BANCO DE MXICO-FIRA CENTRO DE DESARROLLO TECNOLOGICO TEZOYUCA UNIDAD DE BIOTECNOLOGA. GERMINACION DE SEMILLAS IN VITRO DE ORQUIDEAS Phalaenopsis spp. BIOL.

RICARDO A. FLORES OLASCOAGA INTRODUCCIN La propagacin de orqudeas a partir de cultivo de tejidos ( in vitro) es un tema de importancia por varias razones: son flores muy solicitadas en el medio hortcola ornamental, principalmente por las floreras, y creemos que si la demanda en el mercado interno no est satisfecha, la del mercado externo menos an. Mxico a pesar de ser uno de los pases ms ricos en especies de orqudeas, desafortunadamente, la mayora son colectadas de su hbitat natural en grandes cantidades. La creacin de hbridos mexicanos y el mejoramiento de los mismos ; la produccin de volumen suficiente de variedades de importancia industrial como la vainilla, por ejemplo; el rescate de especies en vas de extincin, que con metas muy ambiciosas y a mayor plazo, quiz permitiese la repoblacin de zonas que han sido saqueadas, que an lo siguen haciendo. Cuando escuchamos la palabra orqudea, a nuestra mente vienen de inmediato la imagen de alguna de estas bellas y exquisitas flores, conocidas en nuestro medio como flores exticas; y calificarlas de maravillosas es porque realmente lo son, aunque la mayora son epfitas, las hay terrestres, subterrneas y aun parasticas y saprofitas, adquiriendo este carcter por tener muy poca o nula clorofila. El color de sus flores desde el blanco hasta el casi negro, pasando por todos los de la escala cromtica. La estructura tan tpica es tambin nica, as como sus formas pero es quiz en sus semillas y en su germinacin donde se encuentran las caractersticas ms exticas de estas plantas. Hasta el siglo pasado, se tuvo la certeza de que las semillas de orqudeas no germinaban, considerndoseles como estriles o no viables. La propagacin era nicamente por divisin de mata o por separacin de las mismas, lo que limit su multiplicacin. No fue si no hasta 1921, cuando Lewis Knudson se interes en la germinacin de semillas de orqudeas, y en base a un trabajo previo sobre la

influencia de los carbohidratos en las plantas verdes analiz el salep encontrando en su composicin 48% de un mucilago, 27% de almidn, 5% de protenas y algunos carbohidratos simples como azcares y sales minerales solubles; y partiendo del conocimiento de que los hongos invertan la sacarosa; concluy que si los hongos hacan posible la germinacin de estas semillas era porque desdoblaban los almidones, pentosas, substancias nitrogenadas y tal vez producan compuestos estimulantes del crecimiento. Prepar entonces un medio de cultivo con azcar y minerales solubles, solidificndolo con agar y sembr en el semillas de los gneros: Cattleya, Laelia, y Epidendrum, tambin con xito. Otros investigadores, ya con el medio de Knudson o con otros que ellos prepararon confirmaron exitosamente el importante descubrimiento de Knudson. De esta manera, se ha considerado que Knudson fue quin contribuy ms que nadie al desarrollo de la orqudeo logia, abrindole amplsimos horizontes y enriqueciendo la biotecnologa. La reproduccin sexual de las orqudeas; es decir a partir de semillas, asistido por tcnicas biotecnolgicas, tiene sus desventajas, una de las cuales es la segregacin de caracteres de las plantas obtenidas por semilla. Ante lo cual debe tenerse en cuenta que se deben germinar semillas de lneas puras.

