ESTEQUIOMETRA

DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO
ESTEQUIOMETRA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
La conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de
inters industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los
recursos renovables.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa
debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulacin de
medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operacin de las plantas
industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del
medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que
puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde
este punto de vista, resulta de sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir
rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un
biorreactor. Los balances de materia y energa resultan a tal fin de suma utilidad y su
empleo se ha extendido ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas.
La aparicin en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables de
los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor =
recipiente en el cual se cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la
aplicacin de balances de materia y energa. la produccin de biomasa (biomasa =
concentracin de microorganismos expresada en gramos de clulas secas / litro de cultivo),
consumo de las fuentes de C y energa, de nitrgeno y Oxgeno y las produccin de CO2 y
desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de
medidas experimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y
energa.
Antes de proceder a considerar el sistema de anlisis propuesto, es conveniente
introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre algunas
regularidades observadas experimentalmente en el cultivo de microorganismos.
En primer lugar se ha encontrado que la composicin elemental de un importante
nmero de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se mantiene
prcticamente constante; as podemos definir un microorganismo promedio (composicin
standard) como aquel cuya composicin es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N =
10,85, donde el aproximadamente 5 % restante est representado por sales. Es importante
recalcar que si bien la composicin elemental promedio de la biomasa se mantiene
prcticamente constante, la concentracin intracelular de protenas, RNA y dems
constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso
entre diferentes estados del cultivo de un mismo microorganismo.
Teniendo en cuenta esta composicin media, podemos escribir lo que sera la
frmula mnima de nuestro m.o. promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la que est
representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prcticos definir 1 C-mol de
biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 1 tomo gramo de C. As pues
tenemos que:
1 C- mol de biomasa =
x x
= 25,8 g
12 1 79 16 0 5 14 0 2
0 95
+ + + , , ,
,
Para conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de biomasa
debemos conocer su composicin elemental y en base a dicha composicin, el peso de 1
cmol. En trminos generales la masa resulta ser:
n . Pcmol g
de biomasa.
De forma anloga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1 C-mol de
sustrato (entindase por sustrato fuente de carbono y energa, FCE), 1 C-mol de fuente de
N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de glucosa estar representado por
CH2O y pesar 30 g, y para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH3O0,5) pesar 23 g.
Otro concepto que debemos introducir es el de grado de reduccin o grado de
reductancia, el cual ser de gran utilidad en el momento de plantear nuestros balances de
materia y energa.
Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidacin:
C + O2. CO2 = 4
CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O = 8
CO + 0,5 O2 CO2 = 2
CH2O + O2 CO2 + H2O = 4
CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O ` = 6
Podemos observar que los distintos valores de que figuran a la derecha de cada
ecuacin coinciden con el nmero de electrones disponibles que fueron transferidos desde
el compuesto a oxidar al oxgeno. En general se expresa en trminos de n de e
-
disponibles / c-mol.
Para calcular el valor de de un determinado compuesto se toman los grados de
reduccin 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del CO2, H2O y NH3
no se tienen e
-
disponibles (estados de referencia), luego CO2 = H2O = NH3 = 0. Se considera
adems que el estado de oxidacin predominante del N en la biomasa es -3. En trminos
generales para un compuesto de frmula CHaObNc, su grado de reduccin vendr dado por:
= 4 + a - 2b - 3c (1)
Si tenemos un compuesto cuya frmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma
CH O N
i
h
j
h
k
h
Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su x (donde el subndice x indica
biomasa) ser:

x
= 4,19
e disp.
C- mol
-
Este valor, junto a Pcmol = 25,8 son dos de las regularidades a las que nos
habamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser empleados en balances de
materia y energa en aquellos casos en que se desconoce la composicin de la biomasa sin
temor de incurrir en errores groseros de clculo. Otras regularidades observadas en el
cultivo de m.o. es que el calor de reaccin por mol de e
-
transferidos al O2 es relativamente
constante para la oxidacin de una amplia variedad de molculas orgnicas y corresponde a
27 Kcal/mol e
-
disponibles transferidos al O2.
Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia y
energa, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reaccin qumica
simple.
2
r = velocidad de
reaccion
2 2 2
1 + + +y + + ( )
X P CO
Cmol S a mol FN b O y X y prod CO w H O q calor +
Donde X significa biomasa, cualquiera sea su naturaleza.
Debemos hacer notar que los coeficientes estequiomtricos estn referidos a 1 C-
mol de fuente de C y energa. As pues:
y
C mol de X
C mol de fte de C y E
x

-
- .

1
]
1
lo mismo para yp e yCO2.
El balance de carbono para esta reaccin de formacin de biomasa y producto ser:
y y y
x p CO
2
+ + 1
(2)
De igual forma podemos establecer un balance del grado de reduccin:
s + (-4)b = yx . x + yp . p (3)
Reordenando y dividiendo por s obtenemos
4
1
b .
.
s
x x
s
p p
s

+ +
y
y
(4)
o lo que es lo mismo
+ + = 1 (5)
donde =
4b
s

(fraccin de e
-
disponibles de la FCE transferidos al O2)
=
y
x x
s
.

