INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

TESIS

Presentada para obtener el grado de

MAESTRA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

Por

Aurea Victoria Alarcn Elias
Ingeniero Biotecnlogo



PRODUCCIN DE BIOETANOL CON Zymomonas mobilis


Dirigida por

Dr. Enrique Durn Pramo







Mxico, D.F. Junio de 2010.
i
Declaracin de originalidad
ii

iii
CRDITOS

El presente proyecto de investigacin se realiz en el Laboratorio de Bioconversiones del
Departamento de Bioprocesos de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa del
Instituto Politcnico Nacional, bajo la direccin y supervisin del Dr. Enrique Durn Pramo.

El soporte financiero para la realizacin del proyecto de investigacin fue a travs de la
Secretara de Investigacin y Posgrado del IPN, proyectos 20082706 y 20091568 dirigidos y
por el Dr. Enrique Durn Pramo. De igual forma, se agradece al Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnologa (CONACyT) al Programa Institucional de Formacin de Investigadores (PIFI-IPN)
y al mismo Instituto Politcnico Nacional, por las becas otorgadas al alumno para la realizacin
de sus estudios de posgrado.

Tambin se agradece al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Agricultural
Research Service Culture Collection, NRRL) por proporcionarnos a la cepa Zymomonas mobilis
B-806.
iv
AGRADECIMIENTOS
Para ensear a los dems,
primero has de hacer t algo muy duro,
has de enderezarte a ti mismo.
SIDDHARTA GAUTAMA


Al Dr. Enrique Durn Pramo por guiarme a travs de todo este proceso de formacin en el
rea de la investigacin, por su paciencia y compromiso mostrados a lo largo del proyecto de
investigacin y sobre todo por ser una persona con altos valores humanos y morales, que
hacen de l un ejemplo a seguir.

A la Dra. Ma. Del Carmen Oliver Salvador, al Dr. Gustavo Valencia del Toro, al Dr. Jorge Yaez
Fernndez y al Dr. Ramn Villanueva Arce, por sus valiosos comentarios y contribucin hacia
esta investigacin.

A todos mis profesores que dieron lo mejor de s para enriquecer mi vida profesional.

A la M. en C. A. Gabriela Mendoza Madrigal, a la M. en C. Abril Ramrez Higuera y al I. Bt.
Csar A. Jimnez Sierra, por su amistad y todos los momentos de alegra que me hicieron
pasar.

A Rodrigo por ser el motor de mi vida, por creer en m y darme fuerzas para terminar este
proyecto, an en los momentos ms difciles.

A Margarita por ser la precursora de mi educacin. Y ensearme, lo ms importante en la vida,
a soar.

A Gary por acompaarme durante todo este tiempo, darme tanto cario, amor y felicidad sin
pedir nada a cambio.

Y a todas bacterias y tubrculos que dieron su vida para que esta investigacin pudiera ser
llevada a cabo.
Gracias
v
CONTENIDO
Declaracin de originalidad ............................................................................................................ i
Acta de Revisin.....ii
CRDITOS ................................................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................. iv
CONTENIDO ................................................................................................................................. v
NDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ viii
NDICE DE CUADROS ................................................................................................................ xi
1. INTRODUCCIN. ................................................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES. ................................................................................................................ 2
2.1. Biocombustibles. ............................................................................................................ 3
2.1.1. Biocombustibles lquidos. ........................................................................................ 4
2.1.2. Biocombustibles lquidos de primera generacin. ................................................... 4
2.1.3. Biocombustibles lquidos de segunda generacin. ................................................. 5
2.1.4. Biocombustibles lquidos de tercera generacin. .................................................... 5
2.2. Produccin de Bioetanol. ............................................................................................... 7
2.2.1. Materia prima para la produccin de Bioetanol. ...................................................... 7
2.2.2. Microorganismos utilizados en la produccin de Bioetanol. .................................. 19
2.3. Factores tcnicos, econmicos y normativos de los biocombustibles. ........................ 23
2.4. Biocombustibles y medio ambiente. ............................................................................. 25
3. JUSTIFICACIN................................................................................................................. 26
4. OBJETIVOS. ...................................................................................................................... 27
4.1. General. ........................................................................................................................ 27
4.2. Especficos. .................................................................................................................. 27
5. MATERIALES Y MTODOS. ............................................................................................. 28
5.1. Estrategia de trabajo. ................................................................................................... 28
5.2. Fase 1. Seleccin y pre-tratamiento de la materia prima. ............................................ 29
5.2.1. Seleccin y determinacin de la cantidad de almidn soluble en el agua de la
materia prima. ..................................................................................................................... 29
5.2.2. Preparacin de la harina de yuca y malanga. ....................................................... 30
5.2.3. Hidrlisis cida de la harina de Yuca y Malanga. .................................................. 30
vi
5.2.4. Hidrlisis enzimtica de la harina de Yuca y Malanga. ......................................... 33
5.2.5. Cintica de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca. ..................................... 36
5.2.6. Anlisis y cuantificacin de los azcares reductores obtenidos de la hidrlisis
cida y enzimtica de la harina de yuca y malanga usando la tcnica de HPLC (High
performance liquid chromatograpy). ................................................................................... 37
5.3. Fase 2. Seleccin y mantenimiento del microorganismo. ............................................ 42
5.3.1. Seleccin y mantenimiento de la cepa de Zymomonas mobilis NRRL B-806. ...... 42
5.4. Fase 3. Formulacin de los medios de cultivo. ............................................................ 43
5.5. Fase 4. Fermentacin en matraz de los medios de cultivo M1, M2 y M3 con
Zymomonas mobilis. ............................................................................................................... 45
5.5.1. Estimacin de la concentracin de azcares reductores por el mtodo del cido
3,5-dinitrosaliclico (DNS) para la elaboracin de la curva patrn de glucosa. ................... 45
5.5.2. Estimacin de la concentracin de biomasa por peso seco. ................................ 45
5.5.3. Determinacin de la cantidad de etanol mediante la oxidacin del etanol con la
enzima Alcohol Oxidasa. .................................................................................................... 45
5.5.4. Cintica de la fermentacin de los azcares reductores contenidos en los medios
M1, M2 y M3 con la bacteria Zymomonas mobilis B-806. .................................................. 48
5.6. Fase 5. Fermentacin, en un Biorreactor de 2 L New Brunswick Scientific Bioflo 110,
del medio de cultivo M3 con Zymomonas mobilis. ................................................................. 49
5.7. Fase 6. Anlisis estadstico. ......................................................................................... 50
5.8. Material y equipo. ......................................................................................................... 51
5.9. Soluciones. ................................................................................................................... 52
6. RESULTADOS Y DISCUSIN. .......................................................................................... 53
6.1. Seleccin y pre-tratamiento de la materia prima. ......................................................... 53
6.1.1. Determinacin de la cantidad de almidn, soluble al agua, contenido en las races
de yuca, camote y malanga. ............................................................................................... 53
6.2. Hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga. ......................................................... 55
6.3. Hidrlisis enzimtica de la harina de yuca y malanga. ................................................. 65
6.4. Anlisis y cuantificacin de los azcares reductores obtenidos de la hidrlisis cida y
enzimtica de la harina de yuca y malanga usando la tcnica de HPLC (High performance
liquid chromatography). .......................................................................................................... 72
6.5. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en los medios M1, M2 y M3
con la bacteria Zymomonas mobilis NRRL-806. .................................................................... 77
6.6. Fermentacin en un Biorreactor de 2 L New Brunswick Scientific Bioflo 110 con
Zymomonas mobilis NRRL-806. ............................................................................................. 80
7. CONCLUSIONES. .............................................................................................................. 84
vii
8. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 85
9. REFERENCIAS. ................................................................................................................. 86