METODOLOGA PROPUESTA POR EL CENTRO DE DESARROLLO TECNOLGICO TEZOYUCA

GERMINACIN in vitro DE SEMILLAS DE ORQUDEAS La siguiente metodologa est basadas en experiencias propias generadas a travs de los aos en gneros como: Phalaenopsis, Cattleya, aunque es aplicable a la mayora de los gneros ms conocidos. SELECCIN DE LAS PLANTAS MADRES La seleccin de plantas elites debe ser realizada por personal con experiencia en conocimiento y manejo de orqudeas. Estas plantas deben presentar las mejores caractersticas agronmicas; buena consistencia, buen nmero de flores (8-10 en el caso de Phalaenopsis), mayor longitud del pednculo, el color y su tamao de la flor. Adems dichas plantas deben de encontrase lo ms sanas posibles. Las orqudeas seleccionadas se deben de etiquetar, registrando las siguientes caractersticas: clave de la planta, color de la flor, nmero de flores, y estado fenolgico. Esto con la finalidad de no caer en confusiones una vez que se maneje en el laboratorio. El numero de plantas seleccionadas depender de los objetivos que particularmente se tengan, pero en trminos generales recomendamos no menos de 5 plantas elites. MANEJO DE PLANTA ORIGINAL En el manejo de la planta original hay que tener presente dos consideraciones principales. Una es reducir el potencial de contaminacin por hongos, bacterias y otros organismos patgenos. Y otra, es el control de las condiciones fsicas y qumicas tales como temperatura, humedad relativa, intensidades lumnicas y nutricin, que en conjunto nos deben de caracterizar un buen desarrollo de nuestras plantas madres. Dentro del invernadero de planta original se busca un espacio donde puedan tener las condiciones apropiadas, para el crecimiento de las plantas, de tal manera que se colocan en la parte cercana al muro hmedo, para darle las condiciones ambientales similares a las que estaban acostumbradas.

Tanto para Phalaenopsis como para Cattleya son plantas que requiere cuidado en el color de sus hojas y la produccin de las flores. El color de las hojas debe ser verde hierba; no debe tener ni una tonalidad ni demasiado oscura, tendiente al verde botella por falta de luz, ni excesivamente clara, tendiente al amarillo por exceso de ella. La iluminacin adecuada es del 70%. La humedad relativa ptima o recomendable es al 60%. La escasez de luz produce plantas dbiles, susceptibles de ataques parasitarios de todo tipo y sobre todo de falta de flores. La produccin, durante el ao es de dos inflorescencias por lo menos. (Ver fgura 02)

Figura 02. Inflorescencias de Phalaenopsis El sustrato que recomendamos es que est compuesto por 70 % de corteza de rbol, 30 % de peat moss y una pequea capa de grnulos de unicel; En cuanto al riego este debe de ser tres veces por semana. Si el sustrato se presenta muy saturado de agua se recomienda suspender espaciar ms los riegos para disminuir problemas fitopatolgicos. Para conservar sano el material vegetal es necesario aplicar antibiticos agrcolas tales como el Agrimicin 500; utilizando 2.5 gr/l y el Aderex con 5 mg/l; as como cualquier fungicida de amplio espectro a dosis comerciales. Todo en combinacin y por lo menos 1 vez cada semana. POLINIZACIN Una vez que las plantas han empezado a florecer, y cuando el estigma se encuentra receptivo se lleva a cabo la polinizacin, apoyndose para esto de un par de pinzas de diseccin.

Si la polinizacin fue correcta pocos das despus de haber realizado esta la flor senece y cae, este es el mejor indicador de que la cpsula, es decir el fruto de ha formado. El tiempo de madurez de la cpsula es muy variable sin embargo a continuacin se da una lista de especies y tiempo de madurez de cpsula. Gnero Bulbophyllum Calanthe Cattleya Coelogyne Cymbidium Cypripedum Dendrobium Epidendrum Laelia Masdevallia Miltonia Odontoglossum Paphiopedilum Phalaenopsis Stanhopea Vanda Tiempo de madures (meses) 3 4 11 13 10 3.5 12 3.5 9 3.5 9 7 10 6 7 20

ETAPA I. ESTABLECIMIENTO DE CULTIVO ASPTICO En el Centro de Desarrollo Tecnolgico Tezoyuca contamos con los protocolos para la germinacin de semillas de orqudea; tanto para Cpsulas cerradas, como para abiertas. Cpsulas Cerradas. Se utiliza como inculo cpsulas cerradas, conteniendo semillas maduras, esto se reconoce al observar el cambio de tonalidad verde de la cpsula a un color ms claro o ligeramente obscuro, aunque en algunas especies el cambio no es fcilmente apreciable por lo que recomendamos respaldarse en el nmero de meses a partir de la polinizacin (ver cuadro anterior). OBTENCIN DEL EXPLANTE