(fraccin de e
-
disp. de la FCE transferidos a la biomasa)
=
y
p p
s
.

(fraccin de e
-
disp. de la FCE transferidos al producto)
Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservacin de la masa y
la energa, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos ms carbono del que
un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los electrones disponibles
del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.
Si asumimos, como ya se mencion, que el calor de reaccin por mol de e
-
disponibles transferidos al oxgeno es constante para un importante nmero de molculas
orgnicas, el primer trmino de la ecuacin (4) nos da la fraccin de energa del sustrato que
evoluciona como calor. Si llamamos qo a esa constante con qo = 27 Kcal/mol e
-
disponibles
transferidos al O2, el calor generado en la ecuacin l vendr dado por:
q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6)
Si conocemos la velocidad de consumo de O2 de nuestro cultivo podemos calcular la
velocidad de produccin de calor y por lo tanto los requerimientos de H2O de enfriamiento
para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor.
El concepto de e
-
disponibles nos brinda un mtodo simple de clculo para chequear
los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar anlisis de
consistencia interna. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con datos obtenidos en el
laboratorio, podemos estimar parmetros no medidos y tener idea de cun confiables fueron
nuestras determinaciones. Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de
los intervalos:
0,94 yx + yp + yCO2 1,06
0,93 + + 1,07
Valores inferiores o superiores a estos lmites de aceptabilidad determinados
estadsticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones experimentales.
En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificacin de la biomasa producida se
efecta gravimtricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa expresado en
g/l (x) correspondiente a la utilizacin de una determinada cantidad de sustrato (s)
(igualmente expresada en g/l) con lo cual definimos nuestro rendimiento en base a sustrato
como Y
x
s
x

al que tomamos como rendimiento global en el que slo se tienen en

cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y sustrato, ms rigurosamente Yx debiera
ser expresado por el lmite x / s con s 0, esto es: Y
dx
ds
x
(observar que el signo
negativo es introducido porque x y s varan en sentido contrario).
Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2 conociendo los
respectivos rendimientos globales y los valores de P cmol de X, S, P y CO2 tal cual vemos a
continuacin:
2 2
x x p CO CO
2

Y ; ; Y

P
P cmol S P cmol S P cmol S
y y Y y
P cmol X P cmol P PM CO

(7)
Resulta de gran inters conocer los destinos que toma la fuente de C y energa durante el
crecimiento microbiano y la fraccin de la misma empleada por el m.o. para obtener la
energa necesaria para llevar adelante sus funciones metablicas.
Por balance de sustrato:
s = sx + sp + sE (8)
donde S = Sustrato total consumido
Sx = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de biomasa
Sp = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de producto
SE = Fraccin de sustrato utilizado para obtener energa
por consiguiente:
SE = S - Sx - Sp
SE = S + X

.. P.

P cmol S P cmol S
P cmol X P cmol P
+
fE = 1 - yx - yp =
y
CO
2
fE : fracc. de FCE destinada a la obtencin de E. (11)
Experimentalmente lo que se hace es determinar la produccin global de CO2 y
conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido y calcular SE por estequiometra. Este
mtodo presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen reacciones enzimticas que
incorporan O2 a determinados componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener
energa) no obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la fte.
de C y E; y el ms importante es que debemos suponer que x s, caso contrario se
introduce un grosero error en el clculo.
CINTICA
DEL CRECIMIENTO

CINTICA DEL CRECIMIENTO
Hasta aqu hemos visto las relaciones estequiomtricas que existen en los cultivos
microbianos, y cmo a travs de ellas es posible obtener informacin del destino que tiene la
fuente de carbono y energa. Las ecuaciones (2) y (4), resumen toda la informacin que es
posible obtener mediante los balances de materia y energa, pero nada dicen acerca de la
velocidad, r, con que transcurre el proceso; por lo que ahora centraremos la atencin en
este aspecto.
Convendr antes definir la forma en que expresaremos las distintas velocidades. De
este modo llamaremos a:
rx =
dx
dt
; velocidad de crecimiento microbiano (o, brevemente, velocidad de crecimiento) y
las unidades sern:
Cmol biomasa
L . h
del mismo modo:
rs =
ds Cmol FCE

