaccin de Lieberman-Buchard Reaccin de Zack Reaccin de Shidona Reaccin en medio alcalino Reaccin de cianidina Gotas de HCl Reaccin de Bomtrager Con Cloruro frrico 5% Con Gelatina salada Con agua Reaccin de Bajlet Reaccin de Kedde RESULTADOS ++ + +++ +++ +++ +/INTERPRETACIN Nulo Nulo Nulo Moderado Medianamente escaso Abundante Abundante Abundante Nulo Nulo Nulo Nulo Escaso Nulo Nulo

ESTEROLES

FLAVONOIDES

ANTOCIANOS ANTRAQUINONAS TANINOS SAPONINAS HETERSIDOS CARDIOTNICOS

Interpretacin Mediante la investigacin fitoqumica y cromatografa de capa fina del extracto etanlico total de Mauritia flexuosa(Morete), se determina la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides en abundante concentracin, saponinas en baja concentracin

63

4.2.5 Investigacin Farmacolgica 4.2.5.1 Obtencin del Extracto Hidroalcohlico Tabla 4.55: Datos de la obtencin de los Extractos Hidroalcohlicos Datos Opuntia soederstromiana (Tuna roja) 100,1582 g 350 Ml 48 horas 250mL 500 mL 48 horas (8 gotas/minuto) 250Ml 55 mL Dononea viscosa (Chamana) 100,2345 400mL 48 horas 200mL 450mL 48 horas (5 gotas/minuto) 200mL 50mL Mauritia flexuosa (Morete) 100,415g 300mL 48 horas 150mL 250mL 48 horas (7 gotas/minuto) 150mL 30mL Bactris gasipaes (Chonta) 100,101 300mL 48 horas 200mL 200mL 48 horas (5 gotas/minuto) 200mL 25mL

Peso de planta seca y molida Volumen de etanol (macerado) Tiempo de maceracin Volumen obtenido del macerado Volumen de etanol (percolado) Tiempo de percolacin Volumen obtenido del percolado Volumen obtenido del concentrado a casi sequedad

Ejemplo del proceso que se realiz a cada planta: En la obtencin del extracto hidroalcohlico para la investigacin fitoqumica, se utiliz 100,1582 g de planta seca y molida, con 350 ml de alcohol de 70C, se dej en maceracin durante 48 horas en un lugar obscuro, con agitacin constante, se filtra, y el residuo slido se percola hasta extraccin exhaustiva, el extracto y el percolado se juntan y se concentra a casi sequedad. 4.3. Etapa II

Determinacin de la actividad antioxidante en el extracto. 4.3.1 Evaluacin de la Actividad Antioxidante del Extracto Para la evaluacin de la actividad antioxidante se procede a usar el mtodo de (Brand-Williams, W., Cuvelier, M, Y Berset, C. 1995). Se procede a preparar soluciones metanlicas de cada extracto de planta a diferentes concentraciones. 4.3.1.1 Clculos de la dosis de extracto a ensayar Pesar 1 ml del extracto en un vidrio reloj para obtener el peso de 1 ml de extracto seco

64

Tabla4.56: Concentracin de extracto de planta Opuntia soederstromiana (Tuna roja) N de Ensayos 1 Peso vidrio reloj (g) 34.9833 Peso vidrio reloj + extracto seco (g) 35.0004 Peso extracto seco (g) 0.0171 Concentracin de extracto de planta (g/ml) 0,0171

Dononea viscosa (Chamana) N de Ensayos 1 Mauritia flexuosa N de Ensayos Peso vidrio reloj (g) 33.0442 (Morete) Peso vidrio reloj + extracto seco (g) 33,7184 Peso extracto seco (g) 0.0673 Concentracin de extracto de planta (g/ml) 0,0673 Peso vidrio reloj + extracto seco (g) 33.0956 Peso extracto seco (g) 0.0514 Concentracin de extracto de planta (g/ml) 0.0514

Peso vidrio reloj (g) 33.6511

1 Bactris gasipaes (Chonta) N de Ensayos Peso vidrio reloj (g) 30.6185 1 Peso vidrio reloj + extracto seco (g) 30.6800 Peso extracto seco (g) 0.0615 Concentracin de extracto de planta (g/ml) 0,0615

4.3.1.2 Clculo del volumen del extracto Se prepararon las soluciones de acuerdo a la formula anterior como se puede ver en la siguiente tabla. Ejemplo:Para 200 ug/mL

