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Induccin de Mutacin Usando Agentes Fsicos y Qumicos en Cultivos Vegetales (cdssdc)

Samantha Ortega Aguirre Marco Antonio Garca Estrada Las mutaciones pueden ocurrir espontneamente y/o despus de la induccin con agentes mutagnicos. Las mutaciones espontneas pueden ocurrir debido a la accin de las radiaciones naturales o incluso durante la replicacin del DNA debido a errores en la lectura de las bases. Estos errores ocurren con una frecuen-7 -11 cia de 10 -10 por pares de bases durante una replicacin, la proporcin es muy baja. Sin embargo; la frecuencia de mutacin (proporcin de mutantes en la poblacin) puede aumentarse significativamente con el uso de mutgenos. De esta manera puede incre-5 -3 mentarse hasta 10 -10 en el aislamiento de mejores productores de metabolitos secundarios e incluso has-2 -1 ta 10 -10 en el aislamiento de mutantes auxtrofos. Las variaciones genticas presentes en la naturaleza no han sido originadas por mutaciones espontneas, sino ms bien por la recombinacin de genotipos en poblaciones y por su accin recproca constante con las fuerzas del medio ambiente. Tanto los mutantes espontneos como los inducidos se producen como resultado de los siguientes cambios estructurales en el genoma: Cambios en el nmero de cromosomas. Cambiar el orden de los genes dentro del cromosoma. Cambios en la secuencia de bases dentro de un gen (mutacin puntual).

Resumen Todas las formas de vida que hoy existen son el resultado de tres factores: mutacin. Factores ambientales y tiempo, tal es el cambio que se producen por estas tcnicas que puede variar de acuerdo a la especie y al agente que hace la mutagenesis, es por ello que las tcnicas que se dar a conocer en este artculo sern para explicar de forma ms fcil y eficaz el comportamiento del cambio de las cepas, para provocar una mutacin, se explicaran tres artculos de revistas reconocidas, explicado los factores fsicos y qumicos en estudias de plantas ornamentaras, que duro a lo largo de treinta aos, la causa y el efecto del cambio fenotpico en la planta, as como la compracion del efecto de las radiaciones como los rayos gamma en distintas especies, Passiflor edulis Sims var. Edulis y Dioscorea rotundata, para determinar el cambio que s eproducen y la diferencia que hay en cada una de ellas Palabras clave: Mutacin Radiacin Agentes qumicos Agentes fsicos Mejoramiento Sensibilidad Induccin Introduccin Todas las formas de vida que hoy existen son el resultado de tres factores: Mutacin, fuente fundamental de las variaciones hereditarias, Factores ambientales Tiempo, durante el cual el genotipo y el medio ambiente estn en constante interaccin y as se produce el cambio evolutivo.

Las mutaciones utilizadas para la mejora de cepas microbianas generalmente son mutaciones puntuales. Estas mutaciones puntuales son de dos tipos: i) Sustitucin de un nucletido por otro nucletido. La sustitucin de un nucletido por otro en un gen puede originar las siguientes mutaciones: Mutacin silenciosa: el codn alterado continua codificando para el mismo aminocido y por lo tanto se sintetiza la misma protena. Mutacin de sentido errneo: el codn alterado codifica para un aminocido diferente que puede alterar las propiedades de la protena, o incluso convertirla en no funcional. Mutacin sin sentido: cuando la sustitucin del nucletido produce un codn de terminacin de la cadena resultando en una parada de la sntesis de la protena en la traduccin. El producto es una protena incompleta que probablemente no es funcional.

Los cambios generados en el genotipo son producidos mediante mutacin y por recombinacin gentica. La mutacin es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos contenidos en el genoma de un organismo. La recombinacin gentica se define como el proceso por el cual los elementos genticos contenidos en dos genomas separados se juntan en uno solo. Mientras que la mutacin conlleva slo una pequea cantidad de cambios genticos en una clula, la recombinacin gentica normalmente conlleva cambios ms grandes ya que pueden transferirse algunos genes, un conjunto de genes o incluso cromosomas enteros.