dt L . h
_

,
= velocidad de consumo de sustrato
rp =
dp Cmol de producto

dt L . h
_

,
= velocidad de formacin de producto.
r
2
2
O
2
O
d
mol O

dt L . h

,
= velocidad de consumo de O2
r
2
2
CO
2
CO
d
mol CO

dt L . h
_

,
= velocidad de produccin de CO2
Estas velocidades tambin pueden ser expresadas en
g
L . h
; y en este caso, para
diferenciarlo del anterior, las denotaremos con R. Por ej.:
Rx =
dx gramos de biomasa
;
dt L . h
Anlogamente tendremos: Rs, R
O
2
, etc.
La conversin entre rx y Rx estar dada por:
Rx = 25,8 . rx
Anlogamente:
Rs =
g de S
c mol de S
. r
s
R
O O
2 2
. r 32.
, etc.
Velocidades especficas:
Corresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de biomasa, es
decir:
r
x
x
= ; velocidad especfica de crecimiento.
r
x
s
= qs ; velocidad especfica de consumo de sustrato (s puede ser la fuente de carbono y
energa o cualquier otro componente del medio)
r
x
q
O
O
2
2
; velocidad especfica de consumo de O2.
r
x
q
p
p
; velocidad especfica de formacin de producto.
etc.
Las velocidades especficas suelen brindar informacin acerca de cul es la actividad
metablica del microorganismo (o de la biomasa) durante el cultivo, ya que el estar referidos
a la unidad de biomasa cualquier modificacin en el valor de , qs, etc. estar indicando que
"algo" est ocurriendo en el metabolismo del microorganismo en cuestin.
De hecho es frecuente que las velocidades especficas varen durante el cultivo, y es
muy comn que por ej. el valor de al principio del cultivo difiera del que se encuentra en
estadios posteriores. Lo mismo vale para qs,
q
O
2
, etc.
SISTEMAS DE CULTIVO
BATCH
CONTINUO
Y BATCH ALIMENTADO
CULTIVO EN BATCH
La evolucin del cultivo en el tiempo, sigue una curva tpica la cual recibe el nombre
de curva de crecimiento en batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden
separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables. En primer lugar existe una fase
donde prcticamente no hay divisin celular pero s aumento de la masa individual de los
microorganismos (fase lag o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento
ocurre a velocidad especfica () mxima y constante = m (fase exponencial). Al final de
esta fase se alcanza la mxima concentracin microbiana. Posteriormente hay un rpido
perodo de desaceleracin donde 0 y se entra en la fase estacionaria la cual es
causada por agotamiento de algn nutriente (el sustrato limitante) o bien por acumulacin de
inhibidores. Durante esta fase la concentracin microbiana (o de biomasa) permanece
constante. Finalmente se llega a una ltima etapa donde la concentracin de biomasa
disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo endgeno (fase de
decaimiento).
La duracin de cada una de estas fases es funcin del microorganismo en estudio y
de la composicin del medio de cultivo. En particular la fase lag depende adems de la fase
de crecimiento en que se encuentran las clulas en el momento de ser sembradas y de la
composicin del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si ste es igual a la composicin
del medio en que se van a sembrar y las clulas estn en fase exponencial, la duracin de la
fase lag, en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que
constituye tiempo perdido.
La descripcin matemtica (modelado) de las cuatro fases descriptas es sumamente
compleja y escapa a los fines de esta gua, por lo que slo veremos una ms simple que
slo contempla la fase exponencial y la estacionaria.
De la definicin de obtenemos
rx = . x (12)
donde x = concentracin de biomasa. Hemos visto que vara durante el cultivo, siendo un
valor constante y mximo en la fase exponencial (m) y nulo en la estacionaria. Monod ha
propuesto una relacin muy simple entre el valor de y la concentracin de sustrato
limitante, S, entendindose por ste al componente del medio de cultivo que est en menor
proporcin respecto de las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente
de N, de C, algn aminocido, etc. La ecuacin es:
= m
S
K S
S
+
(13)
A KS se la conoce como Constante de Saturacin, y da una idea de la afinidad que
tiene el microorganismo por el sustrato en cuestin. A menor KS mayor afinidad.
Normalmente KS tiene valores muy pequeos (10
-2
- 10
-3
g/l) por lo que concentraciones
relativamente pequeas de S son suficientes para hacer que:
= m (14)
Reemplazando la ec. (13) en (12) queda:
rx = m
S
K S
S
+
. x (15)
Al principio del cultivo todos los nutrientes estarn en exceso, y en particular el sustrato
limitante tambin, por lo que la ex. (15) se reduce a (fase exponencial)
rx = m x ; o bien:
dx
dt
= m . x (16)
La ec. (16) es fcilmente integrable y si hacemos a t = 0; x = xo (concentracin inicial de
microorganismos) queda:
ln x = ln xo + m t (17)
o bien
x = xo e
m t
(18)
Por tanto en esta fase la concentracin de biomasa aumenta exponencialmente, y
tambin lo hace rx ya que reemplazando: rx = m xo e

m t
A partir de la ec. (17) se puede calcular el tiempo de generacin del microorganismo
(perodo de tiempo en que la biomasa se duplica) haciendo x = 2 xo y nos queda tg =
ln 2
m

A medida que transcurre el tiempo de cultivo, S va disminuyendo (y por tanto rx)

hasta que finalmente S = 0 (fase estacionaria), y
rx = 0 (19)
lo que implica:
x = cte = xf (20)
xf = concentracin final de biomasa.
Si graficamos ln x vs. t se obtiene un grfico como el de la fig.

max
tiempo
L
n

X
Ln X
f
Ln X
0
t
L
De la fase exponencial se calcula m mediante la ecuacin (17). La duracin de la
fase lag, tL, se puede calcular del grfico, o bien haciendo una correccin en la ec. (17).
ln x = ln xo + m (t - tL)
Si tomamos un valor cualquiera de x que corresponda a la fase exponencial, xe,
podemos calcular tL.
tL = te -
l
ln
x
x
m
e
o