65

Tabla4.57: Volumen de Extracto de planta para preparar las diferentes concentraciones Volumen del extracto l Concentracin del extracto en metanol ( ug/mL ) 200 150 100 50 Opuntia soederstromiana (Tuna roja) 292 219 146 73 Dononea viscosa (Chamana) 97 73 49 24 Mauritia flexuosa (Morete) 74 56 37 19 Bactris gasipaes (Chonta) 81 61 41 20

4.3.1.3 Recoleccin de datos Absorbancias ledas en el Espectrofotmetro de las soluciones de vitamina C en metanol se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.58: Absorbancias del blanco muestra Vitamina C Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancias del blanco de muestra Media de grupo 0,012 0,011 0,01 0,008 Media total 0,0135 0,0105 0,0093 0,0078 0,0103

0,013 0,01 0,009 0,008

0,014 0,011 0,009 0,007

0,015 0,01 0,009 0,008

Lectura de las absorbancias luego de los treinta minutos de terminada la reaccin entre el radical (DPPH) y la vitamina C, se puede ver en la siguiente tabla.

Tabla4.59: Absorbancias de muestra Vitamina C Concentracin ug/mL 200 150 100 50 0,055 0,065 0,096 0,101 Absorbancias Media de grupo 0,06 0,066 0,096 0,101 Media total 0,0590 0,0663 0,0968 0,1005 0,0806

0,061 0,068 0,097 0,1

0,06 0,066 0,098 0,1

66

4.3.1.3 Clculo del % Inhibicin del radical libre de la Vitamina C (Actividad Antioxidante) Absorbancia del reactivo 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) es de 0,240

)
Ejemplo: Para 200 ug/mL

Los valores del % de inhibicin del radical libre (Actividad Antioxidante) de la Vitamina C se ven reflejados en la siguiente tabla: Tabla4.60: % Inhibicin de radical libre - Vitamina C Concentracin ug/mL 200 150 100 50 82,5000 77,0833 63,7500 61,2500 % Inhibicin de radical libre Media de grupo 81,0417 76,7708 63,5417 61,3542 70,6771

80,4167 76,2500 63,3333 61,2500

81,2500 76,6667 62,9167 61,6667

80,0000 77,0833 64,1667 61,2500 Media total

Tabla4.61: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Vitamina C Concentracin Absorbancia ug/mL % Inhibicin de radical libre 81,0417 76,7708 63,5417 61,3542

200 150 100 50

0,0590 0,0663 0,0968 0,1005

67

Absorbancia vs Concentracin
0,1200 0,1000

Absorbancia

0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0,0000 0 50 100 150 200 250

Concentracin ug/mL Figura 4.13: Absorbancia vs Concentracin Vitamina C

%Inhibicin de radicales libres vs Concentracin % Inhibicin de radicales libres

100,0000 80,0000 60,0000 40,0000 20,0000 0,0000 0 50 100 150 200

y = 0,1446x + 52,604 R = 0,9253

Concentracin ug/ml

250

Figura 4.14: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin - Vitamina C

Absorbancias ledas en el Espectrofotmetro de las soluciones de en metanol Opuntia soederstromiana (Tuna roja) se puede ver en la siguiente tabla.

68

Tabla4.62: Absorbancias de blanco de muestra - Opuntia soederstromiana (Tuna roja) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancias de blanco de muestra 0,266 0,193 0,142 0,069 0,021 0,017 0,016 0,011 0,02 0,018 0,014 0,012 0,019 0,018 0,015 0,012 Media total Media de grupo 0,0815 0,0615 0,04675 0,026 0,21575

Lectura de las absorbancias luego de los treinta minutos de terminada la reaccin entre el radical (DPPH) y la Opuntia soederstromiana (Tuna roja), se puede ver en la siguiente tabla.

Tabla4.63: Absorbancias de muestra - Opuntia soederstromiana (Tuna roja) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancias 0,4570 0,4680 0,4950 0,5080 0,4550 0,4670 0,4930 0,5050 0,4540 0,4630 0,4900 0,5070 0,4530 0,4650 0,4910 0,5040 Media total Media de grupo 0,4548 0,4658 0,4923 0,5060 0,4797

Concentracin vs Absorbancia
0,5100

Absorbancia

0,5000 0,4900 0,4800 0,4700 0,4600 0,4500 0 50 100 150 200 250

Concentracin ug/mL

Figura 4.15: Absorbancia vs Concentracin Opuntia soederstromiana (Tuna roja)