Las cpsulas previamente identificadas como maduras deben ser cortadas por la maana, el corte debe de realizarse con una navaja muy filosa. A las cpsulas se les coloca una etiqueta donde lleve la identificacin de la planta madre, la misma identificacin acompaar a las semillas durante todo su desarrollo tanto en el laboratorio como en aclimatacin. DESINFECCIN DE LOS EXPLANTES El siguiente paso es llevarlas al rea de procedimientos no estriles del laboratorio. Donde se lavaran con abundante jabn y agua de la llave, si la cpsula esta an rgida esta se puede tallas con alguna esponja o fibra, pero si la cpsula se encuentra muy frgil es suficiente con la inmersin en el agua jabonosa. Despus de 5 minutos con jabn se enjuagan con agua de la llave. A partir de este momento las cpsulas deben ser llevadas a la campana de flujo laminar. En este lugar las cpsulas se flamean. Esto se consigue sumergindolas en alcohol de 96 para despus pasarlas por el mechero encendido, donde inmediatamente la cpsula se prendera y arder por pocos segundos esta actividad puede ser repetida dos o tres veces. Es importante mencionar que si la cpsula presenta una ligera abertura, este paso debe ser omitido, ya que el fuego puede causar la muerte de algunas semillas. Despus del flameado, se corta parte de la punta y el base de la cpsula. Las cpsulas una vez que se les hizo los costes debidos deben ser sumergidas en una solucin de cloro 15% v/v , donde permanecern por espacio de 20 minutos, tiempo suficiente para garantizar la desinfestacin de las cpsulas, durante este tiempo se debe tener cuidado de que la cpsula se encuentre todo el tiempo en contacto con la solucin de cloro. Despus de los 20 minutos las cpsulas se enjuagan tres veces con agua desmineralizada esterilizada. SIEMBRA DE EXPLANTES Las cpsulas ahora son cortadas con la ayuda de un bistur provisto de una navaja del numero 10, el corte debe ser a todo lo largo de la cpsula, procurando que de una sola pasada el corte sea lo suficientemente profundo para dividir en dos la cpsula y dejar al descubierto las semillas. Las semillas de orqudea tienen una apariencia de polvo (talco) de color blanco (aunque en algunos casos por ciertos factores las semillas se tornan color caf claro).

Los conglomerados de semillas que se aprecian fcilmente pueden ser tomados con pinzas previamente esterilizadas, para despus esparcir el conglomerado por toda la superficie del medio de cultivo. Para aprovechar todas las semillas y no solo las que se observan con facilidad; sujetando con unas pinzas tambin previamente esterilizadas una mitad de la cpsula, esta se raspa sobre el medio de cultivo para que todas las semillas caigan en el, el raspado se facilita con la ayuda del bistur por su parte no filosa. El raspado debe dejar a la cpsula con escasos rastro de semillas.

INCUBACIN Una vez sembradas las semillas estas se incuban en un periodo de cuatro a cinco meses; a temperatura de 24 centgrados en intensidades lumnicas de 1500 lux para obtener respuesta. MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO El medio de cultivo utilizado para la germinacin de orqudeas es el que esta compuesto por: las sales de Knudson utilizadas al 100% + Tiamina HCL 0.200 mg/l + Niacina 0.200 mg/l + ANA (cido naftalencetico) 1.0 mg/l + Kinetina (N6- furfurilaminopurina) 1.0 mg/l + Azcar 20 g/l + Peptona 2 g/l + Pltano 40 g/l + Manzana 40 g/l + Carbn vegetal 2 g/l + Agar 7g/l. Ajuntando el pH del medio de cultivo a 5.7 Cpsulas abiertas En algunas ocasiones por diferentes situaciones, no es posible contar con cpsulas cerradas, por lo que se hace necesario desarrollar una tcnica especfica para esterilizar las semillas, sin provocarles la muerte. Para conseguir la desinfeccin de las semillas debemos crear una cpsula artificial, esta cpsula se hace cortando un rectngulo de papel filtro de 6 cm de largo por 3 cm de ancho, como se muestra en la siguiente figura
6 cm

3 c m

Este rectngulo de papel filtro se doblara por la mitad formando un cuadrado con doble capa

Los bordes laterales se doblan y sellan con la ayuda de una engrapadora

A partir de este momento debemos preparar las semillas, extrayndolas completamente de la cpsula, mediante un raspado de la misma, las semillas deben ser depositadas sobre una papel de preferencia obscuro para identificarlas fcilmente. Contando con la semillas se introduce por la nica parte abierta una ligera pelcula que cubra escasamente la base del sobre ahora formado; esta actividad se facilita usando una microesptula.