viii
NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Biocombustibles: desde la materia prima hasta el uso final. Fuente: FAO, 2008. ........ 3
Figura 2. Los biocombustibles lquidos, provenientes de mltiples fuentes de carbono, son una
alternativa energtica a los combustibles convencionales. ................................................ 6
Figura 3. Conversin de materias primas agrcolas en biocombustibles lquidos. Fuente: FAO,
2008. ................................................................................................................................... 8
Figura 4. Raz de la Yuca (Manihot esculenta). Fuente: SAGARPA, 2008. ............................... 11
Figura 5. Malanga (Colocasia esculenta Schott). Fuente: Comisin Veracruzana de
Comercializacin Agropecuaria, 2006. ............................................................................. 13
Figura 6. Segmento trisacrido de una porcin no ramificada de una molcula de amilosa o
amilopectina. Fuente: BeMiller y Whistler, 1996. .............................................................. 15
Figura 7. Representacin de una porcin de una molcula de amilopectina. Fuente: BeMiller y
Whistler, 1996. .................................................................................................................. 16
Figura 8. Clulas resuspendidas de Z. mobilis CP4 (5600x). Fuente: Electronic Journal of
Biotechnology, 2008. ........................................................................................................ 21
Figura 9. Estrategia de trabajo. .................................................................................................. 28
Figura 10 . Metodologa de la extraccin de almidn en tubrculos.Fuente: Liu, 1997 en Liu,
2003. ................................................................................................................................. 29
Figura 11. Hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga. ...................................................... 30
Figura 12 .Curva patrn realizada para determinar la cantidad de azcares reductores con el
mtodo del DNS. La ecuacin de regresin de la curva es: y=0.3906x - 5x10
-5
y su
R
2
=0.99. ............................................................................................................................ 33
Figura 13. Metodologa utilizada para llevar a cabo la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca
y malanga. ........................................................................................................................ 35
Figura 14. Ensayos realizados para el Diseo Experimental de la hidrlisis enzimtica de la
harina de yuca y malanga. Imagnes: Tubo eppendorf (Clker.com by Brain Waves),
Termomixer Comfort (http://www.eppendorf.com). ........................................................... 36
Figura 15. Sistema montado para la realizacin de la cintica enzimtica de la harina de yuca.
.......................................................................................................................................... 36
Figura 16. Sistema de filtracin Millipore. Fuente: Millipore
TM
.................................................... 37
Figura 17.Curva tipo de la Glucosa, pico I.La ecuacin de regresin es: y=189959x-22371,
R
2
=0.995. .......................................................................................................................... 41
Figura 18. Curva tipo de la Glucosa, pico II.La ecuacin de regresin es: y=112232x-14019,
R
2
=0.994. .......................................................................................................................... 41
ix
Figura 19. Curva tipo de la Maltosa. La ecuacin de regresin es: y=193787x-2631.3,
R
2
=0.990. .......................................................................................................................... 42
Figura 20.Curva patrn realizada para determinar la cantidad de etanol mediante la oxidacin
de etanol con la enzima Alcohol Oxidasa. La ecuacin de regresin de la curva es:
y=47.851 0.0067 y su R
2
=0.993. .................................................................................... 48
Figura 21. Diagrama de la cintica de crecimiento, consumo y produccin de bioetanol. ......... 48
Figura 22. Biorreactor New Brunswick Scientific Bioflo 110 2 L conectado al mdulo de control.
.......................................................................................................................................... 49
Figura 23. Diagrama de la cintica de fermentacin en un Biorreactor de 2 L. ......................... 50
Figura 24. Yuca (Manihot esculenta). Malanga (Colocasia esculenta). .................................... 55
Figura 25. Grfica normal de los efectos estandarizados, que muestra la significancia de los
efectos encontrados en a) La hidrlisis cida de la harina de malanga y b) La hidrlisis
cida de la harina de yuca. ............................................................................................... 58
Figura 26. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados, en donde se observan los
efectos de los factores estudiados en a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la
hidrlisis cida de la harina de yuca. ................................................................................ 59
Figura 27. Grfica de los efectos principales, en donde se observa el efecto de los factores
evaluados en a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la hidrlisis cida de la
harina de yuca. ................................................................................................................. 61
Figura 28. Grfica de contornos, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b)
la hidrlisis cida de la harina de yuca. ............................................................................ 62
Figura 29. Superficie de respuesta de a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la
hidrlisis cida de la harina de yuca. ................................................................................ 64
Figura 30. Grfica de contornos, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga
y b) la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca. ............................................................. 68
Figura 31. Superficie de respuesta, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga
y b) la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca. ............................................................. 70
Figura 32.Reaccin de intercambio inico en la Columna SUPELCOGEL
TM
Ca. ...................... 73
Figura 33. Cromatogramas de los hidrlizados de a) la harina de malanga y b) la harina de
yuca; producidos en la reaccin de hidrlisis cida. ......................................................... 75
Figura 34. Cromatograma del hidrolizado producido en la hidrlisis enzimtica de la harina de
yuca. ................................................................................................................................. 76
Figura 35. Cinticas de fermentacin de Z. mobilis. B-806 con a)Medio, b)Medio 2 y c) Medio 3.
.......................................................................................................................................... 78
x
Figura 36. Grfica de la cintica de fermentacin de azcares reductores (hidrolizado de la
harina de yuca) en un Biorreactor de 2L a) con intercambio de oxgeno b) sin intercambio
de oxgeno. ....................................................................................................................... 82



xi
NDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Produccin de biocombustibles por pases, 2007. ...................................................... 5
Cuadro 2. Rendimiento de los biocombustibles con diferentes materias primas, a nivel mundial
y por pases. ....................................................................................................................... 9
Cuadro 3. Rendimiento potencial hipottico para el etanol procedente de los principales cultivos
de cereales y de azcar. ................................................................................................... 10
Cuadro 4. Composicin qumica de 100 gramos de yuca (base hmeda). ............................... 12
Cuadro 5. Patrones de uso mundial de yuca. ............................................................................ 12
Cuadro 6. Composicin qumica de 100 gramos de camote. .................................................... 13
Cuadro 7. Composicin qumica de 100 gramos de malanga (base hmeda). ......................... 14
Cuadro 8. Diseo Experimental Factorial 2
3
para la hidrlisis cida de la harina de yuca y
malanga. ........................................................................................................................... 31
Cuadro 9. Diluciones para la curva patrn de glucosa. .............................................................. 32
Cuadro 10. Diseo Experimental Central 2
3
de la hidrlisis de la harina de yuca y malanga. ... 34
Cuadro 11. Diluciones para la curva patrn de glucosa para la calcular la concentracin de este
azcar en los hidrlizados ................................................................................................ 39
Cuadro 12. Diluciones para la curva patrn de maltosa. ........................................................... 40
Cuadro 13. Medio YP (Yeast-Peptone). ..................................................................................... 43
Cuadro 14. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M1). ........................ 44
Cuadro 15. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M2). ........................ 44
Cuadro 16. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M3). ........................ 44
Cuadro 17. Diluciones para la curva patrn de etanol. .............................................................. 47
Cuadro 18. Concentracin de almidn en 100 gramos de tubrculo en base hmeda . ........... 54
Cuadro 19. Diseo Experimental Factorial 2
3
de la hidrlisis cida de la harina de malanga. .. 56
Cuadro 20. Diseo Experimental Factorial 2
3
de la hidrlisis cida de la harina de yuca. ......... 56
Cuadro 21. Diseo Experimental Central Factorial 2
3
de la hidrlisis enzimtica de la harina de
malanga. ........................................................................................................................... 65
Cuadro 22. Diseo Experimental Central Factorial 2
3
de la hidrlisis enzimtica de la harina de
yuca. ................................................................................................................................. 66
Cuadro 23. Tiempo de retencin de los azcares que pueden separarse con la Columna
SUPELCOGEL
TM
Ca.Fuente: Sigma-Aldrich Co, No. De catalogo: 59305-U. .................. 73
Cuadro 24. Tiempos de retencin de los azcares de intres para la produccin de etanol con
una velocidad de flujo de 0.8 mL/min................................................................................ 74
Cuadro 25. Etanol producido a las 72 h de fermentacin con cada medio de cultivo evaluado. 77
xii
Cuadro 26. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en el Medio 3, Biorreactor
con intercambio de oxgeno. ............................................................................................. 80
Cuadro 27. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en el Medio 3, Biorreactor
sin intercambio de oxgeno. .............................................................................................. 81































xiii

RESUMEN

El desarrollo de un proceso de fermentacin usando fuentes de carbono econmicas es de
suma importancia para la produccin de biocombustibles en una escala comercial. La
rentabilidad del proceso de fermentacin depende en gran parte del pre-tratamiento que se le
d a la materia prima. El almidn es, despus de la celulosa, la principal sustancia glucdica
sintetizada por los vegetales superiores a partir de la energa solar por el proceso de
fotosntesis. Las fuentes de almidn ms importantes son los granos de cereal, los granos de
leguminosas y los tubrculos. Existen varios mtodos fsicos, qumicos y biolgicos para
hidrolizar los enlaces de las cadenas del almidn y de esta forma obtener azcares
fermentables.

En el estudio de la hidrlisis cida del almidn contenido en la harina de yuca y malanga se
consideraron tres factores: temperatura, concentracin de H
2
SO
4
y tiempo. Se aplicaron el
anlisis de varianza realiz (ANOVA) y un diseo factorial 2
3
para caracterizar dichos factores.
Se encontr, con un 95% de confianza, que las mejores condiciones para la hidrlisis del
almidn de yuca y malanga fueron: 5% de H
2
SO
4
, 5 horas y 95 C, los rendimientos de
obtencin de 0.52 g
glucosa
/g
harina de yuca
y 0.79 g
glucosa
/g harina
de malanga
. En el caso de la hidrlisis
enzimtica se llev a cabo un diseo factorial central 2
3
, un anlisis de superficie de respuesta
y un anlisis de varianza. Esto con el fin de determinar las mejores condiciones para la
hidrlisis enzimtica de la harina de yuca y malanga usando a las enzimas -amilasa y
amiloglucosidasa en sinresis. Tres de los factores considerados importantes para la reaccin
fueron estudiados: temperatura, pH y tiempo de hidrlisis. El anlisis de superficie de respuesta
mostr que la respuesta fue mnima en los puntos centrales para ambos casos tubrculos y
que, con un nivel de confianza del 95%, las mejores condiciones para la hidrlisis enzimtica
fueron: 73.6 C, pH 4.08 y 24h, con un rendimiento de 0.64 g glu / g de harina de yuca.

Se evalu la produccin de etanol con el hidrolizado de la harina de yuca, utilizando tres
diferentes medios de cultivos en una fermentacin en lote. La adicin de extracto de levadura,
KH
2
PO
4
y peptona de casena en el medio de cultivo provoc un incremento significativo en la
produccin de etanol con esta cepa. Z. mobilis NRRL-806 produjo 13.27 g/L de etanol a partir
de una concentracin de azcares de 20g/L, una temperatura de 28 C, un pH 6.8, 72 h de
fermentacin y agitacin de 100 rpm.



xiv


ABSTRACT

Development of a fermentation process using economic carbon sources is extremely important
for commercial scale biofuel production. Profitability of the fermentation process depends mainly
on the pretreatment given to the raw materials. Starch is the principal glucidic substance
synthesized by superior vegetables from solar energy through photosynthesis. There are many
physical, chemical and biological methods to hydrolyze starch chain bonds and in this way to
obtain fermentable sugars. In this work, the acidic and enzymatic hydrolysis conditions for yucca
and malanga starch were studied through a statistical analysis in order to obtain the highest
yield of fermentable sugars.