69

 Absorbancias ledas en el Espectrofotmetro de las soluciones de en metanol Dononea viscosa (Chamana) se puede ver en la siguiente tabla. Tabla 4.64: Absorbancias de blanco de muestra - Dononea viscosa (Chamana) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancias del blanco de muestra Media de grupo 0,1575 0,1248 0,0940 0,0488 0,1063

0,1600 0,1260 0,0950 0,0500

0,1580 0,1240 0,0930 0,0490

0,1560 0,1230 0,0930 0,0470

0,1560 0,1260 0,0950 0,0490 Media total

Lectura de las absorbancias luego de los treinta minutos de terminada la reaccin entre el radical (DPPH) y la Dononea viscosa (Chamana), se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.65: Absorbancias de muestra - Dononea viscosa (Chamana) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 0,0680 0,1130 0,1610 0,2460 Absorbancias 0,0650 0,1090 0,1580 0,2470 0,0630 0,1080 0,1570 0,2450 0,0650 0,1100 0,1600 0,2450 Media total Media de grupo 0,0653 0,1100 0,1590 0,2458 0,1450

Los valores del % de inhibicin del radical libre (Actividad Antioxidante) de la Dononea viscosa (Chamana) se ven reflejados en la siguiente tabla: Tabla 4.66: % Inhibicin de radicales libres - Dononea viscosa (Chamana) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 % Inhibicin de radicales libres 138,3333 105,4167 72,5000 18,3333 138,7500 106,2500 72,9167 17,5000 138,7500 106,2500 73,3333 17,5000 137,9167 106,6667 72,9167 18,3333 Media total Media de grupo 138,4375 106,1458 72,9167 17,9167 83,8542

70

Tabla4.67: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Dononea viscosa (Chamana) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancia % Inhibicin de radical libre 138,4375 106,1458 72,9167 17,9167

0,0653 0,1100 0,1590 0,2458

Absorbancia vs Concentracin
0,3000 0,2500

Absorbancia

0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 50 100 150 200 250

Concentracin ug/mL Figura 4.16: Absorbancia vs Concentracin Dononea viscosa (Chamana)

%Inhibicin de radicales libres vs Concentracin

100,0000 80,0000 60,0000 40,0000 20,0000 0,0000 -20,0000 -40,0000 0 50 100 150 200 250 y = 0,5715x - 35,156 R = 0,9373

% Inhibicin de radicales libres

Concentracin ug/ml

Figura 4.17: % Inhibicin de radicales libres vs Concentracin - Dononea viscosa (Chamana)

71

 Absorbancias ledas en el Espectrofotmetro de las soluciones de en metanol Mauritia flexuosa (Morete) se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.68: Absorbancia del blanco muestra Mauritia flexuosa (Morete) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancia del blanco de muestra 0,025 0,018 0,016 0,012 0,026 0,018 0,015 0,011 0,024 0,019 0,016 0,013 Media total 0,025 0,019 0,017 0,012 Media de grupo 0,0250 0,0185 0,0160 0,0120 0,0179

Lectura de las absorbancias luego de los treinta minutos de terminada la reaccin entre el radical (DPPH) y la Mauritia flexuosa (Morete), se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.69: Absorbancias de muestra - Mauritia flexuosa (Morete) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 0,075 0,07 0,122 0,188 Absorbancias 0,076 0,072 0,124 0,19 0,075 0,072 0,123 0,189 Media total 0,077 0,071 0,123 0,189 Media de grupo 0,0758 0,0713 0,1230 0,1890 0,1148

Tabla4.70: % Inhibicin de radicales libres - Mauritia flexuosa (Morete) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 % Inhibicin de radicales libres 79,1667 78,3333 55,8333 26,6667 79,1667 77,5000 54,5833 25,4167 78,7500 77,9167 55,4167 26,6667 78,3333 78,3333 55,8333 26,2500 Media total Media de grupo 78,8542 78,0208 55,4167 26,2500 59,6354

72

Tabla4.71: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Mauritia flexuosa (Morete) Concentracin Absorbancia ug/mL 200 150 100 50 0,0758 0,0713 0,1230 0,1890 % Inhibicin de radical libre 78,8542 78,0208 55,4167 26,2500

Absorbancia vs Concentracin
0,2000

Absorbancia

0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 50 100 150 200 250

Concentracin ug/mL Figura 4.18: Absorbancia vs Concentracin - Mauritia flexuosa (Morete)

%Inhibicin de radicales libres vs Concentracin % Inhibicin de radicales libres 100,0000 80,0000 60,0000 40,0000
y = 0,3608x + 14,531 R = 0,8846

