6. Determinaciones analticas 6.1. Tcnica bsica de cont^je 6.1.1.

En placas Esta tcnica permite la visualizacin de la formacin de colonias a partir de un nmero fijo de clulas viables. Es utilizada, por lo tanto, para obtener contajcs de unidades formadoras de colonias (UFC) presente en la muestra analizada. Los medios de cultivos usados para la obtencin de nmero de colonias pueden ser de uso general: medios con ingredientes nutritivos bsicos enriquecidos, medios con nutriente adicional como sangre, yema de huevo, suero, enriquecidos o no, con sustancias inhibidoras o indicadoras. La aplicacin de la tcnica tiene por base el uso de las diluciones seriadas obtenidas a partir del homogeneizado de la muestra solidas -semislidas o lquidas. Las tcnicas bsicas de contajc en placa incluyen: 6.1.1.1. Cultivo en profundidad Distribuir las alcuotas de las diluciones escogidas en placas de Petri estril. Luego verter 12 a 15 mi del agar. Mezclar y dejar solidificar. Incubar de acuerdo al requerimiento del microorganismo buscado.
6.1.1.2. 6.1.1.3. 6.1.1.4. 6.1.1.5. 6.1.1.6.

Cultivo en superficie Usar medio solidificado ya distribuido en placa. La superficie debe estar seca. La cantidad del inoculo debe ser 0,1 mi. Las otras diluciones que se pueden usar no deben ser mayores a 0,5 mi. Cuidar que el inculo sea depositado en el centro, evitando tocar el

agar

con la punta de la pipeta. 6.1.1.7. Distribuir el inculo con el bastn de vidrio tipo hockey (Drigalski). 6.1.1.8. Invertir la placa e inocular a la temperatura requerida. 6.1.1 J.Cultivo en sobre camada 6.1.1.9. Distribuir la alicuota de las diluciones escogidas en placa de Petri estril 6.1.1.10. Luego de verter 10 a 12 mi de agar; mezclar. 6.1.1.11. Dejar solidificar, luego verter agar fundido. 6.1.1.12. Este sistema se utiliza cuando se pretende recuperar clulas en estrs. 6.1.1.4.Ecometra Este mtodo se utiliza para el control de calidad de los medios de cultivo y est descripto en este manual. Nmero ms probable (NMP) El siguiente es un mtodo que permite estimar la densidad de microorganismos viables presentes en la muestra a ser analizada. a La evaluacin estimativa del nmero de clulas viables presentes es obtenida atravs de 3 diluciones decimales sucesivas y transferida en alcuotas determinadas como 10,1 mi - 0.1 mi de cada dilucin en serie de tubos. 6.1.1.13. Los nmeros de tubos por serie pueden variar de 2 a 10. 6.1.1.14. Los ms utilizados son series de 3-5-10- tubos por diluciones. 6.1.1.15. El resultado de tubos positivos de 3 diluciones es trasladado a las tablas estadsticas que incluyen los lmites de confianza de los NMP de los microorganismos investigados en funcin de la tabla en cuestin.

Mientras que la expresin de NMP es hecha solamente a travs del NMP que corresponde a los tubos positivos por serie, la expresin del NMP por gr. o mi del producto bajo anlisis es hecha considerando el factor de dilucin utilizado. 6.1.1.17. En general las tablas ya estn corregidas, considerando gr. o mi. 6.1.1.18. Consecuentemente para la obtencin del NMP. pueden ser inoculados ms de 3 diluciones seriadas, entretanto para la lectura final del NMP debe considerarse solamente las 3 diluciones ms significativas. 6.1.1.19. Los ejemplos a seguir permiten una seleccin de las diluciones significativas, dentro de las posibilidades descritas.
6.1.1.16.