2 ii).- Mutaciones por corrimiento de lectura Mutaciones de insercin: cuando se aaden uno o ms nucletidos en un gen. Mutaciones por delecin: cuando se eliminan uno o ms nucletidos en un gen. ocasionando cambios qumicos en las bases provocando un apareamiento incorrecto. A continuacin se abordan algunos ejemplos El cido nitroso (HNO2) deamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las distintas propiedades de apareamiento de los productos de deaminacin (hipoxantina aparea con citosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT ---- GC y/o GC ---- AT. La hidroxilamina (NH2OH) reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxilamino. Este derivado de la citosina se aparea con adenina producindose transiciones GC ---- AT. Otro grupo de productos qumicos que afectan al DNA que no se replica son los agentes alquilantes. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagnicos ms potentes para aplicaciones prcticas. Los compuestos utilizados ms frecuentemente incluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato (DES), diepoxibutano (DEB), Nmetil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-Nnitroso urea y gas mostaza. La mutagnesis con agentes alquilantes se produce a travs de varias vas ya que originan la formacin de un espectro completo de bases alquiladas en el DNA lo que origina transiciones y deleciones. El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que ya no se aparea con la citosina provocando la transicin GC ----> AT. El N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancergeno (uno de los mutgenos qumicos ms efectivos), se obtienen, en condiciones ptimas, un gran nmero de mutantes con una tasa de muerte baja. El mecanismo molecular exacto de la reaccin de la NTG no se conoce todava. c) Agentes intercalantes. Un grupo interesante de sustancias, acridinas y bromuro de etidio, son molculas planas que se insertan entre dos pares de bases del DNA, separndolas entre s. Durante la replicacin, esta conformacin anormal puede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originando mutaciones por corrimiento de lectura. Aunque las acridinas son tiles en investigacin, no son muy adecuadas para el aislamiento rutinario de mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningn efecto mutagnico en bacterias. 2. Agentes Fsicos (Radiaciones). Tanto la luz ultravioleta como las radiaciones ionizantes se utilizan en estudios de mutagnesis. Sin em-

Una caracterstica de las mutaciones puntuales es que se pueden revertir. Un revertiente se define como una cepa en la cual se restaura el fenotipo de la cepa salvaje que se haba perdido en la mutante. Existen dos tipos de revertientes: Revertientes de un mismo sitio: cuando la mutacin que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio donde ocurri la mutacin original. Revertientes de segundo sitio: cuando la mutacin que restaura la actividad ocurre en un sitio diferente del DNA.

Existen una gran variedad de agentes fsicos y qumicos que pueden inducir mutaciones. A continuacin se hace referencia a algunos de los principales grupos y su modo de accin. 1. Mutgenos qumicos. Se conocen varios productos qumicos que son mutagnicos, y se clasifican segn su modo de accin: a) Anlogos de bases. Debido a su similitud estructural los anlogos de bases como el 5-Bromouracilo (5BU) o la 2-Aminopurina (2AP) se incorporan en el DNA que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina. Cuando uno de estos anlogos de bases se incorpora en el DNA, la replicacin puede ocurrir normalmente aunque ocasionalmente, ocurren errores de lectura que resultan en la incorporacin de bases errneas en la copia de DNA. As por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puede aparear con guanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transicin de AT a GC (la guanina se aparea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la transicin de AT a GC. Los anlogos de bases son de poca importancia para la aplicacin prctica ya que para las cepas industriales, que son poco conocidas genticamente, puede ser bastante costoso establecer las condiciones ptimas para la mutagnesis. Por ejemplo, la incorporacin de 5-Bromouracilo en el DNA tiene lugar slo si el organismo est creciendo en condiciones de deficiencia de timina. Por tanto se utilizan auxtrofos de timina, lo que puede dar lugar a una produccin reducida de la sustancia que se desea. b) Agentes que reaccionan con el DNA. Existen una serie de agentes qumicos que reaccionan directamente sobre el DNA que no se est replicando