20,0000
0,0000
0 50 100 150 200 250

Concentracin ug/ml Figura 4.19: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin- Mauritia flexuosa (Morete)

73

 Absorbancias ledas en el Espectrofotmetro de las soluciones de en metanolBactris gasipaes (Chonta)se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.72: Absorbancias del blanco muestra Bactris gasipaes (Chonta) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 Absorbancias del blanco de muestra 0,076 0,037 0,028 0,018 0,077 0,038 0,027 0,019 0,076 0,037 0,028 0,016 0,077 0,039 0,029 0,018 Media total Media de grupo 0,0765 0,0378 0,0280 0,0178 0,0401

Lectura de las absorbancias luego de los treinta minutos de terminada la reaccin entre el radical (DPPH) y la Bactris gasipaes (Chonta),se puede ver en la siguiente tabla. Tabla4.73: Absorbancias de muestra Bactris gasipaes (Chonta) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 0,218 0,228 0,269 0,272 Absorbancias Media de grupo 0,22 0,229 0,269 0,272 Media total 0,2193 0,2278 0,2683 0,2713 0,2466

0,219 0,227 0,268 0,27

0,22 0,227 0,267 0,271

Tabla4.74:% Inhibicin de radicales libres - Bactris gasipaes (Chonta) Concentracin ug/mL 200 150 100 50 % Inhibicin de radicales libres 42,2764 22,3577 2,0325 -3,2520 42,2764 23,1707 2,0325 -2,0325 41,4634 22,7642 2,8455 -3,6585 41,8699 22,7642 2,4390 -3,2520 Media total Media de grupo 41,9715 22,7642 2,3374 -3,0488 16,0061

74

Tabla4.75: Resumen de Absorbancias, % Inhibicin de radicales libres - Bactris gasipaes (Chonta) Concentracin Absorbancia ug/mL 200 150 100 50 0,2193 0,2278 0,2683 0,2713 % Inhibicin de radical libre 41,9715 22,7642 2,3374 -3,0488

Absorbancia vs Concentracin
0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 50 100 150 200 250

Absorbancia

Concentracin ug/mL Figura 4.20: Absorbancia vs Concentracin - Bactris gasipaes (Chonta)

%Inhibicin de radicales libres vs Concentracin

% Inhibicin de radicales libres

50,0000 40,0000 30,0000 20,0000 10,0000 0,0000 50 100 150

y = 0,3185x - 25,885 R = 0,9528

-10,0000 0 -20,0000

200

250

Concentracin ug/ml

Figura 4.21: %Inhibicin de radicales libres vs Concentracin- Bactris gasipaes (Chonta)

75

% INHIBICIN DE RADICAL LIBRE VS CONCENTRACIN

160

% Inhibicion radicalaria

140 120 100 80 60 40 20 0 -20 200 150 100 50

Concentracin ug/mL CHAMANA VITAMINA C MORETE CHONTA

Figura 4.22: Actividad Antioxidante

Interpretacin El extracto hidroalcohlico de Dononea viscosa (Chamana) a las concentraciones de 200 ug/mL, produce un porcentaje de Actividad Antioxidante de 138 % y a la concentracin de 150 ug/mL es de 106 % los dos porcentajes son mucho ms altos en comparacin con los porcentajes de Actividad Antioxidante obtenidos con el frmaco de referencia Vitamina C que es de 81% y 76 % a las concentraciones respectivas. 4.4 ANLISIS ESTADSTICO El anlisis estadstico se va a realizar mediante un anlisis de bloques completamente al azar (DBCA), con su respectivo anlisis de varianza.

76

4.4.1Dononea viscosa (Chamana) Tabla4.76: Relacin de Concentracin de extracto y el porcentaje de Inhibicin radicalaria

Concentracin ug/mL 200

% Inhibicin de radicales libres Dononea viscosa (Chamana) 138,3333 138,7500 138,7500 137,9167 105,4167 106,2500 106,2500 106,6667 72,5000 72,9167 73,3333 72,9167 18,3333 17,5000 17,5000 18,3333

% Inhibicin de radicales libres Vitamina C 82,5000 80,4167 81,2500 80,0000 77,0833 76,2500 76,6667 77,0833 63,7500 63,3333 62,9167 64,1667 61,2500 61,2500 61,6667 61,2500

150

100

50

77

Anlisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo RESUMEN % Inhibicin de radicales libres Dononea viscosa (Chamana) 4 553,75 138,4375 0,15913426 % Inhibicin de radicales libres Vitamina C Total