Estando las semillas dentro se sella con una grapa el lado por donde se introdujeron las semillas. En este momento la cpsula artificial esta completamente formada y resta nicamente hacer una serie de agujeros con una

aguja de cocer; esto con la finalidad de que penetre cierta cantidad de desinfectante. DESINFECCIN Las cpsulas artificiales son llevadas a la cmara de flujo laminar donde se sumergirn en una solucin de cloro al 10% durante 15 minutos, una vez transcurrido este tiempo las cpsulas artificiales se enjuagan tres veces con agua destilada esterilizadas para eliminar la solucin de cloro. SIEMBRA DE LOS EXPLANTES Despus de la serie de enjuagues las cpsulas artificiales se abren rompindolas con la ayuda de las pinzas de diseccin previamente esterilizadas. Ahora con mucho cuidado con las mismas pinzas se toman pequeas porciones de semillas y se esparcen sobre la superficie del medio de cultivo. MEDIO DE CULTIVO. El medio de cultivo utilizado es el mismo que el utilizado para germinacin de semillas provenientes de cpsulas cerradas; es decir el que esta compuesto por: las sales de Knudson utilizadas al 100% + Tiamina HCL 0.200 mg/l + Niacina 0.200 mg/l + ANA (cido naftalencetico) 1.0 mg/l + Kinetina (N 6furfurilaminopurina) 1.0 mg/l + Azcar 20 g/l + Peptona 2 g/l + Pltano 40 g/l + Manzana 40 g/l + Carbn vegetal 2 g/l + Agar 7g/l. Ajuntando el pH del medio de cultivo a 5.7 A partir de este momento las semillas reciben los mismos manejos y condiciones de cultivo que las establecidas a partir de cpsulas cerradas ETAPA II. DESARROLLO DE LOS PROTOCORMOS PARA PLNTULAS DE ORQUIDEAS DE LA ESPECIE DE Phalaenopsis. FORMAR

Despus que las semillas hallan pasado por su periodo de germinacin in vitro y se hayan formado pequeos protocormos se subcultivan a otro medio el cual sta estructurado por: sales minerales de MS + inositol (100 mg/l) + 2 4D (1.0 mg/l) + kinetina (5.0 mg/l) + azcar (30 gr/l) + carbn activado (2.0 gr/l) + agar (7.5 gr/l) y ph de 5.7. Dichos lotes pasan por tres etapas las cuales son: A).Diferenciacin de protocormos que consiste en subcultivarlos de dos a tres veces en frasco tipo gerber en medio de cultivo fresco cuya formula es la misma que se menciono anteriormente. El objetivo de estos subcultivos es disminuir la densidad poblacional y propiciar la diferenciacin y crecimiento de los protocormos as como la formacin de plntulas, cabe mencionar que como las semilla tienen la apariencia de talco en el momento de la siembra no se puede calcular el numero de semillas que se ponen en cada frascos es por eso que cuando empiezan a

germinar quedan muy amontonadas y corre el riesgo que entren en competencia y empiecen a morir. (ver foto 1)