3 bargo, los mecanismos de mutagnesis son bastante diferentes para cada tipo de radiacin. a) Luz ultravioleta. Uno de los agentes mutagnicos ms efectivos es la radiacin ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda efectiva para la mutagnesis est comprendida entre los 200 y 300 nm con un ptimo a 254 nm que es la absorcin mxima del DNA. Los productos ms importantes de la accin de la luz UV son dmeros (timina-timina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (timina, citosinina) adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la replicacin del DNA, la DNA polimerasa inserte un nucletido incorrecto en tal posicin. El tipo ms frecuente de fuente de radiacin UV que se usa para mutagnesis es la lmpara microbicida que emite grandes dosis de radiacin UV en la regin de 260 nm. Se suele utilizar una dosis de radiacin UV que produzca un 90% - 95% de muerte en la poblacin buscndose posteriormente, entre los supervivientes, los mutantes. La radiacin UV es muy til en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos. Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a la luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad de supervivencia aumenta y la frecuencia de mutacin desciende. Esto se debe a la activacin de un enzima de fotorreactivacin que corta los dmeros de timina. En presencia de luz, el enzima corta los dmeros originando pirimidinas monomricas. Hasta el 80% de los dmeros de timina que existen en el genoma pueden ser fotorreactivados. Para aumentar la frecuencia de mutacin deben evitarse los mecanismos de fotorreactivacin, llevando a cabo todas las manipulaciones bajo luz visible de longitud de onda larga (> 600 nm). b) Radiacin ionizante. La radiacin ionizante es una forma de radiacin ms potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos X, rayos csmicos y rayos gamma. Esta radiacin causa la ionizacin del agua y de otras sustancias; producindose indirectamente efectos mutagnicos debido a esta ionizacin. Entre las potentes especies qumicas formadas por la radiacin ionizante se encuentran radicales libres, siendo el ms importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan en la clula con macromolculas, como el DNA, y las inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las mutaciones en cromosomas. A bajas dosis de radiacin ionizante slo ocurren unos cuantos impactos sobre el DNA, pero a mayores dosis ocurren impactos mltiples que conducen a la muerte de la clula. Al contrario que la radiacin UV, la radiacin ionizante penetra fcilmente el vidrio y otros materiales. Por esta razn, la radiacin ionizante se usa con frecuencia para inducir mutaciones en animales y plantas donde su poder de penetracin hace posible alcanzar con facilidad las clulas germinales de estos organismos; pero, debido a que es ms peligrosa de usar y est menos disponible, se emplea poco con microorganismos donde la penetracin de la radiacin UV no es un problema. Por consiguiente, se utilizan preferiblemente para la mutagnesis en el desarrollo industrial de cepas la radiacin ultravioleta o los agentes qumicos. 3. Mtodos de mutagnesis. Las cepas utilizadas industrialmente estn poco caracterizadas genticamente comparndose con los organismos que se utilizan normalmente en investigacin. Por lo que no existen procesos concretos aplicables a la mutagnesis por radiacin o con agentes qumicos. Debido a esto, a continuacin se mencionan otras posibilidades que en un futuro pueden tener claras aplicaciones. a) Mutagnesis por elementos transponibles. Si se produce la insercin de un elemento transponible dentro de un gen se pierde, en general, la funcin del gen se altera. Los elementos transponibles se usan con profusin por los genticos microbianos como agentes mutagnicos ya que pueden integrarse en el cromosoma en varias localizaciones. Hay tres tipos de elementos transponibles: secuencias de insercin (IS), transposones (Tn) y algunos virus especiales (Mu). En los procariotas, las secuencias de insercin (IS) son el tipo ms simple ya que no llevan otra informacin gentica que la requerida para desplazarse a nuevos lugares. Los transposones (Tn) son ms largos que las secuencias de insercin (IS) y llevan otros genes, algunos de los cuales confieren importantes propiedades al organismo que los porta (marcadores de resistencia a frmacos y otros genes fcilmente seleccionables). b) Mutagnesis dirigida. Los mtodos de mutagnesis que han sido discutidos hasta este momento son completamente al azar. La tecnologa del DNA recombinante y el uso de DNA sinttico hacen que sea posible inducir mutaciones especficas en genes especficos. Cuando se asla y se determina la secuencia de un fragmento de DNA que contiene un gen especfico, es posible construir una forma modificada de este gen cambiando una base o una serie de bases. Este DNA modificado puede luego insertarse en una clula receptora y seleccionar mutantes que se diferenciarn

4 del tipo silvestre por el cambio introducido en ese sitio especfico. La mutagnesis dirigida tiene muchos usos en gentica microbiana y en biologa molecular y resulta especialmente til en estudios sobre estructura y funcin de enzimas y otras protenas. Las plantas verdes son la fuente principal de recursos que utiliza el hombre para satisfacer sus necesidades de alimento, ropa y energa. En la medida en que aumentaron las poblaciones humanas fue necesario procurar fuentes de alimentos mayores y ms seguras, y poco a poco se fueron desarrollando sistemas de produccin basados en la domesticacin de las plantas. De las casi 200 000 especies de plantas que existen en el mundo slo una pequea parte puede ser domesticada; el hombre ha empleado unas 3000 como alimentos, fibras, especias y otras 200 como cultivos. El mtodo empleado para desarrollar nuevas variedades de plantas para su cultivo y consumo humano se ha dado en llamar fitotecnia, mtodo que al principio se basaba primordialmente en la seleccin entre plantas buenas y malas La gentica se convirti en una ciencia bsica de la fitotecnia. Su objetivo era combinar en una planta las mejores propiedades de varias plantas en vez de slo hacer una seleccin entre plantas buenas y malas. Este mtodo, que a menudo se complementa con el uso del plasma germinal obtenido por mutacin inducida, ha llegado a ser el ms empleado para la multiplicacin de las plantas por reproduccin sexual. Si bien la fitotecnia exige la variacin gentica de las caractersticas tiles para mejorar los cultivos, a menudo no se logra la variacin deseada. En estos casos pueden emplearse agentes mutgenos, como la radiacin y algunos productos qumicos, para inducir mutaciones y generar variaciones genticas de las cuales puedan seleccionarse los mutantes deseados. La induccin de mutaciones ha resultado ser un mtodo eficaz para lograr variaciones dentro de un tipo de cultivo, ya que ofrece la posibilidad de inducir caractersticas deseadas que no se pueden hallar en la naturaleza o se han perdido durante el proceso evolutivo, para poder llevar a cabo mejoramiento gentico. Materiales y Mtodos En los ltimos aos se ha llevado a cabo un extenso trabajo e investigacin para la mejora de semillas y cultivos de propagacin vegetativa a travs de mutaciones inducidas. Como se menciono anteriormente, existe una gran cantidad de agentes mutagnicos por lo que a continuacin se presentaran los resultados importantes en relacin a la mutagnesis inducida en semillas y cultivos de propagacin vegetativa, durante 36 aos de experiencias prcticas sobre la mejora de los cultivos mediante tcnicas clsicas y modernas inducidas por mutagnesis. Este trabajo fue reportado en el artculo A Report on 36 Years of Practical Work on Crop Improvement Through Induced Mutagenesis (Artculo 1) Los cultivos seleccionados como materiales experimentales incluyen vegetales-hortalizas (Trichosanthes anguina L, T. cucumarina, Cucurbita maxima L, Cephalandra indica, Luffa acutangula Roxb., Lagenaria ciceraria), plantas medicinales (Trigonella foenumgraecum L, Mentha citrata Ehrh), leguminosas (Psophocarpus tetragonolobus L), cultivos oleaginosos (Jatropha curcas L, Rosa damascena, Cymbopogon flexuosus (Nees) Wats) y plantas ornamentales (Amaryllis, Asiatic Hybrid Lily, Bougainvillea, Canna, Chrysanthemum, Dahlia, Gerbera, Gladiolus, Hibiscus, Lantana depressa Naud, Tagetes erecta, Rose, Tuberose, Narcissus tazetta) Se utilizaron agentes fsicos (rayos X y rayos gamma) y agentes qumicos (EMS, MMS, Colchicina) como mutgenos con la finalidad de mejorar los cultivos (Tabla 1)