Consumo de Sustrato
Hemos visto que el rendimiento se defina como yx = -
dx
ds
dx / dt
ds / dt
r
r q
x
s s


por tanto
rs =
r
y
x
x
(22)
reemplazando en la ec. (22) la ec. (15) queda:
rs =

m
x S
y

S
k S
. x .
+
(23)
A medida que S tiende a cero, rs tambin.
En fase exponencial ser S>> ks y adems x estar dado por la ec. (18), por tanto:

ds
dt
x e
y
m o
x
m
t

(24)
Si a t = 0 es S = So implica:
S = So -
( )
x
y
e
o
x
m
t

1
(25)
La ec. (25) da la variacin de S en funcin de t durante la fase exponencial.
Si se conoce de antemano el rendimiento yx (o Yx) y las concentraciones iniciales de
sustrato y biomasa, es fcil estimar el valor de xf ya que:
x = -Yx . S (26)
x - xo = Yx (S - So) (27)
Si S es el sustrato limitante, se tendr que para x = xf ser Sf = 0, por tanto:
xf = xo + Yx. So (28)
La ec. (27) permite calcular S para un x dado (o viceversa) en cualquier parte de la
curva de crecimiento, siempre y cuando Yx (o yx) se mantenga constante. Alternativamente
la ec. (27) puede emplearse para verificar si tal supuesto se cumple ya que la grfica de (x -
xo) en funcin de (So - S) deber ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible
calcular un rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener
durante el cultivo, empleando slo valores iniciales y finales:
Yx = -
( )
( )
x x
S S
f o
f o

(29)
Consumo de O2
Hemos visto que realizando un balance entre la composicin de los gases que
ingresan y salen del biorreactor se puede calcular r
O
2
. Con este valor y el de la
concentracin de biomasa, x, se puede calcular a distintos tiempos el valor de q
r
x
O
O
2
2
,
con lo cual tendremos una idea de lo que ocurre con la capacidad respiratoria de los
microorganismos durante el cultivo. Al respecto es til estudiar cules son las posibles
causas de variacin de
q
O
2
.
1) Sea yx/o =

x
O
r dt
2
o
t

(30) yx/o = rendimiento de biomasa base a O2 consumido

Al igual que en la ec. (21) podemos hacer:
yx/o =
r
r q
x
O O
2 2

(31)
de donde reemplazando por la ec. (13)
q
y
S
k S
O
m
x/ o s
2

+

(32)
En fase exponencial es S>> ks y
q
y
q
O
m
x/ o
O
2 2

m (33)
es decir que en esta fase
q
O
2
se mantiene constante y con un valor mximo. A medida que
S disminuye,
q
O
2
tambin hasta que virtualmente se hace nulo en la fase estacionaria. Esto
es particularmente vlido cuando el sustrato limitante es la fuente de carbono y energa, ya
que al agotarse sta, los microorganismos se quedan sin combustible y por tanto el
consumo de O2 cesa. No ocurre lo mismo cuando el sustrato limitante es por ej. la fuente de
nitrgeno, pues si bien cuando sta se agote se detendr el crecimiento, nada impide que
los microorganismos sigan respirando ya que cuentan con combustible en exceso.
2) Otra causa que afecta el valor de
q
O
2
es la concentracin de O2 disuelto. Por analoga
con la ecuacin de Monod, se ha propuesto la ecuacin:
q q
C
k C
O O
o
2 2