Analysis variance study (ANOVA) and a 2
3
factorial design were performed to study three
important factors in acidic hydrolysis: temperature, H
2
SO
4
concentration and time. It was found,
with a 95% of confidence, the best hydrolysis conditions for the yucca and malanga starch
were: 5% H
2
SO
4
, 5 h and 95C; obtaining yields of 0.52 g glu/g of yucca flour and 0.79 g glu/g
of malanga flour. A 2
3
central design and a response surface analysis were performed in order
to determine the best conditions for the enzymatic hydrolysis of yucca and malanga flour starch
with -amylase and amiloglucosidase in synaeresis. Three of the factors considered important
for the reaction were studied: temperature, pH and hydrolysis time. Response surface analyses
showed that the response was minimal in the central points for both tubers and that, with a 95%
confidence, the best conditions for the enzymatic hydrolysis were: 73.6C, pH 4.08 and 24 h,
with a yield of 0.64 g glu/g of yucca flour.

Ethanol production from enzymatically hydrolysed yucca starch was analyzed under three
different culture media conditions in batch fermentation. Addition of yeast extract, KH
2
PO
4
and
casein peptone in culture media did significantly increase ethanol production by this strain.
Zymomonas mobilis NRRL-806 produced 13.27 g/litre ethanol from 20 g/litre initial sugar
concentration, temperature of 28C, time of fermentation of 72 h and 100 rpm.




1
1. INTRODUCCIN.

Desde que la humanidad comenz a poblar la tierra tuvo necesidades de distintos tipos, una de
las ms importantes es la de tipo energtica, para proveerse de luz, fuego, comida, etc. Con el
paso del tiempo estas poblaciones fueron creciendo convirtindose en grandes ciudades, por
su tamao e infraestructura comenzaron a demandar una mayor cantidad de energa. En la
actualidad, estas urbes, dependen en gran parte de la energa obtenida de diferentes fuentes,
como lo son las de origen: fsil, hdrica, geotrmica, desechos, carbn y biolgico.

De acuerdo con la Agencia Internacional de Energa (IEA, por sus siglas en ingls) hasta el
2006 el suministro mundial de energa primaria era de 11741 Mtoe (Millones de toneladas
equivalentes de petrleo), de esta cantidad slo se consumieron 8084 Mtoe, de los cuales el
43.1 % corresponden al petrleo, 12.9% a combustibles renovables y desechos, el resto
corresponde a carbn vegetal, gas, energa nuclear e hidroelctrica. Es clara la evidencia de
que an se tiene una gran dependencia de la energa de origen fsil. Sin embargo, los ltimos
aos se ha ido demostrando que este tipo de energa contribuye en gran parte a la
contaminacin atmosfrica, adems de que algunos de los pozos petroleros estn llegando a
su mxima produccin.

Debido a esta problemtica la mayora de los gobiernos del mundo, como el brasileo, buscan
la independencia de este tipo de energa. Desde 1975 Brasil empez a crear el programa
ProAlcool, que propona utilizar etanol, proveniente de la fermentacin de azcar de caa,
como combustible para automviles. A este pas le sigui Estados Unidos, que desde 1978
empez a crear programas con el mismo objetivo.

Recientemente diferentes naciones, incluidas Mxico, han mostrado inters por la creacin de
programas destinados a la produccin de energa de tipo renovable, en especfico de
biocombustibles.

Aunque la industria de biocombustibles ha ido creciendo los ltimos aos, las cantidades
producidas a partir de cultivos como la caa y el maz no cubren la demanda mundial de
energticos, ni siquiera del sector de transporte. Es por esto que, a nivel internacional, se estn
buscando fuentes alternativas, de la cuales se puedan obtener biocombustibles.

En este trabajo se estudiaron dos posibles fuentes de carbono para la produccin de bioetanol,
su pre-tratamiento y la fermentacin de los azcares obtenidos con Zymomonas mobilis.


2
2. ANTECEDENTES.

La bioenerga es definida por la FAO como la energa producida a partir de biomasa, como
cultivos energticos, residuos forestales y desechos orgnicos. Si esta materia prima se
produce de forma sostenible, se puede considerar una fuente de energa renovable. La
biomasa se puede utilizar para producir energa de forma directa (incinerndola), combustibles
lquidos o gases, sin embargo, en la actualidad se ha prestado la mayor atencin a la
produccin de biocombustibles lquidos, utilizados en su totalidad por el sector de los
transportes (FAO, 2008a).

En el mbito econmico, la demanda de biocombustibles podra beneficiar al sector agrcola
permitiendo a los pases en desarrollo, que dependen en gran parte de la agricultura para su
sustento, la oportunidad de utilizar el crecimiento agrcola para aumentar el desarrollo rural y
reducir la pobreza.

En los pases de la Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmico (OCDE), entre
estos Mxico, los biocombustibles han sido promovidos mediante polticas impulsadas por los
objetivos de seguridad energtica, mitigacin del cambio climtico mediante la reduccin de las
emisiones de gases efecto invernadero, inters de apoyar la agricultura y el desarrollo rural.

Mundialmente los biocombustibles producidos a mayor escala son el bioetanol y el biodiesel.
Brasil y Norteamrica son las nicas regiones del mundo que producen grandes cantidades de
etanol como combustible a partir de azcar de caa y maz (Wheals et al., 1999). Mientras que,
el principal productor de biodiesel es Europa, usando como fuente primaria el aceite de
diversos tipos de semillas.












3
2.1. Biocombustibles.

Por su origen, se podra decir que los biocombustibles son una fuente de energa renovable, ya
que son una forma de energa solar transformada. Se pueden producir a partir de una amplia
gama de fuentes de biomasa, como: alimentos, fibras y residuos de madera, cultivos
energticos, cultivos de rotacin breve y desechos agrcolas (Figua 1).

Los biocombustibles se pueden clasificar segn la fuente de la cual se derivan, como productos
forestales, agrcolas y pesqueros o desechos municipales, as como de la industria alimentaria.
Se clasifican segn su tipo en slidos, como la lea; en lquidos, como el etanol y biodiesel; o
gaseosos, como el biogs.



Figura 1. Biocombustibles: desde la materia prima hasta el uso final. Fuente: FAO, 2008a.
RECURSOS
MATERIAS PRIMAS
BIOCOMBUSTIBLES
USO FINAL
Tierra
Agua
Mano de Obra
Semillas
Nutrientes
Energa

Caa de azcar
Remolacha
Maz
Trigo
Colza
Aceite de palma
Pasto
Sauce
Etanol
Biodiesel
Madera combustible
Carbn vegetal
Bagazo
Biogs

Transporte
Calefaccin
Electricidad

4
Tambin se pueden catalogar como biocombustibles primarios (sin elaborar) y secundarios
(elaborados). En el primer grupo encontramos a la lea, astillas, etc. Su combustin es de
forma directa y en general se usa para cocinar o generar calor. Los del segundo grupo, por
ejemplo el etanol, biodiesel, biogs, carbn vegetal, gas de sntesis y el hidrgeno; pueden
ocuparse en ms aplicaciones, como los transportes y los procesos industriales (FAO, 2008a).


2.1.1. Biocombustibles lquidos.
Como se mencion anteriormente, los biocombustibles lquidos se utilizan principalmente en los
transportes. Aunque su produccin slo cubre parte de la demanda mundial, se estima que a
futuro su uso y produccin aumenten en los siguientes aos. Los ms importantes, debido al
crecimiento de su produccin, son el bioetanol y el biodiesel.


2.1.2. Biocombustibles lquidos de primera generacin.
La primera generacin de biocombustibles se refieren a aquellos realizados utilizando cultivos
bsicos como: azcar, almidones, aceites vegetales, grasa animal y tecnologas
convencionales (GBEP, 2007).

En la actualidad, aproximadamente el 85 % de la produccin mundial de biocombustibles
lquidos est representada por el etanol (Cuadro 1). Los principales productores de bioetanol,
Brasil y Estados Unidos de Amrica, aportan casi el 90 % de la produccin mundial, el 10 %
restante se divide entre Canad, China, la Unin Europea y la India. La produccin de biodiesel
se concentra principalmente en la Unin Europea, aportando cerca del 60 % del total,
entretanto los Estados Unidos de Amrica contribuye con una fraccin considerablemente
menor (AIE, 2004).

El mayor contenido de oxgeno del biodiesel facilita la combustin y reduce as las emisiones
de contaminantes del aire en partculas, monxido de carbono e hidrocarburos. El aceite para
producir biodiesel, se puede obtener de casi cualquier cultivo oleaginoso, como el ricino, la
palma, algodn, soja, girasol, colza y coco. Tambin se puede utilizar grasa animal extrada del
procesamiento del pescado y otros animales (FAO, 2008a).