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Tabla 1 Cultivos en los que se realizaron mutaciones, mutgenos utilizados y tratamientos aplicados

in vitro de esta especie. Los explantes comprendieron plntulas con uno y dos segmentos nodales utilizados por su capacidad de regeneracin in vitro. Los medios de cultivo se ajustaron a pH de 5.7-5.8 y se esterilizaron a 121C con 15 lb. de presin durante 20 minutos. La investigacin se realiz en el laboratorio de cultivo de tejidos de la Facultad de Ciencias en el Departamento de Biologa, en donde se estableci el proceso de propagacin clonal in vitro de esta especie. Las radiaciones gamma fueron realizadas en el Instituto Colombiano de Geologa y Mineria (INGEOMINAS) utilizando la fuente Cobalto (Co60). Inicialmente se irradiaron explantes que tenan un solo segmento nodal con cinco dosis de irradiaciones gamma 10, 15, 20, 25 y 30 Gy (Gray, mide la dosis absorbida de radiaciones ionizantes por un determinado material, un gray es equivalente a la absorcin de un joule de energa ionizante por un kilogramo de material irradiado), el ensayo se realiz con el fin de observar la viabilidad y efecto directo de la radiacin. Posteriormente se realizaron dos repeticiones con seis dosis de irradiaciones gamma: 10, 20, 30, 40, 50 y 60 Gy en explantes con dos segmentos nodales con el fin de mejorar la tasa de radiacin. Despus del proceso de irradiacin, los explantes fueron transferidos al medio de multiplicacin para evitar la desnaturalizacin de sus componentes producida por el efecto de las radiaciones. La estimacin de la dosis letal media (DL50) y la descripcin fenotpica de la poblacin se evalu a los 7, 14, 21, 28, 35 y 42 das despus de la induccin, en donde fueron evaluados 120 explantes por tratamiento mutagnico adems del control.

Previo a los trabajos a gran escala de mutaciones genticas para el mejoramiento de especies se realizo un estudio de radiosensibilidad, en la que se estudiaron una amplia gama de parmetros para determinar la sensibilidad de cada especie a la radiacin, incluidos los factores nucleares (numero y tamao de cromosomas, posicin del centromero, grado de poliploida, contenido de ADN nuclear, etc), humedad de la semillla, tamao y cubierta de la semilla, tipo de flor y forma y color de la flor. Despus del estudio se pudo determinar que la sensibilidad a la radiacin es dependiente del genotipo del organismo. Por otro lado se realizo la revisin del artculo Induccin de Mutaciones Mediante Radiaciones Gamma de Passiflor edulis Sims var. edulis (Artculo 2) Como material vegetal se utilizaron las plntulas de gulupa in vitro obtenidas en las investigaciones realizadas en el laboratorio de cultivo de tejidos de la Facultad de Ciencias - Departamento de Biologa, en donde se estableci el proceso de propagacin clonal

Para el enraizamiento de los brotes irradiados y no irradiados regenerados, se probaron varios medios cambiando las concentraciones hormonales del cido indol actico (AIA) y cido naftaleno actico (ANA) (Tabla 12. Una vez enraizadas las plntulas completas estas fueron colocadas en recipientes plsticos transparentes (20 x 6 cm) utilizando turba como sustrato con el fin de mantener la humedad optima durante la etapa de adaptacin antes de ser trasplantadas a invernadero.
Tabla 2 Medios de cultivo utilizados para el enraizamiento de brotes irradiados y su material vegetal control.