+
m (34)
donde C = concentracin de Os disuelto.
Al igual que ks, se encuentra que ko es pequeo, y en general valores de C del orden
de 0,8 mg/l (10% de saturacin) son normalmente suficientes para que
q
O
2
=
q
O
2
m. A la
concentracin de O2 disuelto por encima de la cual el valor de
q
O
2
se mantiene constante,
se la conoce como concentracin crtica (Cc).
PARTE EXPERIMENTAL
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae.
Medio de cultivo:
Glucosa ..............................................................................10,00 g/l
Urea ................................................................................... 1,50 g/l
K2HPO4 ............................................................................. 1,00 g/l
MgSO4.7H2O ..................................................................... 0,60 g/l
CaCl2.2H2O ........................................................................ 0,10 g/l
cido ctrico ........................................................................ 0,45 g/l
H3BO3 ................................................................................. 0,10 mg/l
CuSO4 ................................................................................. 0,10 mg/l
KI ........................................................................................ 0,10 mg/l
FeCl3 ................................................................................... 0,10 mg/l
Na2MoO4 ............................................................................. 0,10 mg/l
inositol ................................................................................. 6,00 g/l
biotina .................................................................................. 6,00 g/l
acido flico .......................................................................... 6,00 g/l
pantotenato de calcio ............................................................ 0,80 mg/l
tiamina .................................................................................. 0,80 mg/l
cido nicotnico ..................................................................... 0,80 mg/l
cido p-amino benzoico ......................................................... 0,40mg/l
riboflavina ............................................................................. 0,40 mg/l
piridoxina .............................................................................. 1,60 mg/l
antiespumante ....................................................................... 3 gotas
pH 5,50 (ajustado con HCl o H2SO4 1N)
Volumen de cultivo: 4,0 l
Los fosfatos se esterilizan por calor hmedo (autoclave), fraccionados en un
erlenmeyer con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para preparar 3,7 l de medio
de cultivo, en 500 ml de H2O y se ajusta el pH en 5,50. El resto de los componentes
(excepto la urea y la solucin de vitaminas) se disuelven en 3,2 l. de H2O, los
microelementos se agregan en solucin concentrada 1000 veces a razn de 1 ml/l, se ajusta
el pH en 5,50 y se esterilizan, en autoclave, en el biorreactor.
El tiempo de esterilizacin ser en ambos casos de 15 minutos. La urea se esteriliza
por filtracin. Se prepara una solucin madre con 500 g/l de urea y se esteriliza con
membrana absoluta. Esta solucin se adiciona en proporcin de 6,0- ml por litro de medio de
cultivo.
Las vitaminas se preparan en solucin concentrada 1000 veces, se esterilizan por
filtracin y se adicionan a razon de 1 ml/l de medio.
Inculo: Tres erlenmeyers de 1000 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo diluido 2,5
veces se esterilizan por calor durante 10 min. En este caso para mayor simplicidad se
esterilizar el medio de cultivo completo (excepto la urea y las vitaminas que se adicionarn
en proporcin de 0,5 ml y de 0,1 ml de las soluciones madres). Los erlenmeyers sern
sembrados el da anterior a la realizacin de trabajo prctico con clulas de levaduras
provenientes de un cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspenden fcilmente en
agua. La temperatura de incubacin ser en todos los casos de 30C.
Procedimiento:
1.- Termostatizar el biorreactor a 30C
2.- Conectar el sistema de aireacin al filtro estril del biorreactor.
3.- Conectar el sistema de agitacin del biorreactor. Fijar la agitacin en 600 rpm.
4.- Adicionar en forma estril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del medio de
cultivo contenido en el biorreactor.
5.- Calibrar el electrodo para medir O2 disuelto haciendo pasar por el biorreactor, primero
una corriente de nitrgeno y ajustando la lectura a 0% de saturacin (ajuste del cero) y
luego aire a un caudal de 2 l/min., ajustando con la perilla de calibracin a 100% de
saturacin. En ambos casos, antes de realizar los ajustes, se debe dejar transcurrir 10 a
15 minutos.
Los gases que ingresen al biorreactor debern pasar por el filtro estril.
6.- Calibrar los instrumentos de medida para efectuar el anlisis de los gases a la salida del