200 Cuenta Suma Promedio Varianza 150 Cuenta Suma Promedio Varianza 100 Cuenta Suma Promedio Varianza 50 Cuenta Suma Promedio Varianza Total Cuenta Suma Promedio Varianza

4 8 324,1667 877,9167 81,041675 109,739588 1,215263889 941,812093

4 424,5834 106,14585 0,27487963

4 8 307,0833 731,6667 76,770825 91,4583375 0,159127316 246,726601

4 291,6667 72,916675 0,115731482

4 8 254,1667 545,8334 63,541675 68,229175 0,289356483 25,2852163

4 71,6666 17,91665 0,231462963

4 8 245,4167 317,0833 61,354175 39,6354125 0,043409722 539,208825

16 1341,6667 83,85416875 2118,461375

16 1130,8334 70,6770875 75,64519676

Origen de las variaciones Muestra Columnas Interaccin Dentro del grupo Total

Suma de cuadrados 22029,4532 1389,0838 10874,6803 7,4651

ANLISIS DE VARIANZA Grados Promedio de F Probabilidad Valor de los cuadrados crtico para libertad F 3 7343,1511 23607,9478 9,2002E-42 3,0088 1 1389,0838 4465,8508 8,7930E-29 4,2597 3 3624,8934 11653,8927 4,3749E-38 3,0088 24 0,31105

34300,6824

31

78

Interpretacin: Se determina a la hiptesis como alternativa porque existe diferencia significativa entre el extracto de la planta con respecto al frmaco de referencia (Vitamina C) ya que F calculada es mayor que F tabulada, razn por la cual se puede decir que no se comportan de la misma manera. Esto se debe a que el extracto hidroalcohlico de Dononea viscosa (Chamana) presentan un

porcentaje de Inhibicin radicalaria mayor que la Vitamina C (frmaco de Referencia).

% Inhibicin de radical libre vs Concentracin entre Dononea viscosa y Vitamina C

160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 y = 0,7896x - 14,844 R = 0,981

% Inhibicion radicalaria

y = 0,1446x + 52,604 R = 0,9253

250

Concentracin ug/mL % Inhibicin de radical libre Dononea viscosa % Inhibicin de radical libre Vitamina C

Figura 4.23: Comparacin de Actividad Antioxidante

79

4.4.2 Mauritia flexuosa (Morete)

Tabla4.77: Relacin de Concentracin de extracto y el % de Inhibicin radicalaria

Concentracin ug/mL

% Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) 79,1667 79,1667 78,7500 78,3333

% Inhibicin de radicales libres Vitamina C

200

82,5000 80,4167 81,2500 80,0000 77,0833 76,2500 76,6667 77,0833 63,7500 63,3333 62,9167 64,1667 61,2500 61,2500 61,6667 61,2500

150

78,3333 77,5000 77,9167 78,3333

100

55,8333 54,5833 55,4167 55,8333

50

26,6667 25,4167 26,6667 26,2500

80

Anlisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo RESUMEN % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) 4,0000 315,4167 78,8542 0,1591
150

% Inhibicin de radicales libres Vitamina C

Total

200

Cuenta Suma Promedio Varianza

4,0000 324,1667 81,0417 1,2153

8,0000 639,5834 79,9479 1,9562

Cuenta Suma Promedio Varianza

100

4,0000 312,0833 78,0208 0,1591

4,0000 307,0833 76,7708 0,1591

8,0000 619,1666 77,3958 0,5828

Cuenta Suma Promedio Varianza

50

4,0000 221,6667 55,4167 0,3472

4,0000 254,1667 63,5417 0,2894

8,0000 475,8334 59,4792 19,1345

Cuenta Suma Promedio Varianza

Total

4,0000 105,0000 26,2500 0,3472

4,0000 245,4167 61,3542 0,0434

8,0000 350,4167 43,8021 352,2540

Cuenta Suma Promedio Varianza

16,0000 954,1667 59,6354 490,8073 ANLISIS DE VARIANZA Grados de Promedio de los F libertad cuadrados 3 1 3 24 2284,8808 6720,5122 975,3480 2868,7877 544,6617 1602,0117 0,3400

16,0000 1130,8334 70,6771 75,6452

Origen de las variaciones Muestra Columnas Interaccin Dentro del grupo Total

Suma de cuadrados 6854,6425 975,3480 1633,9852 8,1597

Probabilidad

3,2141E-35 1,7207E-26 9,1072E-28

Valor crtico para F 3,0088 4,2597 3,0088

9472,1353

31

81

Interpretacin: Se determina a la hiptesis como alternativa porque existe diferencia significativa entre el extracto de la planta con respecto al frmaco de referencia (Vitamina C) ya que F calculada es mayor que F tabulada, razn por la cual se puede decir que no se comportan de la misma manera. Esto se debe a que el extracto hidroalcohlico de Mauritia flexuosa (Morete) presentan un porcentaje de Inhibicin radicalaria menor que la Vitamina C (frmaco de Referencia).