6 Por ltimo se reviso un tercer articulo The Development of New Genotypes of the White Yam by Mutation Induction Using Yam Mini-tubers con la finalidad de compararlo con el articulo dos, ya que se utiliza el mismo mtodo con diferentes especies. La metodologa que se utilizo fue la siguiente. Se tuvieron lotes de 100 mini-tubrculos de Dioscorea rotundata, cv. "Obiaoturugo" fueron irradiados con rayos gamma en dosis, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 Gray (Gy) con la fuente de rayos gamma de 60Co en the Center for Energy Research and Development, Obafemi Awolowo Universitym. Cada tubrculo irradiado incluyendo el control, se dividi en corridas por peso de 10-15g y se cultivaron para establecer la primera generacin mutada vegetativa (MV1). Los conjuntos de la regin de la cabeza (H) se sembraron por separado de los de la regin de la cola (T), usando un experimento de parcela dividida establecido en el campo en un diseo de bloques completos al azar (DBCA) con cuatro repeticiones. Los datos recogidos fueron altura de planta, nmero de hojas por posicin y nmero de cepas por cultivo. Otros incluyeron el nmero de das desde la siembra hasta el registro del primer brote y brote al 50%, el nmero total de siembras plantadas y el nmero siembras de las que surgi. Estos fueron utilizados para calcular el porcentaje de brote, la supervivencia relativa y letalidad. La supervivencia relativa (RS) se calcul como RS = (% de supervivencia del tratamiento con dosis X 100) /% de supervivencia de letalidad de control se calcul como la letalidad = 100 RS. Los tubrculos se cosechan cuando todos las corridas estn en estado de senectud y los datos obtenidos de los tubrculos cosechados fue el nmero de tubrculos por corrida y el rendimiento de tubrculo. Otros rasgos evaluados fueron el dimetro (D) y la longitud (L) de tubrculos individuales, que fueron utilizados para calcular el ndice de forma de tubrculo (TSI) como TSI = D / L . Todos los datos se sometieron a anlisis estadstico basado en el mtodo DBCA. Un total de 5.000 tubrculos de primera generacin (lneas) cosechadas de MV1 se utilizaron para establecer MV2 . El campo de exponer en el presente ensayo fue similar a la de la prueba anterior. Cada conjunto contena el mismo nmero de lneas y un mnimo de cinco puestos por lnea ya plantado. Durante la recopilacin de datos, por lo menos tres estantes por lnea fueron muestreados. Durante la replicacin, se tuvo cuidado de plantar cada lnea (tubrculo) para facilitar su identificacin y seguimiento. Sin embargo, durante el anlisis estadstico, los datos se agruparon y se expresan en base soporte por. La poblacin MV2 generacin tambin fue proyectado y lneas mutantes modificados con caracteres vegetativos fueron marcados y aislado. Resultados De acuerdo al Artculo 1 consultado los resultados reportados fueron los siguientes. En relacin a los cultivos oleaginosos se pudo determinar que para Jatropha curcas L, la radiacin gamma se encontr altamente eficaz para inducir cepas adecuadas para el cultivo en suelo alcalino, Rosa damascena, es muy sensible a la radiacin gamma y si una planta era tratada con radiacin gamma perda su color rosado mostrando entonces flores blancas, lo cual en algunos puede representar un beneficio al obtener una variedad de esa especie en relacin al color. En las leguminosas tratadas, Psophocarpus tetragonolobus L,se pudo observar una mejora en el crecimiento ya que se obtuvo una planta enana con un patrn de crecimiento determinado, lo cual resuelve los problemas de acoso de cultivo. Las plantas medicinales, en relacion a Mentha citrata Ehrh se observo que la respuesta a la radiacin gamma fue muy prometedora, ya que se obtuvo un mayor rendimiento de forraje. Se pudo observar que los rayos gamma, EMS y MMS tuvieron una mejor respuesta en Trigonella foenum-graecum Las hortalizas Trichosanthes anguina L, T. cucumarina, Cucurbita maxima L, Cephalandra indica, Luffa acutangula Roxb., Lagenaria ciceraria presentaron una respuesta positiva a los rayos X presentando mayor floracin, frutos cortos y gruesos, aumento del peso de la fruta. Sin duda donde se llev a cabo mayor investigacin y experimentacin fue la mejora de los cultivos ornamentales, con el objetivo de desarrollar variedades nuevas y novedosas para el comercio de floricultura. Los rayos gamma ha sido el mtodo de mutagnesis ms utilizado y con mayor xito, ya que se han creado ms de 76 variantes nuevas (mutantes), variedad de color, tipo y forma de clor y abigarramiento de la clorofila Se encontr que utilizar colchina era un mtodo muy eficaz para inducir la variablidad gentica en L. acutangula, L. siceraria, C. maxima , T. anguina y T. cucumarina Los resultados obtenidos en el Artculo 2 fueron los siguientes. En el primer ensayo de dosificacin (0, 10, 15, 20, 25, y 30 Gy) realizado con explantes que presentaban un solo segmento nodal, no se encontr diferencias entre los tratamientos, causado en gran parte al medio de cultivo utilizado.