5
Cuadro 1. Produccin de biocombustibles por pases, 2007.
PAS/GRUPO DE
PASES ETANOL BIODISEL TOTAL
(Millones de
litros)
(Mtoe)* (Millones de
litros)
(Mtoe) (Millones de
litros)
(Mtoe)
Brasil 19 000 10,44 227 0,17 19 227 10,60
Canad 1 000 0,55 97 0,07 1 097 0,62
China 1 840 1,01 114 0,08 1 954 1,09
India 400 0,22 45 0,03 445 0,25
Indonesia 0 0,00 409 0,30 409 0,30
Malasia 0 0,00 330 0,24 330 0,24
Estados Unidos de
Amrica
26 500 14,55 1 688 1,25 28 188 15,80
Unin Europea 2 253 1,24 6 109 4,52 8 361 5,76
Otros 1 017 0,56 1 186 0,88 2 203 1,44
Mundo 52 009 28,57 10 204 7,56 62 213 36,12
Fuente: Datos provenientes de la base de datos OCDE-FAO AgLink-Cosimo.
*Nota: Mtoe (Millones de toneladas equivalentes de petrleo).

2.1.3. Biocombustibles lquidos de segunda generacin.
La segunda generacin de biocombustibles, incluye aquellos realizados a partir de materia
prima proveniente de biomasa lignocelulsica. Aunque este tipo de combustible todava no se
produce a escala industrial, se espera que los procesos para su produccin sean viables en los
prximos 10 aos (FAO, 2008a).

2.1.4. Biocombustibles lquidos de tercera generacin.
Esta tecnologa consiste en la utilizacin de algas para producir biocombustibles. Las algas
son organismos unicelulares procariotas y autotrficos que llevan a cabo la fotosntesis
oxignica y acumulan glucgeno (azcar) como la principal forma de carbono almacenado. El
alga verdeazulada prolifera rpidamente y utiliza de manera eficiente la radiacin solar, CO
2
y
elementos inorgnicos, utilizan la fotosntesis como medio para capturar de manera eficiente la
energa del sol para convertirla en azcar intracelularmente, lo que les proporciona la energa
para crecer y reproducirse. Actualmente existen algas modificadas genticamente para la
produccin directa de etanol (Biofields, 2010).





6


Figura 2. Los biocombustibles lquidos, provenientes de mltiples fuentes de carbono, son una
alternativa energtica a los combustibles convencionales. (Tomado de Biofields 2010; Carrillo, 2007; y
CIIEMAD, 2007).























7
2.2. Produccin de Bioetanol.

El etanol es un excelente combustible, puede ser mezclado con gasolina o quemarse puro en
motores de encendido por chispa ligeramente modificados. Un litro de etanol contiene
alrededor del 66 % de la energa suministrada por un litro de petrleo y mezclado con gasolina
para el trasporte, mejora el rendimiento de esta ltima (AIE, 2004). En Estados Unidos y Brasil
se mezcla del 10 al 22% de etanol en gasolina (Wyman, 1994 citado en Prasad et al., 2007).
Esta mezcla da como resultado un combustible que contiene 35% de oxgeno lo que reduce las
emisiones de dixido de carbono y xido de nitrgeno en la combustin (Wheals et al., 1999).
Si el etanol se usa directamente (95% etanol y 5% de agua) como combustible, podra proveer
grandes beneficios ambientales debido a su baja presin y la reduccin de emisiones en la
atmsfera y as realizar una combustin ms limpia, reduciendo las emisiones de dixido de
carbono, monxido de carbono y ozono (Lynd et al., 1991citado en Prasad et al., 2007). En
comparacin con la gasolina, el etanol contiene slo una cantidad mnima de azufre; por tanto,
en la combustin del etanol o de la mezcla de etanol con gasolina producira menores
emisiones de xido de azufre, componente carcinognico de la lluvia cida (FAO, 2008a).

El etanol se produce, principalmente, a partir de azcar o almidn, la primera se obtiene de la
caa de azcar, la remolacha azucarera y el sorgo azucarado; mientras que el segundo
proviene del maz, el trigo y la yuca.
A nivel internacional, Brasil es reconocido por ser el precursor en introducir el etanol como
biocombustible. Actualmente, junto con Estados Unidos de Amrica, sigue siendo uno de los
mayores productores de etanol; sin embargo, debido a las polticas actuales muchos otros
pases estn aumentando su produccin rpidamente. Entre estos pases se encuentran China,
India, Tailandia y varios pases africanos (Wheals et al., 1999).


2.2.1. Materia prima para la produccin de Bioetanol.
Debido a la expansin y crecimiento de la industria de los bioenergticos, el sector
agropecuario a ido tomado un papel econmico muy importante a nivel internacional, ya que es
el principal proveedor de materia prima para la produccin de biocombustibles lquidos para el
transporte, en particular del etanol, producido a partir de cultivos de azcar y almidn, o del
biodiesel derivado de cultivos oleaginosos. En mayor proporcin, la produccin mundial de
etanol proviene de la caa de azcar y maz, entre otros cultivos importantes se encuentra la
yuca, el arroz, la remolacha azucarera y el trigo.

8
En el caso del biodiesel, las materias primas de mayor uso son la colza en la Unin Europea, la
soya en los Estados Unidos de Amrica y Brasil y los aceites de palma y coco en los pases
tropicales y subtropicales (Figura 3).


Figura 3. Conversin de materias primas agrcolas en biocombustibles lquidos. (Fuente: FAO,
2008).

Existen grandes diferencias entre los cultivos en relacin a su rendimiento de biocombustible
por hectrea, estas variaciones dependen principalmente de la materia prima, del sistema de
produccin y pas donde se produce (Cuadro 2). Hasta hoy, la produccin de etanol a partir de
la caa de azcar o de la remolacha azucarera muestra los mayores rendimientos, siendo
Brasil el primer lugar de los pases que producen etanol en lo que se refiere a rendimiento de
biocombustible por hectrea. Los rendimientos en el caso del maz son por poco ms bajos; sin
embargo, lo que cuesta producir biocombustibles a partir de un determinado cultivo y pas
puede seguir patrones muy diferentes (Rajagopal et al., 2007, datos mundiales; Naylor et al.,
2007).
CULTIVOS FECULENTOS
MATERIALES CELULSICOS
Maz
Trigo
Cebada
Centeno
Papas
Yuca
Pasto varilla
Miscanto
Sauce
lamo
Tallos triturados de las cosechas
Colza
Palma de aceite
Soja
Girasol
Man
Jatrofa
CULTIVOS OLEAGINOSOS
CULTIVOS DE AZCAR
Caa de azcar
Remolacha azucarera
Sorgo dulce
Fermentacin
y destilacin
Sacarificacin,
fermentacin
y destilacin
Extraccin
y esterificacin
ETANOL
BIODISEL

9
De acuerdo al World Energy Outlook (AIE, 2006), en una proyeccin al 2030, se pronostica un
aumento de la proporcin de la tierra cultivable a nivel mundial dedicada a cultivar biomasa
para biocombustibles lquidos del 1 % en 2004 al 2,5 % en 2030. Conforme al escenario de
poltica alternativa, para el 2030 esa proporcin habr aumentado el 3,8 %. En los dos casos,
los pronsticos se basan en la hiptesis de que los biocombustibles lquidos se producirn a
partir de cultivos convencionales. Por otra parte, en caso de que se encuentre una tecnologa
que permita la comercializacin de biocombustibles lquidos de segunda generacin antes del
2030, la AIE predice que la proporcin mundial de biocombustibles de la demanda de
transporte aumentar en 10 % en lugar del 3 %. Las necesidades del uso de la tierra se
incrementarn slo el 4,2 % de la tierra cultivable, debido a rendimientos ms altos de energa
por hectrea y al uso de biomasa para producir combustibles.

Cuadro 2. Rendimiento de los biocombustibles con diferentes materias primas, a nivel
mundial y por pases.
CULTIVO ESTIMACIN
BIOCOM-
BUSTIBLE
RENDIMIENTO
DEL CULTIVO
EFICIENCIA
DE LA
CONVERSIN
RENDIMIENTO DE
BIOCOMBUSTIBLE
(Toneladas/ha) (Litros/tonelada) (Litros/ha)
Remolacha
azucarera
Mundial Etanol 46,0 110 5 060
Caa de azcar Mundial Etanol 65,0 70 4 550
Yuca Mundial Etanol 12,0 180 2 070
Maz Mundial Etanol 4,9 400 1 960
Arroz Mundial Etanol 4,2 430 1 806
Trigo Mundial Etanol 2,8 340 952
Sorgo Mundial Etanol 1,3 380 494
Caa de azcar Brasil Etanol 73,5 74,5 5 476
Caa de azcar India Etanol 60,7 74,5 4 522
Palma de
aceite
Malasia Biodiesel 20,6 230 4 736
Palma de
aceite
Indonesia Biodiesel 17,8 230 4 092
Maz
Estados Unidos
de Amrica
Etanol 9,4 399 3 751
Maz China Etanol 5,0 399 1 995
Yuca Brasil Etanol 13,6 137 1 863
Yuca Nigeria Etanol 10,8 137 1 480
Soja
Estados Unidos
de Amrica
Biodiesel 2,7 205 552
Soja Brasil Biodiesel 2,4 205 491
Fuente: Rajagopal et al., 2007, datos mundiales; Naylor et al., 2007, datos nacionales

10
Las perspectivas de que las actuales tecnologas de biocombustibles sustituyan a los
combustibles fsiles se ilustran a travs de un clculo hipottico, mediante estimaciones
tericas de la produccin mundial de etanol a partir de los principales cultivos de azcar y
cereales, sobre la base de los rendimientos medios a nivel mundial y la eficiencia en materia de
conversin ms comnmente citada, en el Cuadro 3 se resumen los resultados de esas
estimaciones. Los cultivos de los que se hace alusin en el Cuadro 3 representan el 42 % de
toda la tierra cultivable actualmente disponible. La conversin de toda la produccin de cultivos
en etanol correspondera al 57 % del consumo total de gasolina. Una teora ms realista,
presupone que slo el 25 % de cada uno de estos cultivos se destinara a la produccin de
etanol y que slo el 14 % de consumo de gasolina podra sustituirse por etanol (Rajagopal et
al., 2007).