% Inhibicin de radical libre vs Concentracin entre Mauritia flexuosa y Vitamina C

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 y = 0,1446x + 52,604 R = 0,9253

% Inhibicion radicalaria

y = 0,3608x + 14,531 R = 0,8846

100

150

200

250

Concentracin ug/mL % Inhibicin de radical libre Morete % Inhibicin de radical libre Vitamina C

Figura 4.24: Comparacin de Actividad Antioxidante

82

4.4.3 Bactris gasipaes (Chonta)

Tabla4.78: Relacin de Concentracin de extracto y el porcentaje de Inhibicin radicalaria

Concentracin ug/mL

% Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta) 42,2764 42,2764 41,4634 41,8699

% Inhibicin de radicales libres Vitamina C

200

82,5000 80,4167 81,2500 80,0000 77,0833 76,2500 76,6667 77,0833 63,7500 63,3333 62,9167 64,1667 61,2500 61,2500 61,6667 61,2500

150

22,3577 23,1707 22,7642 22,7642

100

2,0325 2,0325 2,8455 2,4390

50

-3,2520 -2,0325 -3,6585 -3,2520

83

Anlisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo RESUMEN % Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta) 4 167,8862 41,9715 0,1515 % Inhibicin de radicales libres Vitamina C Total

200 Cuenta Suma Promedio Varianza 150 Cuenta Suma Promedio Varianza 100 Cuenta Suma Promedio Varianza 50 Cuenta Suma Promedio Varianza Total Cuenta Suma Promedio Varianza

4 324,1667 81,0417 1,2153

8 492,0529 61,5066 436,7215

4 91,05691 22,76423 0,11016 4 9,3496 2,3374 0,1515

4 307,08330 76,77083 0,15913 4 254,1667 63,5417 0,2894

8 398,14021 49,76753 833,46186 8 263,5163 32,9395 1070,4642

4 -12,1951 -3,0488 0,4957

4 245,4167 61,3542 0,0434

8 233,2216 29,1527 1185,2998

16 256,0976 16,0061 338,7947

16 1130,8334 70,6771 75,6452

Origen de las variaciones Muestra Columnas Interaccin Dentro del grupo Total

Suma de cuadrados 5446,3040 23911,3371 762,4465 7,8480

ANLISIS DE VARIANZA Grados Promedio de F Probabilidad de los cuadrados libertad 3 1815,4347 5551,7710 3,1722E-34 1 23911,3371 73123,1326 2,5093E-43 3 254,1488 777,2111 5,0170E-24 24 0,3270

Valor crtico para F 3,0088 4,2597 3,0088

30127,9356

31

84

Interpretacin: Se determina a la hiptesis como alternativa porque existe diferencia significativa entre el extracto de la planta con respecto al frmaco de referencia (Vitamina C) ya que F calculada es mayor que F tabulada, razn por la cual se puede decir que no se comportan de la misma manera. Esto se debe a que el extracto hidroalcohlico de Bactris gasipaes (Chonta) presentan un porcentaje de Inhibicin radicalaria inferior a la Vitamina C (frmaco de Referencia).

% Inhibicin de radical libre vs Concentracin entre Bactris gasipaes y Vitamina C

100

% Inhibicion radicalaria

80 60 40 20 0 -20 0 50 100

y = 0,1446x + 52,604 R = 0,9253

y = 0,3185x - 25,885 R = 0,9528

150

200

250

Concentracin ug/mL % Inhibicin de radical libre Chonta % Inhibicin de radical libre Vitamina C

Figura 4.25: Comparacin de Actividad Antioxidante

Prueba t comparacin de la media de dos muestras Se procede hacer una prueba t comparativa entre los % Inhibicin de radical libre entre Mauritia flexuosa (Morete) y Bactris gasipaes (Chonta). Cuando las desviaciones estndar son significativamente iguales