biorreactor (analizador de O2 y de CO2).
7.- Trasvasar, en forma estril, los tres erlenmeyers de inculo a otro con salida lateral.
8.- Sembrar el biorreactor y aguardar 2 a 3 minutos
9.- Tomar 15 mL de muestra (descartar antes 2 o 3 mL) y tomar el tiempo CERO. Anotar en
cada caso el volumen de muestra y el de descarte.
10.-Medir el porcentaje de O2 y CO2 en lo gases de salida del biorreactor
Anlisis de las muestras
11.- 10 mL se centrifugan 10 minutos. Guardar el sobrenadante para determinar
concentracin de FCE y producto. Lavar (una vez) con agua destilada el pellet de
levaduras, centrifugar, resuspender las clulas con ms agua destilada y hacer peso
seco a 105C.
12.- Al resto de la muestra medirle:
12.1.- pH
12.2.- DO a 620. La muestra deber diluirse de forma tal de obtener lecturas entre 0,1 y
0,6.
12.3.- Control de contaminacin por observacin microscpica.
13.- Repetir los pasos 9 a 12 cada hora.
14.- Finalizado el cultivo, medir el volumen remanente. Con este dato y los de volumen de
muestra y lavado calcular el volumen de cultivo a la hora CERO, 1; 2, 3; etc. El volumen
obtenido en cada caso ser el utilizado para el clculo de
r
O
2
y
r
CO
2
a los
correspondientes tiempos.
Resultados
Los datos se volcarn en una tabla del siguiente formato y luego se harn las graficas
correspondientes en funcin del tiempo
Hora T pH DO620 X S Vextr Vrem r
O
2
r
CO
2
C.R.
I.- Graficar ln x vs. t. y DO vs. t. Calcular max .
II.-1 Verificar si YX se mantuvo constante durante el cultivo.
II-2 Calcular YX e yX globales.
II-3 Calcular el consumo global de O2 y el CO2 total producido. Con estos valores calcular b e
yCO2 respectivamente.
III- Verificar si se cumplen los balances de carbono y de grado de reduccin.
+ + = 1
yx + yCO2 = 1
CULTIVO CONTINUO
De los tres mtodos usuales para el cultivo de microorganismos, batch, batch alimentado y
continuo, es este ltimo el que ofrece mayores posibilidades de control. Por sus
caractersticas especiales permite controlar el proceso a un valor de velocidad especfica de
crecimiento () prefijado de manera muy simple. Este punto es de suma importancia ya que
el comportamiento de la mayora de los microorganismos se ve afectado por el valor de al
que estn creciendo.
Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto de variables como PH,
temperatura, concentracin de nutrientes, etc., a valores constantes el valor de , o bien,
fijadas las anteriores, analizar el efecto de sobre la estequiometra del crecimiento. De
este modo es posible separar los distintos efectos y obtener informacin valiosa para la
mejora del proceso.
Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y
en un momento dado, normalmente antes que se agote el substrato limitante, se comienza a
alimentar con medio de cultivo fresco a un caudal F (Fig. 1).
Fig. 1
El volumen del cultivo se mantiene constante. El lquido que sale del biorreactor, a un
caudal F tendr clulas, y la concentracin de nutrientes ser menor que en el caudal de
entrada debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos. Eventualmente
se encontrar tambin algn producto(s) proveniente de la actividad metablica de los
microorganismos.
F, S
R
X S
P
F , S , X , P
Una de las variables de operacin fundamental en este tipo de cultivos es la
velocidad de dilucin, D, la cul se define como la relacin entre el caudal de alimentacin,
F, y el volumen de cultivo, V.
V
F
D (1)
Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h
-1
) y de V (L), las de D sern de h
-1
. El
valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de
tiempo, as un valor de D= 0.25 h
-1
indica que en una hora se renov un 25 % del volumen
de cultivo, o bien que al cabo de 16 h se habr renovado cuatro veces el volumen de cultivo.
Podra pensarse que luego de la renovacin reiterada del volumen de cultivo ya no quedan
microorganismos dentro del biorreactor, pero no es as; debe tenerse en cuenta que estos
se estn multiplicando activamente lo cual compensa las perdidas debidas a los
microorganismos que son arrastrados fuera del biorreactor por el caudal de salida. Bajo
ciertas condiciones ambos procesos se compensan de modo tal que la concentracin de
microorganismos se mantiene constante en el tiempo, es decir que se habr alcanzado un
estado estacionario. En estas condiciones tambin se mantendrn constantes en el tiempo
las concentraciones de nutrientes, en particular la del substrato limitante del crecimiento, y la
de producto(s).
Balances de materia:
De acuerdo al esquema de la Fig. 1 podemos plantear los siguientes balances de
materia para la concentracin de microorganismos ( X ) , de substrato ( S ) y de producto
(P).
X F
x
r V
dt
dX
V . . . ( 2 )
s
r V S F
R
S F
dt
dS
V .
~
. . . ( 3 )
P F
P
r V
dt
dP
V . . . ( 4 )
Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no varan con el tiempo, lo
que equivale a igualar a cero las Ecs. (2), (3) y (4), de donde resulta:

X D
X
r
~
.
( 5 )
)
~
( . S
R
S D
S
r
( 6 )
P D
P
r
~
.
( 7 )
donde P
~
, S
~
, X
~
representan las respectivas concentraciones en estado estacionario. La
Ec. (6) es vlida para cualquier nutriente del medio de cultivo, sea el substrato limitante o no,
ya que la misma surge de un balance de materia en el que no se ha hecho ninguna
consideracin con relacin a la naturaleza del substrato considerado.
Lo primero que debe destacarse en este tipo de cultivo es que permite determinar
experimentalmente y de modo muy simple las velocidades de crecimiento, consumo de
substrato y de formacin de producto, tal como se desprende de las Eqs. (5), (6) y (7). Del
mismo modo permite calcular los rendimientos. Por ej. Si suponemos que S representa a la
fuente de carbono y energa, el rendimiento celular se calcula fcilmente:

)
~
(
~
/
S
R
S
X
s x
Y

( 8 )
De modo similar puede calcularse YP/S , o bien las velocidades especficas. Por ej. Para qs
ser:

x
S S D
x
r
q
R S
S
~
)
~
.(
( 9 )
mientras que para la velocidad especfica de crecimiento ser:
D
X
X D
X
r
X

~
~
.
( 10 )
La Ec. (10) es de suma importancia pues significa que en estado estacionario es = D, y
como D puede ser variado a voluntad por el operador (variable de operacin) resulta que el
cultivo continuo permite imponerle externamente a los microorganismos el valor de al
que deben crecer.
El estado estacionario
En el estado estacionario = D. Cuanto tiempo demora el sistema en alcanzar este
estado?. En rigor, la respuesta surge de la misma definicin de estado estacionario, es decir
cuando todas las variables del cultivo (X, S, P, concentracin de O2 disuelto y composicin
de la biomasa) no varan en el tiempo. El criterio prctico que se suele seguir es que, una
vez fijado el valor de D, debe esperarse al menos 4.tR, donde tR se conoce como tiempo de
retencin medio y puede demostrarse que :
tR = 1 / D
Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h
-1
, habr que esperar 26,7 hs. para suponer que se
ha alcanzado el estado estacionario, lo que deber ser corroborado experimentalmente
midiendo las concentraciones de X, S, P hasta observar que no varan con el tiempo.
Usualmente con 4.tR es suficiente.
PARTE EXPERIMENTAL
Microorganismo y condiciones de cultivo
Los gneros Rhizobium, Shinorhizobium y Bradyrhizobium en relacin simbitica con
plantas leguminosas infectan las races de las mismas y estimulan la produccin de ndulos,
dentro de los cuales las bacterias fijan Nitrgeno (bacterias diaztrofas) y la planta responde
entregando a la bacteria nutrientes orgnicos que produce durante la fotosntesis. La cepa
2011 de Sinorhizobium meliloti, que es capz de colonizar y nodular plantas de alfalfa es la
que utilizaremos para realizar el experimento de cultivo continuo bajo dos condiciones de
limitacin: - limitado en Carbono, donde esperamos obtener los mayores rendimientos en
biomasa y limitado en Nitrgeno, donde esperamos obtener rendimientos menores ya que
estamos frente a un exceso de fuente de Carbono y hay formacin de producto extracelular,
el exopolisacrido.
Las condiciones bajo las cuales se realizarn los cultivos sern:
T=30C
pH (controlado automticamente)=6.8
D (velocidad de dilucin)= 0.10 h
-1
La velocidad de agitacin se mantendr a un valor tal que asegure alrededor de 25% de
oxgeno disuelto en el cultivo (esta condicin es slo para asegurarnos que el cultivo no se
limite en Oxgeno). La concentracin de O2 disuelto se medir continuamente empleando un
electrodo polarogrfico Ingold (Wilmington, MA, USA).
Los pasos a seguir son:
Preparar los reactores. Chequear todo el sistema de mangueras para agregado de medio
de cultivo, de lcali, de antiespumante, entrada y salida de gases, toma de muestra,
inoculacin, etc..
Preparar el medio de cultivo y esterilizarlo dentro del biorreactor (30 minutos, 121
o
C)
junto con los electrodos de pH y oxgeno disuelto. Conjuntamente esterilizar los reservorios
con medio fresco que se emplearn para alimentar el reactor.
Realizar todas las conexiones necesarias (elctricas y de tubera), llevar los reactores a
temperatura y calibrar el electrodo de oxgeno disuelto.
Inocular el reactor con aproximadamente 50 ml de un cultivo de Sinorhizobium meliloti
crecido durante 12-18 h en frascos agitados en agitador rotatorio.
Calibrar el caudal de las bombas peristlticas a un valor tal que satisfaga el valor de D
preestablecido. Nota: los cultivos deben conducirse al mismo valor de D para su posterior
comparacin.
Los cultivos sern chequeados peridicamente (una o dos veces por da). Se
determinar: el contenido de O2 y CO2 en los gases de salida del reactor, que el valor de pH
y de O2 disuelto sean los requeridos, los caudales de aire y medio fresco que estn
ingresando al reactor y el consumo de lcali. Se tomarn muestras (alrededor de 30 ml) a
las que se les determinar: densidad ptica (650 nm), peso seco por duplicado y se
conservarn congeladas muestras de los sobrenadantes de los cultivos para luego
determinar en los mismos la concentracin residual de fuente de carbono y de nitrgeno.
Tambin se debern tomar muestras de los reservorios para determinar la concentracin
real de glucosa utilizada en la alimentacin de los reactores.
Estas determinaciones se realizarn hasta obtener condiciones de estado estacionario en
los parmetros medidos y calculados.
Durante las dos semanas de curso se llevarn a cabo cultivos bajo 2 condiciones de
limitacin diferentes:
1er. semana: Cultivo limitado en C (glucosa)
2da. semana: Cultivo limitado en N (amonio)
Medios de cultivo
El medio mnimo definido que se utilizar para realizar el C. C. ser el medio de Evans,
que limitado en C tiene la siguiente composicin:
glucosa 5.0 g
KCl 0.3725 g
NaH2PO4.2H2O 0.78 g
(NH4)Cl 2.675 g
Na2SO4 0.142 g
cido ctrico 0.21 g
MgCl2.2H2O 0.127 g
Oligoelementos 5 ml
H2O csp 1000 ml
El medio que se emplear para la condicin de limitacin por Nitrgeno tiene los mimos
nutrientes pero la concentracin de glucosa se triplic (15 g.l
-1
) y la de (NH4)Cl se baj a 0.8
g.l
-1
.
CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO)
Otro modo de operar un biorreactor es empleando la tcnica de batch alimentado
(BA) o fed batch. Esta tcnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta
continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se
alimenta es el limitante del crecimiento, esta tcnica permite controlar la velocidad de
crecimiento () del microorganismo.
El BA es particularmente til en procesos en los que el crecimiento celular y/o la
formacin de producto son sensibles a la concentracin del sustrato limitante, es decir
cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se
ven afectados. As, este mtodo se emplea cuando se quieren evitar fenmenos de
inhibicin por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentracin de biomasa.
ESQUEMA
RESERVORIO
BOMBA
BIORREACTOR
F(t)
S
R
(t)
V
R
= V
f
- V
0
V
0
, X
0
, S
0
V
f
, X
f
Donde F(t): caudal de alimentacin
Sr(t):concentracin de sustrato de la alimentacin
Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentacin
Xo: concentracin de biomasa al inicio de la alimentacin
So: concentracin de sustrato limitante al inicio de la alimentacin
El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So son las
condiciones finales de dicho batch.
Es posible elegir distintas condiciones de alimentacin, ya sea mediante el empleo
de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variacin de la concentracin de sustrato
limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Prctico se utilizar el sistema ms simple, es
decir F=cte y Sr=cte.
PRODUCCION DE BIOMASA: ECUACIONES Y DISEO
El cultivo puede describirse matemticamente. La resolucin de las ecuaciones as
obtenidas permitir calcular la evolucin de la biomasa durante el cultivo, la velocidad
especfica de crecimiento, y la productividad. Asimismo se podrn determinar parmetros de
diseo, tales como F y Sr.
Para estudiar la evolucin de X durante el cultivo se deben plantear las ecuaciones
de balance de materia.
Sustrato
acumulacin = suministro - consumo
(1)
d(S. V)
d t
F S
x V
Y
R
x/s