Cuadro 3. Rendimiento potencial hipottico para el etanol procedente de los principales
cultivos de cereales y de azcar.
CULTIVO
SUPERFICIE
MUNDIAL
PRODUCCIN
MUNDIAL
RENDIMIENTO
DEL BIOCOM-
BUSTIBLE
MXIMO
DE
ETANOL
EQUIVALEN-
TE DE
GASOLINA
SUMINISTRO COMO
CUOTA DEL TOTAL
MUNDIAL DE
UTILIZACIN DE
GASOLINA EN 2003
1


(Millones de
ha)
(Millones de
toneladas)
(Litros/ha)
(Miles
de
millones
de litros)
(Miles de
millones de
litros)
(Porcentaje)
Trigo 215 602 952 205 137 12
Arroz 150 630 1 806 271 182 16
Maz 145 711 1 960 284 190 17
Sorgo 45 59 494 22 15 1
Caa de
azcar
20 1 300 4 550 91 61 6
Yuca 19 219 2 070 39 26 2
Remolacha
azucarera
5,4 248 5 060 27 18 2
Total 599 940 630 57
Nota: = no aplicable.
1
Utilizacin mundial de gasolina en 2003 = 1,1 billones de litros (Kim y Dale, 2004).

De acuerdo a estos datos, es de esperar que los biocombustibles sustituyan slo de manera
limitada a los combustibles fsiles. Aun as, por limitada que sea su contribucin al suministro
total de energa, los biocombustibles podran tener un impacto positivo para la agricultura y los
mercados agrcolas.


11
En una simulacin de tres proyectos en China, basados en la variabilidad de precios de
diferentes materias primas (yuca, trigo y maz) comparados con el petrleo; se calcularon, bajo
una serie de hiptesis de precios, el VNA (valor neto actual) y la TIR (tasa interna de
rentabilidad) de las inversiones; se demostr que el proyecto de la yuca tena un VNA positivo y
una TIR que superaba el 12 % en la mayora de hiptesis y que, en efecto, era posible que
fuera competitivo desde un punto de vista econmico. Los proyectos del maz y trigo, tenan
VNA bajos o incluso negativos, por lo que no seran econmicamente viables sin subsidios (Yu
y Tao, 2008). La imposibilidad econmica de los proyectos de maz y trigo, se atribuyen a los
altos costos de la materia prima, porque superaban en un 75 % los costos de produccin.

2.2.1.1. Yuca (Manihot esculenta).
La yuca (Manihot esculenta) es un tubrculo perteneciente a la familia Euphorbiacea y al
gnero Manihot, siendo la del tipo Manihot esculenta Crant la que es comercialmente conocida,
es un arbusto ramificado, de hasta 2.5 m de altura, con flores color amarillo verdoso, la raz
alcanza hasta 8 cm de dimetro y 90 cm de longitud y son comestibles (Figura 4). La Yuca
presenta gran tolerancia a condiciones ambientales extremadamente duras, se adapta
fcilmente a diferentes ecosistemas, soporta la sequa, es resistente a plagas, necesita pocos
fertilizantes, plaguicidas y agua; y es de fcil almacenamiento bajo tierra (Westby, 2002).


Figura 4. Raz de la Yuca (Manihot esculenta). Fuente: SAGARPA, 2008.

Para su cultivo se requiere suelo de preferencia suelto, profundo y con algo de materia
orgnica. Sus races contienen una gran reserva de carbohidratos, la mayora de stos son
almidn (31% peso fresco). En el Cuadro 4 se presenta la composicin qumica de la raz de la
yuca.

12
Cuadro 4. Composicin qumica de 100 gramos de yuca (base hmeda).
COMPONENTE RAZ
Humedad (g) 62.8
Protena (g) 0.53
Grasa (g) 0.17
Carbohidratos (g) 31.0
Fibra (g) 1.48
Cenizas (g) 0.84
Calcio (mg) 20.0
Fsforo (mg) 46.0
Hierro (mg) 0.23
Energa (kJ 100 g
-1
) 580
Fuente: Bradbury and Holloway, 1988.

Estadstica mundial, nacional y estatal.
El uso de la Yuca a nivel mundial para 1993 fue de 172 millones de toneladas y se espera que
para el 2020 esta cifra se incremente hasta 275 millones de toneladas (International Food
Policy Research Institute, 2010). En otro estudio se predijo que la demanda y produccin de la
yuca aumentara a 291 millones de toneladas en el 2020 (Scott et al., 2000). En proyecciones
de ambos estudios se determin que frica era el mayor consumidor de la yuca, su consumo
equivale al 62% de la produccin mundial. De acuerdo a Cock (1985), en el continente
Americano el 33.4 % del uso total de yuca es para alimento de animales y slo el 9.6 % se usa
como almidn, ver cuadro 5.

Cuadro 5. Patrones de uso mundial de yuca
1
.

REA
CONSUMO
HUMANO-
FRESCO
CONSUMO
HUMANO-
PROCESADO
ALIMENTO
PARA
ANIMALES
ALMIDN
EXPORTA-
CIONES
DESECHOS
Mundo (%) 30.8 33.8 11.5 5.5 7.0 10.0
frica (%) 37.9 50.8 1.4 < 1 < 1 9.5
Amrica (%) 18.5 23.9 33.4 9.6 < 1 14.0
Asia (%) 33.6 21.7 2.9 8.6 23.0 6.3
Fuente: Cock, 1985.



1
Las cifras mostradas son porcentajes de la produccin total en cada regin.

13
2.2.1.2. Camote (Ipomea batatas).
El camote (Ipomea batatas) es el sptimo lugar, despus del trigo, arroz, papa, cebada y yuca,
de los cultivos ms importantes del mundo (Ray y Ravi, 2005 en Panda et al., 2007). El camote
es rico en almidn (12-25%, peso fresco), puede servir como buen sustrato para la
fermentacin (Ray y Ward, 2006; Panda et al., 2007) y del 40-55% de su composicin en peso
seco es almidn (Zhang y Oates,1999 en Ridley et al., 2005). Las races del camote son ricas
en almidn, azcares, vitamina C, provitamina A, hierro y algunos minerales (Woolfe, 1992 en
Panda et al., 2007).
Cuadro 6. Composicin qumica de 100 gramos de camote.
COMPONENTE (g/kg) VALOR PROMEDIO
2

Humedad 75.53.9
Protena 3.40.2
Almidn 14.83.5
Azcares totales 2.40.3
Fibra diettica 1.90.3
Ceniza 0.90.2
Fuente: Panda et al, 2007.


2.2.1.3. Malanga (Colocasia esculenta Schott).
La malanga, tambin conocida como Taro, Dashen o ame, es una planta que alcanza una
altura de 1 a 3 metros, sin tallo areo. El tallo central es elipsoidal, conocido como cormo y es
rico en carbohidratos (18-30% en base fresca), (Figura 5).


Figura 5. Malanga (Colocasia esculenta Schott). (Fuente: Comisin Veracruzana de Comercializacin
Agropecuaria, 2006).


2
Datos obtenidos del camote cosechado en Noviembre del 2005.

14
La malanga es una planta netamente tropical y para su desarrollo ptimo requiere de
regmenes de lluvia altas, temperaturas promedio no inferiores a 20C, siendo la ptima entre
25-30C; el mejor desarrollo se alcanza con periodos de 11-12 horas luz (Mendoza, 1989;
citado por Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria, 2006). En cuanto al tipo
de suelo, las plantas se adaptan ms a aqullos profundos, frtiles, con suficiente materia
orgnica y bien drenada, el pH ptimo debe ser entre 5.5-6.5, aunque se adapta a espectros de
4.5 hasta 7.5 (Jimnez, 1988; citado por Comisin Veracruzana de Comercializacin
Agropecuaria, 2006). En el Cuadro 7 se expone de forma detalla la composicin qumica de la
malanga.

Cuadro 7. Composicin qumica de 100 gramos de malanga (base hmeda).
COMPOSICIN CRUDO
Humedad (g) 71
Protena (g) 1.7
Grasa (g) 0.8
Carbohidratos (g) 23.8
Fibra (g) 0.6
Cenizas (g) 1.2
Calcio (mg) 22.0
Fsforo (mg) 72.0
Hierro (mg) 0.9
Energa (kJ 100 g
-1
) 355
Fuente: Instituto Nacional de Nutricin de Venezuela, 1983 en Comisin Veracruzana de
Comercializacin Agropecuaria, 2006.