85

Tabla4.79: Datos para realizar Prueba t comparacin de la media de dos muestras Concentracin ug/mL % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) 79,1667 79,1667 78,7500 78,3333 78,3333 77,5000 77,9167 78,3333 55,8333 54,5833 55,4167 55,8333 26,6667 25,4167 26,6667 26,2500
Tabla 4.80: Tabla de prueba F

200

150

100

50

% Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta) 42,2764 42,2764 41,4634 41,8699 22,3577 23,1707 22,7642 22,7642 2,0325 2,0325 2,8455 2,4390 -3,2520 -2,0325 -3,6585 -3,2520

Mauritia flexuosa (Morete) Concentracin Varianza 200ug/mL F calculada F tabulada 95% Concentracin Varianza 150ug/mL F calculada F tabulada 95% Concentracin Varianza 100ug/mL F calculada F tabulada 95% Concentracin Varianza 50ug/mL F calculada F tabulada 95% 0,159 1,051 9,277 0,159 1,445 9,277 0,347 2,292 9,277 0,347 1,428 9,277

Bactris gasipaes (Chonta) 0,151

0,110

0,151

0,496

86

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales a 200ug/mL % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas) 78,8542 0,1591 4 0,1553 0 6 132,3543 6,2727E-12 1,9432 1,2545E-11 2,4469 % Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta) 41,9715 0,1515 4

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales a 150ug/mL % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas) 78,0208 0,1591 4 0,1346 0 6 212,9561 3,6173E-13 1,9431 7,2346E-13 2,4469 % Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta) 22,7642 0,1102 4

87

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales a 100ug/mL % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas) 55,4166 0,3472 4 0,2493 0 6 150,3268 2,9225E12 1,9432 5,845E-12 2,4469 % Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta)

2,3374 0,1515 4

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales a 5Oug/mL % Inhibicin de radicales libres Mauritia flexuosa (Morete) Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas) 26,25 0,3472 4 0,4215 0 6 63,8228 4,9744E10 1,9432 9,9487E10 2,4469 % Inhibicin de radicales libres Bactris gasipaes (Chonta)

-3,0488 0,4957 4

88

Interpretacin: Se determina que la hiptesis es alternativa debido a que existe diferencia significativa entre el extracto de la plantaMauritia flexuosa (Morete) con respecto al de Bactris gasipaes (Chonta) ya que el valor de t calculada es mayor que el de t tabulada, razn por la cual se establece antioxidantes que no se comportan de la misma manera. En otras palabras estos extractos de plantas, a pesar de tener caractersticas similares, la Mauritia flexuosa (Morete) tiene mayor actividad antioxidante que Bactris gasipaes(Chonta)como se puede que son agentes

corroborar en los porcentajes obtenidos.

89

CAPTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones:

La planta que presento mayor actividad antioxidante es Dononea viscosa (Chamana) debido a que, a las concentraciones presenta una actividad de: 200ug/mL de 138.43%; a 150ug/mL de 106.14%; a 100ug/mL de 72.9167% y a 50ug/mL de 17.91%. La actividad antioxidante de Mauritia flexuosa (Morete) a las concentraciones presenta una actividad de: 200ug/mL de 78.85%;a 150ug/mL de 78.02%; a 100ug/mL de 55.41% y a 50ug/mL de 26.25%. La Bactris gasipaes (Chonta) a las concentraciones presenta unaactividadantioxidante de: 200ug/mL de 41.97%; a 150ug/mL de 22.76%; a100ug/mL de 2.33% y a 50ug/mL no presenta actividad anitioxidante. La actividad antioxidante de la Vitamina C (Frmaco de referencia) a concentraciones similares de los extractos de planta es de: 200ug/mL de 81.04%; a 150ug/mL de 76.77%; a 100ug/mL de 63.54% y a 50ug/mL de 61.35%. En base a lo anteriormente expuesto se concluye, que el extracto de planta de la Dononea viscosa (Chamana), supera el porcentaje de Inhibicinantiradicalaria de la vitamina C, patrn de referencia, mientras que la Mauritia flexuosa (Morete) tuvo un porcentaje de inhibicin similar a la vitamina C, y la Bactris gasipaes (Chonta) tuvo un porcentaje de inhibicin mucho menor a la vitamina C. El extracto

de plantaOpuntia soederstromiana (Tuna roja)no demuestra

actividad

antioxidantecon el mtodo 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH)debido a

que el rango de

absorbancias durante el ensayo invitro con esta tcnica , es (0.4570-0.5080) superior al valor del reactivo 0.240,a pesar de tener metabolitos con esa posible actividad