En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en batch o en
continuo. Por lo tanto la expresin (1) quedar:
(2)
V
dS
dt
S
dV
dt
F.S
x V
Y
R
x/s
+

La condicin final del batch es S = 0, pues, como se intenta controlar , S no puede
ser saturante (recordar a Monod).
Si S~ 0, dS/dt = 0, con lo que (2) se transforma en
(3) F . SR -
x V
Y
x/ s
0
de aqu, y recordando que rx = . X
(4) F . SR =
r V
Y
x
x/ s
esta ecuacin indica que la velocidad de produccin de biomasa se acomoda a la velocidad
de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse externamente, modificando F
y/o Sr.
La ecuacin (3) es en realidad un lmite superior ya que dados , X y V, cualquier par
de valores F, Sr que satisfagan la condicin
(4) F . SR
x V
Y
x/s
harn que la velocidad de crecimiento est limitada por la velocidad de alimentacin. Esta
ecuacin (3) ser muy til en el momento de disear la alimentacin.
Biomasa
La velocidad de acumulacin de biomasa ser:
(5)
d(xV)
d t
x V o bien
d (xV)
d t
r V
x

o, reordenando,
(6) rx =
1
V
d(xV)
d t
Si se reemplaza en (4) se obtiene
(7) F . SR =
1
Y
d (x V)
d t
x/s
que indica que la velocidad de acumulacin de biomasa depende de la velocidad de
alimentacin de sustrato.
Integrando (7), se llega a
(8) X V = xo Vo + Yx/s F SR t
Uno de los objetivos planteados es conocer cmo vara la concentracin de biomasa
con el tiempo. En cultivo en batch, al ser V = cte, X.V es proporcional a X. En BA V no es
constante, sino que vara con el tiempo (F = dV/dt). Integrando se tiene
(9) V = Vo + F t
reemplazando en (8) y despejando X, se tendr
(10) X =
x V
Ft + V
Y F S t
Ft + V
o o
o
x/s R
o
+
expresin que describe la variacin de X con t a lo largo del cultivo alimentado. Puede darse
el caso en que el aumento de V sea tal que haya un efecto de dilucin que provoque la
disminucin de la concentracin de biomasa. As, puede ocurrir que la concentracin final
alcanzada sea menor que la inicial, pero no as la cantidad total X.V.
DISEO
Se desea obtener una concentracin final de biomasa Xf, con un volumen final Vf. El
volumen total adicionado durante el BA ser:
(11) Vf - Vo = F.t
donde tf es el tiempo total de alimentacin. Cuando t = tf, la ecuacin (8) se transforma en
(12) XfVf = XoVo +
Y
x s SR F.tf
Reemplazando (11) en (12), y despejando Sr queda
(13) SR =
X V X V
Y V V
f f o o
x s f o

( )
La ecuacin (13) permite calcular la concentracin de sustrato limitante en el
reservorio. Resta calcular F, cuyo valor debe ser tal que satisfaga la ecuacin (4). En
particular, para t = 0 (inicio de la alimentacin )ser:
(14) F SR

o o o
x s
X V
Y
``
El valor de tf se calcula a partir de la ecuacin (11).
NOTA: o puede ser igual a max si la alimentacin se inicia el final de la fase exponencial del
batch.
Debe destacarse que si F.Sr fuera mayor que la velocidad de consumo de sustrato,
habra una acumulacin de sustrato en el medio, y el crecimiento no sera limitado.
Es interesante conocer la variacin de durante el batch alimentado. Recordando el
balance de materia para la biomasa
d xV
dt
( )
xV =
1
xV
d xV
dt
( )
d xV
dt
Y FS
x s R
( )

Por lo tanto se obtiene

(15) = Y FS
xV
x s R
1
Si se reemplaza (8) en (15), ser
(16) =
FS Y
X V FS Y t
R x s
o o R x s
+
expresin que indica que disminuye con t a lo largo del batch alimentado.
Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones
halladas.
Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEADO una alimentacin para el cultivo en
batch alimentado. El caso descrito hasta aqu tiene en cuenta que tanto F como Sr sean
constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t), dicha funcionalidad habr de
ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.