Estadstica mundial, nacional y estatal.
Los principales pases productores de malanga son Nigeria, Ghana y Costa de Marfil. Nigeria
es el mayor productor de este tubrculo ya que posee el 74% de la produccin. Sin embargo
dentro de los pases exportadores de malanga se encuentran Brasil, Jamaica y Ghana. Los
principales pases importadores de malanga son Estados Unidos, China y Mali, teniendo el 85,
9 y 6% del total mundial, respectivamente.
En Mxico, el nico estado productor en los ltimos aos ha sido Veracruz con una produccin
de 380 toneladas de malanga en el 2004 y una superficie cosechada de 36 hectreas, el precio
nacional para ese mismo ao fue de 5,500 pesos por tonelada. Para el 2006 se cosecharon 2.5
hectreas con una produccin de 100 toneladas (FAO, 2008a).


15

2.2.1.4. Almidn.
Como se mencion con anterioridad las principales fuentes de carbono para la produccin de
bioetanol a nivel mundial son los azcares obtenidos de la caa de azcar y el almidn
proveniente de los granos del maz. El almidn es la sustancia de reserva alimenticia
predominante en las plantas, ste se diferencia de todos los dems carbohidratos en que en la
naturaleza se presenta como complejas partculas discretas denominadas grnulos. Los
grnulos de almidn son relativamente densos e insolubles, se hidratan muy mal en agua fra.
La capacidad de formar soluciones viscosas es alcanzada slo cuando la suspensin de los
grnulos de almidn es sometida a la accin del calor. Otra propiedad nica del almidn es que
la mayora de los grnulos estn compuestos de una mezcla de dos polmeros: un polisacrido
esencialmente lineal denominado amilosa y otro muy ramificado llamado amilopectina. La
mayor parte de la amilosa es una cadena lineal de unidades de o-D-glucopiranosilo unidas por
enlaces (14), aunque tambin existen molculas que poseen unas pocas ramificaciones en
posicin (16), la mayora de los almidones contiene alrededor de 25% de amilosa (Figura 6).



Figura 6. Segmento trisacrido de una porcin no ramificada de una molcula de amilosa o
amilopectina. (Fuente: BeMiller y Whistler, 1996).


La amilopectina est presente en todos los almidones, constituyendo alrededor del 75% de los
almidones ms comunes, es una molcula muy grande y altamente ramificada. Las ramas
agrupadas en paralelo de la amilopectina se encuentran plegadas como dobles hlices y las
molculas de amilosa se dispones entre las de amilopectina (BeMiller y Whistler, 1996).


16

Figura 7. Representacin de una porcin de una molcula de amilopectina. (Fuente: BeMiller y
Whistler, 1996).


2.2.1.5. Hidrlisis del almidn.
La hidrlisis del almidn, tanto con cido como con enzimas, produce maltodextrinas. Las
molculas de almidn se despolimerizan por accin de la solucin cida caliente, la hidrlisis
de los enlaces glicosdicos se lleva a cabo al azar, para producir inicialmente fragmentos de
gran tamao. La modificacin ms intensa utilizando cidos da lugar a la formacin de
dextrinas. En la Universidad de Georgia, Atenas, se realiz un estudio para establecer las
condiciones ptimas de la hidrlisis cida del almidn de camote (Kim y Hamdy, 1985), los
investigadores utilizaron dos tipos de cultivos de camote y encontraron que la cantidad de
almidn en las races era de 21.1 0.6% y 27.5 1.6% (base hmeda) respectivamente.
Adems, observaron que: la velocidad de hidrlisis dependa de la concentracin del cido
(HCl), temperatura y tiempo; con elevadas concentraciones de cido y altas temperaturas haba
una rpida formacin de azcares reductores, pero stos se destruan de la misma forma. El
ms alto porcentaje de conversin de almidn en azcares reductores fue de 84.2% (base
hmeda). En la actualidad muchos pases europeos, Canad y Australia utilizan el almidn
proveniente de los desechos de algunas industrias para producir etanol, antes de utilizarlos
para la fermentacin el almidn es hidrolizado con cidos (Zaldivar et al., 2005).
De acuerdo al procedimiento (Magee y Kosaric, 1985) los efluentes se calientan a 98C y se
adiciona cido sulfrico al 2% (w/v) y se mantiene a la misma temperatura durante 2 horas.


17
Otro desecho agroindustrial que se est investigando para la produccin de etanol es el
bagacillo de caa de azcar; un estudio realizado para optimizar la produccin de azcares
reductores a partir de la hidrlisis cida de este desecho mostr que la mayor produccin de
azcares reductores (16.76 1.71 g/L) se obtuvo en la hidrlisis con cido sulfrico al 6% y 4
horas de reaccin, partiendo de una solucin de bagacillo de caa 3.33% (w/v) se obtuvo un
rendimiento del 50.3%, esto es por cada gramo de bagacillo de caa se obtienen 0.5 gramos
de azcares reductores; tambin se observ que en general la concentracin de azcares
reductores aument con la concentracin del cido, hasta llegar a una concentracin ptima
(Ferrer et al, 2002) . Estos resultados concuerdan con las observaciones establecidas por
diferentes investigadores, en las que un aumento de la concentracin del cido produjo un
incremento de la velocidad de hidrlisis y tambin de la degradacin de los azcares
producidos (Carrizales et al., 1986), (Ullal et al., 1984) y (Urbaneja et al., 1997).

Para la hidrlisis enzimtica industrial del almidn a D-glucosa se utilizan tres o cuatro enzimas
diferentes (BeMiller y Wisthler, 1996). En general estas enzimas hidrolizan cadenas de
oligosacridos y polisacridos, es por esto que dentro del grupo de las hidrolasas las amilasas
tienen una gran importancia a nivel industrial. Hay tres etapas en la conversin de almidn a
azcares reductores (Mera et al, 2003):

Gelatinizacin, implica la disolucin de los grnulos del almidn para formar una
suspensin viscosa.
Licuefaccin, implicando la hidrlisis parcial del almidn.
Sacarificacin, implicando la produccin de la glucosa y de la maltosa por
hidrlisis adicional.

La o- amilasa (EC 3. 2. 1. 1) hidroliza los enlaces glicosdicos o-1,4 en el interior de la molcula
de almidn para dar lugar a la formacin progresiva de pequeas cadenas formadas por varias
unidades de glucosa, entre estos polmeros estn incluidas las dextrinas (Gupta et al., 2003).

La reaccin es resumida de la siguiente manera (Kerr, 1950):

o -omiloso
AlmiJon - cxtrinos +Holtoso

(1)



18
La amiloglucosidasa (EC 3. 2. 1. 3) se utiliza comercialmente, en combinacin con la o-
amilasa, para producir jarabes de D-glucosa y D-glucosa cristalina. La amiloglucosidasa
reacciona sobre el almidn completamente gelatinizado como un exoenzima, liberando de
forma secuencial unidades sencillas D- glicosilo a partir de los extremos no reductores de la
molculas de amilosa y amilopectina, incluso aquellos que estn unidos por enlaces (16), en
consecuencia esta enzima puede hidrolizar el almidn por completo, para dar slo molculas
de D-glucosa, pero se usa en general el almidn que es previamente despolimerizado con o-
amilasa para generar ms extremos no reductores (BeMiller y Wisthler, 1996), la reaccin se
presenta en la ecuacin (2) (Bernfeld, 1950).

AmiloglucosiJoso
AlmiJon o Jcxtrinos - 0lucoso

(2)
Las otras dos enzimas restantes son la |-amilasa (EC 3. 2. 1. 2) y la isoamilasa (ciclodextrn
glucanotransferasa), la primera libera unidades disacrido maltosa, su reaccin se muestra en
la ecuacin (3) (Myrbck y Neumller, 1950). Las dextrinasas forman unidades de maltosa a
partir de las dextrinas (Meyer y Gibbons, 1951).

[ -omiloso
AlmiJon - Holtoso

(3)

En los ltimos aos se ha reportado el uso de almidn, proveniente de varios cultivos como el
maz, trigo, arroz, sorgo y papas; en la produccin de etanol a nivel industrial (Nigam y Singh,
1995). El mtodo convencional de la hidrlisis de almidn con cido ha sido sustituido por el
uso de enzimas en el proceso de licuefaccin y sacarificacin.
Por este motivo se han realizado muchas investigaciones relacionadas con la optimizacin en
la produccin de azcares a partir de almidn, hasta la fecha se han estudiado diversos
factores que afectan la hidrlisis del almidn con las enzimas o-amilasa y amiloglucosidasa.
Kunamneni y Singh (2005), realizaron la optimizacin de la hidrlisis enzimtica del almidn de
maz con el fin de obtener una alta produccin de glucosa; en este trabajo se estudi el efecto
de: la concentracin de o-amilasa durante de gelatinizacin y despus de la gelatinizacin, la
concentracin de amiloglucosidasa, la concentracin de slidos (almidn), el tiempo de
gelatinizacin, pH, adicin de metales (Mg
2+
y Ca
2+
) y la temperatura de sacarificacin.
Observaron que los factores que afectan principalmente al proceso de hidrlisis de almidn de

19
maz son la concentracin de o-amilasa, amiloglucosidasa y la temperatura de sacarificacin,
ya que tiene una relacin directa con la eficiencia de conversin. De acuerdo con ello,
encontraron que las concentraciones donde obtenan la mayor eficiencia de conversin (96.
25%) eran de: o-amilasa 2.243 U/mg slido en el proceso de gelatinizacin, o-amilasa 3.383
U/mg slido en el proceso de licuefaccin y de la enzima amiloglucosidasa 0.0763 U/mg slido
en el proceso de sacarificacin; adems de que la temperatura de sacarificacin deba ser de
55.1C. El tiempo es otro factor que influye en la eficiencia de conversin de almidn a
azcares reductores, en un estudio donde caracterizaron a la o-amilasa y a la amiloglucosidasa
encontraron que las condiciones ptimas de dichas enzimas fueron a un pH de 6.0 y 5.5,
temperaturas de 70C y 60C, concentracin de enzima de 0.1% y 0.25% y tiempo de reaccin
de 90 minutos y 4.5 h respectivamente; observaron que el tiempo de cintica empleado para la
glucoamilasa present rendimientos bajos, lo que indica que la hidrlisis se debe someter a un
tiempo ms prolongado (Mera et al, 2003).