6.1.2.1.Dilucin (gr o mi) Ejemplos 1.0 1 2 3 4 5 6 3/3' 3/3 3/3 2/3 3/3 3/3 0.1 3/3 3/3 2/3 2/3 3/3 3/3 0.01 0.001 0.0001 Combinacin de tubos l/3b 2/3 0/3 0-3 2/3 2/3 1/3 0/3 1/3 1/3 0/3 1/3 0/3 3-3-1 3-2-1 3-2-0 2-2-0 3-2-1 3-2-1

a = Numerador = N de tubos positivos Denominador N de tubos cultivados b= Dilucin consideradas significativas para la obtencin del NMP

6.1.2.2.Interpretacn Cuando se inoculan mas de 3 diluciones seriadas, seleccionar una dilucin mayor en la cual todos los tubos inoculados son positivos y considerar las 2 diluciones siguientes mayores que la seleccionada (ejemplo 2 y 3). En los casos en que mis de 2 diluciones siguientes a la escogida mostrasen tubos positivos, separar en tubo positivo de mayor dilucin positivo para una inmediatamente anterior, hasta tener resultado que se encuadre en la situacin anterior (ej: 5 y 6). En los casos de que solamente se inoculan 3 diluciones seriadas, proceder a leer directamente en la tabla (ej: 1 y 4). La tcnica del NMP no permite el contaje fijo de clulas viables o de UFC, como ocurre con la tcnica de contaje en placas. El uso de esta tcnica se justifica cuando es ncccsario estimar el nmero de clulas viables no visualizadas por el contaje en placas. Cuanto mayor es el N esperado de microorganismos investigado mayor sera la dilucin usada. La tcnica del NMP debe ser realizada por las siguientes etapas analticas: prueba presuntiva (lectura de la serie de tubos positivos); prueba confirmativa (subcultivo de tubos presuntivos en medio selectivo para el microorganismo investigado) y la prueba completa (identificacin de la especie microbiana presente).

6.13. Recuento de bacterias aerobias mesfilas

Las bacterias aerobias mesfilas constituyen un grupo de microorganismos capaces de crecer en un rango de temperatura de 30 a 37C. La cuantificacin de microorganismos por contaje de colonias, ha sido ampliamente utilizada para determinar poblaciones microbianas viables en los alimentos, este procedimiento est basado en la presuncin de que cada clula microbiana en una muestra se formar a simple vista, con colonias separadas cuando son mezcladas con el agar u otro medio slido que permita su crecimiento. Objetivo Determinar la presencia y cantidad de bacterias aerobias mesfilas en el material analizado. Aplicacin Este mtodo puede ser utilizado para cualquier tipo de muestra, con excepcin de ciertos productos, donde interviene el proceso de fermentacin, tales como ciertos quesos y embutidos, yoghurt o de maduracin natural, ya que stos dan cifras muy elevadas de bacterias. Tambin se puede utilizar para medioambiente, utensilios etc. .U.l.Principios y fundamentos del mtodo El mtodo de contaje de colonias provee una estimacin del nmero de microorganismos viables en una muestra de acuerdo al medio empleado y el tiempo y la temperatura de incubacin. Las clulas microbianas a menudo se encuentran como conjuntos o grupos de clulas, por cuanto, la muestra y las diluciones homogeneizadas pueden uniformemente distribuir los conjuntos de bacterias, ya que estos grupos no pueden ser disgregados completamente por ellos mismos. El mezclado y la dilucin inicial en un blender mecnico pueden proveer mayor rotura a estos grupos. De todos modos, esto no asegura que los microorganismos puedan estar bien distribuidos como clulas libres. Consecuentemente, cada colonia aparece en el Agar Pate puede aparecer como grupos de clulas libres y deben ser referidas como Unidades Formadoras de Colonias (UFC). J. 2. Equipos, materiales y medios de cultivo 6.1.1.20. Estufa de incubacin, 35 1C, con termmetro certificado. 6.1.1.21. Cuenta colonias, campo obscuro, Quebec o equivalente con adecuada superficie ligera y plana. 6.1.1.22. Bao Mara, para temperar el agar, termostticamente controlada. 6.1.1.23. Termmetro de mercurio, con rango apropiado, asegurado por un termmetro certificado, para llevar los registros de las estufas. 6.1.1.24. Balanza aqaltica, con sensibilidad de hasta O.lg. 6.1.1.25. Stomacher y/o blender. 6.1.1.26. Botellas o tubos de dilucin. 6.1.1.27. Botellas y bolsas para stomacher de aproximadamente 300 mi. de capacidad. 6.1.1.28. Tubos de aproximadamente 20 mi, de capacidad.