7 Con el propsito de mejorar el medio de cultivo para evitar la formacin de callo (masa amorfa desorganizada de clulas indiferenciadas) y restablecer la proliferacin de yemas, se realizo un diseo en el cual se utilizaron las fitohormonas relacionadas en la tabla 2. Adems fue necesario aumentar la tasa de propagacin sembrando dos segmentos nodales para obtener suficiente material vegetal para realizar los tratamientos de irradiacin.
Tabla 3 Medios de cultivo utilizados para la etapa de multiplicacin en el proceso de induccin de mutaciones

El valor de la DL50 (Dosis Letal, 50%) fue calculado sobre la base de la reduccin del 50% de la regeneracin de las plntulas durante el tiempo de evaluacin, el cual fue de seis semanas. La Tabla 4 muestra los porcentajes de mortalidad en cada dosis de radiacin, situando los valores de DL50 en las dosis de 40 y 50 y presentndose el mayor ndice de mortalidad en el tratamiento de 60Gy.
Tabla 4 Porcentajes de mortalidad de los explantes sometidos a las diferentes dosis de radiacin gamma Co60

Los mejores resultados se presentaron en el medio 1, este medio permiti la diferenciacin de yemas presentando un crecimiento del 68% de callo. Por el contrario, los medios 2 y 3 el crecimiento de callo fue notorio en 70,3% y 92,5% respectivamente. Los experimentos realizados con dosis de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 Gy utilizando explantes con uno y con dos segmentos nodales fue posible la evaluacin en el medio de cultivo, sin embargo para este parmetro de evaluacin fue necesario seleccionar el material vegetal expuesto a la irradiacin fsica con rayos gamma cuando se utilizaron explantes con dos segmentos nodales. Despus de una semana de cultivo los explantes presentaron varios tipos de necrosamiento. Los tipo 1 y 2 eran parciales presentando necrosis en la primera o segunda yema del explante, los tipo 3 con necrosamiento tambin parcial pero se incluan ambas yemas, tambin se observ un tipo de necrosamiento completo en yemas y tallo el cual fue el tipo 4. Estos ltimos dos explantes (tipos 3 y 4) fueron considerados para calcular la mortalidad total generada por el efecto de mutacin al final de la evaluacin. Durante el proceso de evaluacin la presencia de los tipo 2 fue ms notoria en las primeras semanas para las tres primeras dosis de irradiacin (10, 20 y 30 Gy), en donde algunos de estos se convirtieron en tipo 3 durante las siguientes semanas. El necrosamiento tipo 1 se present a lo largo de todas las evaluaciones en todos los tratamientos de irradiacin. En las dosis 40, 50 y 60 la mortalidad de los explantes fue expresada despus de la segunda y tercera semana post- irradiacin. Es importante anotar que en estas mismas dosis se observ que durante la primera semana no haba necrosamiento tipo 3 y 4, sin embargo esta mortalidad fue aumentando a medida que las evaluaciones transcurran.

En este artculo (Artculo 2) se encontr que la propagacin de las plantas declino a medida que aumentaban las dosis de radiacin. En la Figura 1 se observa que a partir de 40 Gy se produjo una drstica afectacin en el crecimiento de los explantes as mismo se produjo el aumento gradual en el porcentaje de mortalidad a medida que las dosis de radiacin aumentaban hasta 60 Gy. Este comportamiento es explicado a partir de que los explantes dao tipo 3 y 4, tienen limitacin en su crecimiento causado por el efecto de radiacin son fuertemente afectados en su capacidad regenerativa. La curva de ajuste en base a la ecuacin de regresin mostr una alta correlacin positiva entre la mortalidad de plantas y las dosis de radiaciones gamma aplicadas, como lo indic el coeficiente de determinacin R2 = 0.9834. Los explantes no irradiados (control), presentaron un 100% de regeneracin con plantas de aspecto normal.
Figura 1 Curva de radiosensitividad para el cultivo in vitro de gulupa a irradiaciones gamma Co60