FOTO 1.- SEMILLAS DE ORQUIDEAS GERMINADAS

(B).- La otra etapa es el crecimiento de plntulas aqu es donde se propicia el crecimiento de tal manera de obtener la presentacin final y este proceso se lleva a cabo en el mismo medio de cultivo que se menciono al inicio y en diferentes contenedores tales como: la botella lechera, las bolsas de polipapel (de plstico), matraz de 500 ml y los topers (botes de polipropileno de 500 ml ). En el caso de la siembra en botella lechera (ver foto 2) es la ms laboriosa ya que para la actividad operativa se necesitan pinzas de diseccin de 20 cm de longitud y estas permiten mas el riesgo de contaminacin, la ventaja es que en este contenedor favorece mas la traslucides de luz y por otro lado la superficie de siembra es mayor. Respecto a la densidad de siembra se pueden manejar de 12, 14 y hasta 18 plntulas y esto va depender de la presentacin final se quiera tener con respecto al tamao. El uso de la siembra en bolsa de plstico (ver foto 3) permite tambin el crecimiento de plntulas sus ventajas es que es el contenedor mas barato y adems desechable y que para su transporte es ms fcil, la desventaja es que para la siembra se dificulta mas ya que se tiene que arremangar la boca de la bolsa para facilitar el poner a los brotes en la superficie del medio de cultivo por otro lado la superficie disponible de siembra es mas reducida que en botella sembrando entre 12 y 14 plntulas. Para sellar a la bolsa se dobla la boca como cuello de cisne y se amarra con sellador en seguida se lleva al cuarto de incubacin y se cuelgan a modo que la superficie este descansando sobre la base del estante. La utilizacin del matraz de 500 ml (ver foto 4) para el desarrollo de plntulas es el mas fcil de manejar ya que el cuello que es mas angosto y por otro lado la traslucides se favorece mas, aqu la desventaja es que dicho contenedor es el mas caro y por otro lado la superficie disponible es mas reducida, sembrando entre 12 y 14 plntulas. Por otro lado utilizar este contenedor los riesgos de la contaminacin es menor.

Tambin se maneja el toper de polipropileno, este es el mas accesible para su manejo y los riesgos de contaminacin tambin son menores, por otro lado la superficie disponible para la siembra tambin se eleva depositando en cada bote entre 14 y 18 plntulas. Las desventajas son las siguientes: el costo es levado y por otro lado su traslucides disminuye, aunque cabe mencionar que el crecimiento no se afecta.

FOTO 2.- BOTELLA LECHERA

FOTO 3.-BOLSAS DE PLASTICO

FOTO 4.- MATRAZ

A las plntulas que se siembran en cualquier de los contenedores antes mencionados se mantienen en incubacin alrededor de 4 meses controlando la temperatura entre 26 y 28C y durante este periodo se logra obtener plntula ya enraizada entre 1 y 3 cm de longitud. Existen algunos problemas durante este periodo los cuales son la contaminacin y oxidacin, en el caso del primer problema se presenta ya sea por el manejo del sembrador o por subcultivar algn frasco original contaminado cabe mencionar que la contaminacin puede ser causada por hongos o bacterias. En el caso de la oxidacin consiste en ponerse de color caf los tejidos ocasionado por la muerte de clulas as como tambin reflejndose en la muerte de protocormos y plntulas., este problema fue el que se nos presento con mayor frecuencia. Una de las desventajas que tiene la tcnica es la viabilidad y la variabilidad de las semillas es por eso comentar la importancia de seleccionar a progenitores compatibles ya que si no es as nos pueden dar semillas no viables o protocormos con falta de crecimiento y muy susceptibles a la oxidacin. COSECHA Y EMPAQUE DE PLNTULAS Una vez que se tengan a los brotes con un tamao mayor de un centmetro y que adems hallan cumplido su periodo de incubacin se proceder a la cosecha de plntulas. Esta actividad se puede llevar a cabo en el laboratorio o en el invernadero (ver foto 5) y consiste en:

Sacar a las plantas de los contenedores ponerlas en una franela humedad. Se les quita los residuos de agar que tienen las races. Se clasifican en tamaos. Se sumergen durante tres minutos en una solucin de Agrimicin 500 para que se desinfecten. Enseguida se envuelven en un papel hmedo dando la forma de un taco y teniendo de no maltratar a las races. Se meten en una bolsa de plstico as como tambin se etiquetan y se engrapa a la bolsa. Finalmente se acomodan en una caja trmica conservando la temperatura a la del agua. Es as como quedan listas las plantas para su transporte, cabe mencionar que se recomienda no matenerlas mas de 24 hrs en su empaque es por eso de la necesidad de ponerse de acuerdo con el personal del transplante para que tenga listo los materiales y de inmediato se proceda a la plantacin a suelo y empiece su periodo de aclimatacin.

FOTO 5.-COSECHA CLASIFICACION Y EMPAQUE DE PLNTULAS