90

 Por los resultados obtenidos en Opuntia soederstromiana (Tuna roja) se concluye que ms bien provoca una mayor oxidacin del reactivo 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). Los resultados la investigacin fitoqumica y cromatogrfaca ,del el extracto etanlico total deOpuntia soederstromiana (Tuna roja), permite determinar en forma abundante la presencia de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides y taninos, y de baja concentracin las saponinas. La investigacin fitoqumica y la cromatogrfca del extracto etanlico total deDononea viscosa (Chamana), permite determinar la presencia de abundante concentracin, de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides, taninos y saponinas. La investigacin fitoqumica y cromatogrfcadel el extracto etanlico total deBactris gasipaes (Palma de chonta), determina la presencia de abundante concentracin de los siguientes metabolitos secundarios: flavonoides, taninos hidrosolubes y esteroles y de baja concentracin las saponinas. Los resultados de la investigacin fitoqumica y cromatogrfca del extracto etanlico total deMauritia flexuosa(Morete), determina la presencia de abundante concentracin de los siguientes metabolitos secundarios: esteroles, flavonoides, y de baja concentracinlas saponinas.

Los resultados de la investigacin fitoqumica preliminar de los extractoshidroalcohlicos de

las plantas: (Opuntia soederstromiana, Dononea viscosa,Bactris gasipaes, Mauritia flexuosa,) demuestran en forma mayoritaria la presencia de: Esteroles, flavonoides y taninos, por lo tanto se puede concluir que cada una de las plantas presentan metabolitos o principios activos que pueden ser antioxidantes lo que permite justificar la actividad atribuida a la planta.

91

5.2. Recomendaciones: Para determinar la actividad antioxidante de la planta Opuntia soederstromiana (Tuna roja) se debera aplicar otra tcnica con un reactivo comoDecoloracin del Catin Radical ABTS, que posiblemente no interfiera con algn compuesto presente en dicha planta ya que no se puede descartar su actividad antioxidante en su totalidad, ya que si presenta compuestos que pueden tener dicha actividad . El empleo de otros mtodos de extraccin para evitar una posible degradacin o cambio qumico, de los compuestos con actividad antioxidante en estudio ya que eso puede influir en su resultado. Finalmente, se recomienda que este trabajo se use como base para futuras investigaciones por los resultados obtenidos sobre la actividad antioxidante.

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ANEXOS Anexo 1: Separacin de extractos hidroalcohlicos de: Mauritia flexuosa(Morete), Opuntia soederstromiana (Tuna roja) y Dononea viscosa (Chamana).

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

Separacin de extracto hidroalcohlico de: Bactris gasipaes (Palma de chonta)

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

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Anexo 2: MARCHA FITOQUIMICA Mauritia flexuosa (Morete): Flavonoides, taninos y Saponinas

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

Opuntia soederstromiana (Tuna roja): Flavonoides, taninos y Saponinas

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

Esteroles

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

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Dononea viscosa (Chamana): Flavonoides, taninos y Saponinas

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20 Bactris gasipaes (Palma de chonta): Flavonoides, Saponinas Taninos

Nota: Imagen tomada el da: 2012-11-20

Nota:Imagen tomada el da: 2012-11-20

Anexos 3 : Preparacin del reactivo 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo(DPPH)

Nota:Imagen tomada el da: 2012-11-20

Nota:Imagen tomada el da: 2012-11-20

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Anexo 4: Soluciones de vitamina C (Referencia)

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14 Anexo5: Soluciones de los extractos de planta: Mauritia flexuosa(Morete)Opuntia soederstromiana (Tuna roja)

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

Dononea viscosa (Chamana Bactris gasipaes (Palma de chonta)

Nota: Imagen tomadas el da: 2012-12-14

Nota: Imagen tomadas el da: 2012-12-14

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Anexo 6: extractos de planta: Mauritia flexuosa (Morete), Opuntia soederstromiana (Tuna roja), Dononea viscosa (Chamana y Bactris gasipaes (Palma de chonta) y el reactivo 1,1difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH )

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

Anexo7: DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Cambio de color de la mezcla entre los extractos de planta y el reactivo picrilhidrazilo (DPPH ) luego de los 30 minutos de terminada la reaccin Opuntia soederstromiana (Tuna roja) 1,1-difenil-2-

Nota: Imgenes tomadas el da: 2012-12-14

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Dononea viscosa (Chamana

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

Mauritia flexuosa(Morete)

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

Bactris gasipaes (Palma de chonta)

Nota: Imagen tomada el da: 2012-12-14

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