2.2.2. Microorganismos utilizados en la produccin de Bioetanol.
Hasta hace algunos aos la forma tradicional de producir etanol era mediante la fermentacin
de azcares con Saccharomyces cerevisiae, levadura que mediante la ruta metablica de
Embden-Meyerof-Parnas (EMP) a travs de la cual una molcula de glucosa produce dos
molculas de piruvato (Madigan et al, 2000). Bajo condiciones anaerbicas, el piruvato es an
ms reducido a etanol con la liberacin de CO
2
. En teora, el rendimiento es de 0.511 para el
etanol (Bai et al., 2008). En las ltimas dcadas Zymomonas mobilis ha sido intensamente
estudiada, ya que de acuerdo a varios investigadores esta especie posee caractersticas
superiores a las de Saccharomyces cerevisiae.

2.2.2.1. Zymomonas mobilis.
Zymomonas mobilis es una bacteria Gram negativa, esto quiere decir que presenta dos
membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano. Es una
bacteria anaerobia tolerante al oxgeno. Este microorganismo fue descubierto originalmente en
el pulque mexicano y en el vino de palma africano (Swings y De Ley, 1977). En condiciones
anaerbicas produce etanol a partir de glucosa mediante la ruta metablica de Entner-
Doudoroff (ED), debido a esto Z. mobilis produce menos biomasa (comparada con otros
microorganismos que utilizan la ruta metablica de EMP) y ms carbono es canalizado para la
produccin de etanol, obteniendo rendimientos y productividades de etanol por arriba de 1.9
mol etanol/ mol glucosa (Torres y Baratti, 1988; Yanase et al, 2002), esto representa
aproximadamente el 97% de la eficiencia de conversin terica. Como consecuencia de una
menor produccin de ATP, Z. mobilis mantiene un mayor flujo metablico de la glucosa, lo que

20
garantiza una mayor productividad de etanol (Sprenger, 1996) y tolerancia a altas
concentraciones de azcares y etanol (Rogers et al., 1982). A diferencia de S. cerevisiae, Z.
mobilis slo utiliza sacarosa, glucosa y fructosa para producir etanol, an as slo utiliza como
va nica la de ED para metabolizar la glucosa, esto quiere decir que Z. mobilis tiene la
capacidad de producir enzimas que hidrolizan polisacridos para producir molculas de
glucosa y fructosa, la produccin de estas enzimas depende de los factores ambientales y
composicin del medio de cultivo al que se someta dicha bacteria (Doelle et al., 1993b). Se ha
reportado que la glucosa no muestra efectos de inhibicin en el crecimiento y metabolismo de
Z. mobilis, debido a que se establece un completo balance de la presin osmtica, ya que
dentro y fuera de la clula se establece un equilibrio de las concentraciones de glucosa (Doelle
y Doelle, 1989; en Doelle et al., 1993a). Sin embargo, en un estudio sobre el efecto de la
concentracin de glucosa en la produccin de etanol por Z. mobilis inmovilizada, se mostraron
resultados en los que por arriba de 140 g glucosa/ L la produccin de etanol disminua (Pramod
y Margaritis, 1985). Por otro lado, se observ la inhibicin en la produccin de etanol con la
cepa de Z. mobilis NRRL-806 usando una solucin de glucosa al 20% (w/v) (McGhee et al.,
1982). An as esta concentracin es muy alta y se puede considerar que la fermentacin de
azcares con Z. mobilis no est limitada por la concentracin de sustrato; ya que Z. mobilis
tiene la capacidad de facilitar el transporte de azcares en el proceso de difusin en la
membrana celular (DiMarco y Romano, 1985).

Para la produccin de etanol con Z. mobilis la fuente de carbono ms usada es la sacarosa
extrada de la caa de azcar, sin embargo durante aos se ha estudiado el rendimiento en la
produccin de etanol con diversas fuentes de carbono provenientes de otros agrocultivos.

En un estudio de la fermentacin del jugo de caa azucarera y de melazas (producto
secundario de la refinacin del azcar) con Z. mobilis, a nivel planta piloto y en un fermentador
de 1200 L, se lograron eficiencias de conversin de hasta 94% en menos de 24 h, observando
concentraciones de etanol del 10% al 11% (v/v) (Doelle et al, 1991). Park y Baratti (1991)
usaron cuatro sustratos diferentes, subproductos de la refinacin de azcar a partir de
remolacha, para la fermentacin con Z. mobilis y observaron que despus de hidrolizar la
sacarosa con la enzima invertasa las eficiencias de conversin eran de entre 88.8% y 91.4%.

El pH tambin es un factor del cual depende la produccin de etanol, un pH de 6.5 es ptimo
para el crecimiento de las clulas de Z. mobilis mientras que un pH de 4.0 es ptimo para la
produccin de etanol (Jones y Doelle, 1991).


21
Con respecto a los productos de inhibicin se podra decir que Z. mobilis produce dos, etanol y
dixido de carbono. Aunque la teora ms comn es la de inhibicin por etanol, se ha reportado
el crecimiento de colonias de Z. mobilis en placas con agar y etanol al 15% (v/v), en
fermentadores se ha observado que la perdida de la viabilidad empieza a partir de una
concentracin de etanol de 13% o del 16% (v/v) (Rogers et al, 1982) (Supanwong et al, 1983).
Se ha afirmado que para este microorganismo el efecto Pasteur est ausente (Belaich y Senez,
1965); razn por la cual se considera que el producto de inhibicin no es el etanol sino el
dixido de carbono (CO
2
). Z. mobilis cuenta con una membrana celular de composicin nica
(Timoshin et al., 1989), lo cual impide que el etanol se acumule dentro de la clula (DeFranca y
Leite, 1989). En una fermentacin la mayor cantidad de CO
2
producido se encuentra disuelto
en el caldo de cultivo, la solubilidad del CO
2
en el medio acuoso depende de la concentracin
de especies inicas y no polares, como el etanol. Aunque, tambin existen otros compuestos
que estn en equilibrio con el CO
2
, esto se explica con mayor precisin en la ecuacin (4).

C0
2
+E
2
0 - E
2
C0
3
- EC0
3
-
+ E
+


El CO
2
tiene la facilidad de reaccionar con los grupos amino de la protenas y el H
2
CO
3
de
asociarse con grupos de carga positiva en protenas, en consecuencia la cantidad total de CO
2

en la solucin acuosa puede aumentar significativamente causando la supersaturacin del
medio; el efecto del incremento de las concentraciones de HCO
3
y CO
2
; se ven reflejadas en la
inhibicin del uso del sustrato. Esto sucede porque el bicarbonato puede ser el responsable de
la desestabilizacin de la membrana celular y posiblemente tambin de la carga de los
fosfolpidos o lipopolisacridos de la misma (Jones y Greenfield, 1982).


Figura 8. Clulas resuspendidas de Z. mobilis CP4 (5600x). (Fuente: Electronic Journal of
Biotechnology, 2008).

(4)

22


Existen tambin diferencias notables en la cinticas de produccin de etanol entre diferentes
cepas de Z. mobilis; por ejemplo: Z. mobilis NRRL-806 en una fermentacin continua
(inmovilizada en alginato de calcio) obtiene la mxima produccin de etanol a los 4 das
(McGhee et al., 1982); mientras que Z. mobilis NBRC-13758 (Nacional Institute of Technology
and Evaluation, Biological Resource Center), en una fermentacin donde simultneamente se
lleva a cabo la sacarificacin de almidn, alcanza la mxima produccin de etanol a las 12
horas (Neves et al., 2007). En otro estudio se compar la produccin de etanol de cuatro cepas
de Z. mobilis (NRRL-14023, NRRL-14022, NRRL-4286 y NRRL-806), a partir de hidrolizados de
almidn de yuca; la cepa NRRL-4286 fue la que mostr la eficiencia de conversin ms alta (80
g etanol/ L a partir de 171 g azcar/ L) a las 36 horas, mientras que las otras cepas alcanzaron
sus mximos rendimientos de las 40 a las 48 horas (Nellaiah, 1988). Z. mobilis ATCC-31821
puede metabolizar 80g glucosa/ L en 9 horas, produciendo 39 g etanol/ L (Davis et al, 2006).

Cazetta et al. (2007) estudiaron el efecto de la temperatura, concentracin de azcares
reductores en melazas, agitacin y tiempo en la produccin de etanol con Z. mobilis ATCC-
29191; observaron que el tiempo, en el proceso de fermentacin es un factor importante, en
donde ms del 60% de la produccin de etanol aumenta entre las 24 y 48 horas. Se mantuvo
constante el pH del medio de cultivo de 5.6-6.0 y se observ que a este pH no existen efectos
negativos en la produccin de etanol. Aunque el pH es un factor con efectos notables en el
proceso de fermentacin, Z. mobilis cuenta con una alta tolerancia a variaciones de pH que van
desde 3.5 a 7.5, con un rango ptimo de pH de 5.0-7.0 (Falcao de Morales et al., 1981).
Cazetta et al. (2007) observaron que las mejores condiciones para la produccin de etanol fue
con una concentracin de 200 g azcares reductores/ L (melazas), temperatura de 30C, sin
agitacin y un tiempo de 48 h, obteniendo una produccin de 55.8 g etanol/ L.