8 De igual manera se valor la estimacin del nivel de sobrevivencia de los explantes, determinada por aquellos que no presentaban ningn tipo de necrosamiento. Durante la evaluacin se observaron algunos explantes sin ninguna lesin que no llegaron a proliferar, a estos explantes se les asumi que sus yemas se encontraban latentes, debido a que la magnitud en que se presenta la radiacin ocasiona daos parciales a nivel interno en el que impiden la capacidad regenerativa. Por el contrario los explantes sobrevivientes de todos los tratamientos incluyendo el control fueron multiplicados en condiciones in vitro durante tres subcultivos. y luego subcultivados en el medio de cultivo Marks & Spencer con adicin de auxinas para inducir el proceso de enraizamiento. Tambin es importante resaltar que la tasa de crecimiento de los explantes fue dependiente de los tratamientos de irradiacin y del tiempo de cultivo, en las dosis de 10, 20 y 30 la tasa de crecimiento fue homognea y esta fue observada desde la segunda semana de crecimiento, en tanto que en las dosis de 40, 50 y 60 su crecimiento tuvo su inicio ms tardo a la tercera y cuarta semana despus de la induccin, hacindose ms notorio en la cuarta semana. En el caso del control la proliferacin de yemas se present a la semana de introduccin del material vegetal con un coeficiente de multiplicacin mayor al que se observ en todos los tratamientos irradiados. En este artculo se evalu la variabilidad gentica producida por las radiaciones gamma Co60 en plantas in vitro de gulupa con el fin de iniciar un programa de mejoramiento gentico en este frutal con la alternativa de induccin de mutaciones. Seis dosis de irradiaciones gamma (10, 20, 30, 40 50 y 60 Gy) fueron empleados con el objeto principal de establecer la curva de radiosensitividad en esta especie frutal a partir de segmentos nodales como explantes El impacto y nivel de tolerancia del material biolgico a un mutgeno son manifestados en el primer subcultivo. Sin embargo algunos de los mutantes morfolgicos viables fueron observados a partir de la segunda en diferentes dosis de irradiacin o concentracin de rayos gamma hacindose ms notorios en las tres primeras dosis. Los descriptores fenotpicos en condiciones in vitro no fueron tan visibles para esta especie vegetal cuando se emplea segmentos nodales como explantes en este proceso de induccin de mutaciones, sin embargo se evaluaron diferentes hbitos de crecimiento que se presentaron durante la regeneracin de plantas. Entre los que cabe mencionar son los de forma roseta y forma erecta, siendo este ltimo usual en el tratamiento control. La presencia de forma roseta fue ms notoria en dosis de 50 y 60 Gy mientras que la forma erecta se present en todos los tratamientos. No se observo un notorio cambio en la coloracin de la planta. El vigor de las plntulas se evalu de acuerdo al grosor y altura de las mismas Se observo que la dosis de 50 Gy present diferencias significativas frente a los otros tratamientos mutagnicos, considerando que el vigor de las plntulas fue bajo comparado con las otras. Los resultados obtenidos en el Artculo 3 fueron los siguientes Crecientes en las dosis de rayos gamma progresivamente, inhibida el surgimiento de mini-tubrculos tratados (Tabla 5), como se indica por el nmero de das por brote de la primera aparicin en la generacin MV1.
Tabla 5 El efecto de las dosis de los rayos gamma en el nmero de das de brote.

El nmero de das al 50% de brote y el porcentaje medio de brote (Tabla 6) en la generacin MV1 tambin mostr la misma tendencia. Cuando el nmero de das a 50% brote se compar entre los medios de tratamiento, los esquejes de la regin H tratados a 0 60 Gy de irradiacin gamma registrado un rango de 25.5 das a 81.1 das y los de las regiones T registr un rango de 38.3 das a 95.0 das. Cada corrida fueron aisladas a partir de los mini - tubrculos tratados con 70 Gy y por encima de rayos gamma no brotan o no grabar hasta el 50% de brote. En todos los casos, los efectos fueron ms graves en las corridas aisladas de la cola (T) regin que los de la regin de la cabeza H que indica que la regin de cola es ms sensible a la radiacin de la regin de la cabeza.

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Tabla 6 El efecto de las dosis de los rayos gamma al 50% de das de brote.

hojas pueden ser fcilmente detectados. Adems, la naturaleza heterocigota de muchas plantas ornamentales ofrece una frecuencia alta de mutacin. La principal ventaja de la induccin de mutaciones en cultivos de propagacin vegetativa es la capacidad para cambiar uno o unos pocos caracteres de un cultivo para tener beneficios econmicos, nutricionales y en general una mejor especie capaz de adaptarse a nuestras necesidades En relacin al Artculo 2, fue necesario calcular la efectividad y la eficiencia de la mutacin con el fin de conocer el xito de un mutgeno y establecer las mejores dosis para establecer un programa, la efectividad de la mutacin est determinada por las mutaciones generadas por unidad de dosis y la eficiencia de la misma se asume en relacin a la letalidad y a los cambios no deseados como son la esterilidad. Sin embargo para esa investigacin no fue posible calcular la efectividad de los rayos gamma a partir de segmentos nodales, debido al tiempo de las plntulas y la etapa in vitro en que se realiza la evaluacin. La eficiencia se calculo en base a la LD50 y no bajo la observacin de caracteres no deseados, ya que estos no se expresan en esta etapa de crecimiento, y deben ser evaluados posteriormente en campo. La evaluacin de la eficiencia de la mutacin estuvo determinada por la medicin de la dosis letal media (DL50), est se determin en la dosis de 50 Gy. En las dosis de 10, 20 y 30 Gy se observ una buena capacidad de multiplicacin de brotes, la cual fue homognea y present los mayores ndices de sobrevivencia. De las variables fenotpicas evaluadas, el coeficiente de multiplicacin (CM) y el vigor de las plantas, arrojaron diferencias significativas frente al control para todos los tratamientos en las evaluaciones realizadas. De acuerdo a el artculo 3, Irradiacin con rayos gamma no pareca afectar a la media del nmero de cepas por estante, el nmero de medios de tubrculos y el ndice tasa media (TSI) de tubrculos aislados de las regiones H y T tratadas de mini-tubrculos . LD50 (50% de letalidad) y GR50, (50% de reduccin de crecimiento) se obtuvieron a 40 Gy y 30 Gy, respectivamente. Hubo una inhibicin completa de la germinacin (100% de letalidad) a dosis ms de 80Gy. En la generacin MV2, sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. Las diferencias significativas entre los medios de tratamiento se observada en la generacin MV1 desaparecido en la generacin MV2. La irradacion por tayos Gamma de cultivos de plantas hay como resultado tres tipos de efectos, el dao fisiolgico, las mutaciones de los factores y mutaciones cromosmicas. Todos estos efectos se conocen como la lesin por radiacin y se pueden manifestar en va-

La Tabla 7 ilustra cmo las alturas promedio de la altura de las plantas, la media del nmero de hojas y el rendimiento de los tubrculos, por cada estante tratados tambin disminuy con el aumento de las dosis de rayos gamma. Estos efectos tambin fueron ms graves en las corridas aisladas de las regiones T que aquellos de las regiones H.
Tabla 7 Alturas promedio de la altura de las plantas, la media del nmero de hojas y el rendimiento de los tubrculos

Discusin Es importante mencionar que las mejoras genticas se realizan con el fin de beneficiar principalmente el aspecto econmico. Los resultados encontrados en el primer artculo muestran claramente que la mutacin mediante el uso de mutgenos fsicos y qumicos se ha producido con xito un nmero bastante grande de variedades nuevas y prometedoras en diferentes semillas y plantas ornamentales, y se considera que es una herramienta ms para el cultivo de plantas ornamentales. El mejoramiento por mutacin ha tenido ms xito en las plantas ornamentales porque los cambios en las caractersticas fenotpicas como el color, la forma o tamao de la flor y la variegacin de la clorofila en las

10 rias formas. Se puede incluir una capacidad reducida germinacin cuando se utilizan rganos vegetativos, capacidad de supervivencia, alturas reducidas de plantas, y reducido nmero de rganos de la planta, tales como nmero de hojas. Haba una disminucin de la capacidad de brote con dosis crecientes de rayos gamma. La misma tendencia se repiti en las que las alturas de las plantas, y el nmero de ciertos rganos de la planta, tales como el nmero de hojas se considera. La variabilidad inducida observada en la generacin MV1 (como resultado de la irradiacin gamma) fue el resultado del efecto acumulativo de dao fisiolgico, mutaciones de genes y las mutaciones cromosmicas. Sin embargo, la contribucin de los daos fisiolgicos, es mucho mayor que las contribuciones de la mutacin de genes y las mutaciones cromosmicas en la generacin MV1. Esto se debe a mutaciones genticas y cromosmicas ocurren a muy bajas frecuencias. Las mutaciones genticas y el cromosoma pueden ser transferidos de MV1 en las subsiguientes daos fisiolgicos. A efectos prcticos, la seleccin de mutantes comenz a partir de MV2, una vez que los efectos fisiolgicos pueden haber desaparecido. El rango de dosis ms efectiva para la induccin de mutaciones en las plantas de cultivo propagadas vegetativamente, como los hilos debe ser entre dosificaciones que pueden causar letalidad de no ms de 50% y la reduccin de crecimiento de no ms de 50%. Se recomienda un rango de dosis de tratamiento que debe permitir la supervivencia de 40 -50% con un retraso en el crecimiento de no ms del 50%. Dentro de este intervalo, las poblaciones suficientes de las partes de las plantas tratadas tratan de sobrevivir a los efectos letales de la mutgeno as como la induccin de cambios genticos adecuados para permitir una seleccin ms eficiente de mutantes deseables. Por lo tanto, el intervalo de dosis de rayos gamma de los resultados para la induccin de mutaciones en la muestra blanco, utilizando mini-tubrculos se estableci para ser de 20 - 40 Gy (GR50 fue 30 Gy y DL50 fue 40 Gy). MV2 lneas de ame con caracterstica modificada vegetativo. Uno de los objetivos de mejoramiento gentico, aparte de los rendimientos del tubrculo de alto. Los caracteres asociados con estos mutantes enanos han demostrado ser estable durante tres generaciones. 6. Conclusiones Despus de aos de investigacin aplicada al trabajo de mutagnesis inducida se ha demostrado que la induccin a mutaciones por medio de agentes fsicos y qumicos constituye una herramienta importante para la produccin de nuevos cultivos ornamentales, hortalizas, plantas medicinales, etctera, de importancia comercial y enriquecer el germoplasma de la horticultura en general. Los agentes radioactivos como los rayos gamma son empleados para inducir mutaciones en las cepas y embriones a tratar, esto para conocer de manera general la forma en que acta estos agentes radioactivos en las diferentes especies, las cualidades que pueden varias para cada especie es el tiempo, la densidad de rayo, cantidad de rayo, el nmero de colonias crecidas despus del a exposicin a la radiacin. Es de suma importancia conocer las consecuencias de las inducciones a la mutacin, as como el resultado, ya sea para mejorar a la especie o para tener una nueva, con caractersticas diferentes. Referencias ANISHA, P. N. (JUNIO de 2009). STUDIES ON INDUCING VARIABILITY IN VITRO AND USE OF MYCORRHIZAE IN HARDENING OF GERBERA. DHARWAD. Pabn Caldern, L. A. (2011). Induccin de mutaciones mediante radiaciones gamma de (Passiflor edulis Sim var. edulis). Bogot, Colombia.

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