Otro factor de suma importancia en la fermentacin de azcares con Z. mobilis es la
preparacin del pre-inculo e inculo, esto quiere decir que para obtener rendimientos altos de
etanol se debe utilizar un inculo adaptado a el medio de cultivo y a las condiciones de
temperatura, pH y agitacin a las que se llevar a cabo la fermentacin (Doelle y Doelle, 1991
en Doelle et al., 1993).






23
2.3. Factores tcnicos, econmicos y normativos de los biocombustibles.

Como se mencion anteriormente, una de las principales fuerzas que promueve el desarrollo
de biocombustibles es la seguridad energtica. La contribucin de cada biocombustible al
suministro de energa depende tanto del contenido energtico del combustible como de la
energa que se gasta al producirlo; es decir la energa que se requiere para trasportar, cultivar y
cosechar la materia prima, convertirla en biocombustible y trasladarlo en diferentes fases de su
produccin. Una forma de expresar la proporcin entre la energa contenida en el
biocombustible y la energa fsil empleada en su produccin es mediante balances de energa
fsil, por ejemplo, un balance de energa fsil de 1.0 significa que se necesita tanta energa
para producir un litro de biocombustible como energa tenga ste, esto quiere decir que el
biocombustible en cuestin no evidencia ni ganancias ni prdidas. Pero, si se tiene un balance
de energa de 2,0, significa que el biocombustible contiene el doble de energa que se necesita
para producirlo (FAO, 2008a).
La gasolina y el diesel convencionales tienen balances de energa entre 0.8 y 0.9, porque una
parte de la energa se consume en refinar el crudo para transformarlo en combustible til. Los
balances estimados de combustible fsil del biodiesel oscilan entre 1.0 y 4.0 para la colza y
soja, alrededor de 9.0 para el aceite de palma. En el caso del etanol elaborado a partir de
cultivos, los balances oscilan entre 2.0, en el caso de la caa de azcar es de 8.0 y para el
maz es de 2.0 (Instituto de Vigilancia Mundial, 2006). Una vez superadas las barreras tcnicas,
se debe estudiar qu porcentaje de la bioenerga disponible sera econmicamente viable, el
potencial econmico a largo plazo depende en gran parte de los costos de la energa fsil, el
desarrollo de las materias primas agrcolas y el perfeccionamiento de las tecnologas de
cosecha, conversin y uso de biocombustibles.
La principal discusin acerca de la economa de los biocombustibles lquidos parte de la
asignacin de recursos entre los sectores de la energa y la agricultura; ya que en muchos
lugares los costos para producir cultivos y convertirlos en etanol o biodiesel son muy altos
como para competir en el mercado contra combustibles fsiles sin ayuda del gobierno para
fomentar su desarrollo y subvencionar su uso. Por otra parte, muchos pases estn impulsando
la industria de los biocombustibles por varias razones, dentro de las ms importantes se
encuentran (FAO, 2008a):
Intereses estratgicos con respecto a la seguridad energtica y los precios de la
energa. Como el acceso seguro a los suministros de energa, reduccin de la
vulnerabilidad ante la alza de precios y a la interrupcin de los suministros de
energa, independencia de fuentes energticas importadas.
Cambio climtico. Adoptar a la bioenerga como un elemento importante para
reducir las emisiones de gases efecto invernadero, disminuir la contaminacin

24
de aire en zonas urbanas, utilizacin de residuos y desechos para generar
bioenerga.
Apoyo a la agricultura. Las ayudas al sector agrcola y a las rentas de los
agricultores han sido uno de los factores principales para impulsar las polticas
relativas a los biocombustibles.

Muchas de las polticas actuales que influyen en el desarrollo, negocio e inversin de los
biocombustibles, fueron creadas en base a la consideracin de los puntos anteriores.

En general, las polticas que actualmente apoyan el crecimiento de los biocombustibles son
(FAO, 2008a):

Polticas agrcolas. Estas polticas han tenido importantes consecuencias para
el comercio agrcola y en un futuro tendrn repercusiones en la produccin de
materias primas destinadas a los biocombustibles.
Combinacin de mandatos. Hace referencia a los requisitos de mezcla de
carcter voluntario y obligatorio, para los biocombustibles lquidos en los pases
del G8+5
3
.
Subsidios y ayudas. Constituyen las ayudas a la distribucin y fomento en el
uso de biocombustibles.
Aranceles. Los aranceles aplicados a los biocombustibles se usan
generalmente para proteger la agricultura y las industrias de biocombustibles
locales, sostener los precios locales de los biocombustibles y proporcionar un
incentivo para la produccin nacional.
Incentivos fiscales. Representan un medio para estimular la demanda de
biocombustibles
Investigacin y desarrollo. Gran parte de los pases productores de
biocombustibles realizan y financian proyectos de investigacin y desarrollo.

Las polticas expuestas anteriormente estn ordenando la economa agrcola mundial, porque
tienen importantes efectos en la produccin y las rentas agrcolas, los precios de los productos
bsicos, el empleo rural y los mercados energticos.



3
Los pases del G8+5 incluye a los pases del G8: Alemania, Canad, EUA, Francia, Italia, Japn, el Reino Unido y
la Federacin Rusa; ms Brasil, China, India, Mxico y Sudfrica (consideradas las cinco principales economas
emergentes).

25

2.4. Biocombustibles y medio ambiente.

Aunque la produccin y consumo de los biocombustibles siguen siendo reducidas en
comparacin de la demanda total de energa, deben estudiarse las posibles implicaciones
medioambientales y sociales de su acelerado crecimiento.
Los biocultivos pueden reducir o compensar las emisiones de gases de efecto invernadero a
travs de la eliminacin directa de dixido de carbono del aire a medida que crecen y lo
almacenan en la biomasa y el suelo. Con muchos de estos cultivos adems de producir
biocombustibles, se pueden generar productos complementarios como alimento para animales
y de esta forma se ahorra la energa para elaborarlos de otra forma (FAO, 2008b).
A pesar de estos beneficios, algunos estudios muestran que las compensaciones de gases de
efecto invernadero varan en gran medida de acuerdo con cada biocombustible en
comparacin con el petrleo; por ejemplo, mientras que la produccin de etanol con maz
puede generar un ahorro de gases de efecto invernadero de unas 1,8 toneladas de dixido de
carbono por hectrea al ao, el pasto varilla (posible cultivo de segunda generacin) puede
ahorrar unas 8,6 toneladas por hectrea al ao. Los balances anteriores, se obtuvieron
mediante un anlisis del ciclo vital, lo que se hace con instrumento analtico es comparar todas
las emisiones de gases de efecto invernadero en todas las fases de produccin y de uso de un
biocombustible y todos los gases de efecto invernadero emitidos en la produccin y uso de una
cantidad equivalente de energa del combustible fsil correspondiente (FAO, 2008a).

La mayor parte de los estudios realizados han puesto de manifiesto que la produccin de
biocombustibles de primera generacin a partir de materias primas actuales resulta en una
disminucin de las emisiones del orden del 20 % al 60 % en comparacin con los combustibles
fsiles, siempre que se empleen los sistemas ms eficientes. Si bien los biocombustibles de
segunda generacin siguen resultando ineficientes a nivel comercial, suelen ofrecer
reducciones del orden del 70 % al 90 % en comparacin con el diesel fsil y el petrleo.

Por otra parte se habla mucho sobre la repercusin de la industria de los biocombustibles sobre
la biodiversidad silvestre y agrcola. Sin embargo, existen cultivos para biocombustibles que
pueden tolerar condiciones ambientales en las que cultivos para la alimentacin no
sobreviviran; de esta forma se pueden emplear productivamente las tierras que en la
actualidad generan escasos beneficios econmicos. Algunos de estos cultivos son la yuca, el
ricino, el sorgo azucarado y la jatropha, al igual que los cultivos arbreos, como el eucalipto.


26
3. JUSTIFICACIN.

Uno de los ms importantes retos del hombre es satisfacer la demanda energtica a nivel
mundial. Por varias dcadas y hasta la fecha se sigue cubriendo gran parte de esta demanda
con combustibles de origen fsil; sin embargo, en los ltimos aos se ha alcanzado la mxima
produccin de petrleo, de este punto en adelante se ha observado que la produccin en los
pozos petroleros comienza a disminuir. Con la creacin y uso de diferentes tipos de bioenerga
se podran diversificar las fuentes de suministro de energa y de esta forma reducir la
dependencia de un pequeo nmero de exportadores, creando de esta forma una seguridad
energtica a nivel nacional. De las diversas formas de bioenerga, los biocombustibles lquidos
representan la principal fuente alternativa que a futuro podra abastecer al sector del transporte,
dependiente en su totalidad del petrleo. Adems, los biocombustibles podran sustituir a la
gasolina sin cambios ms radicales en las actuales tecnologas y polticas de transporte. Otro
factor importante que impulsa la investigacin sobre la produccin de biocombustibles es la
preocupacin acerca del cambio climtico, ya que se cree que ste es inducido por la accin
humana, especficamente por el uso (combustin) de combustibles fsiles como: gasolina,
diesel, gas L.P, etc. Por otra parte se impulsara la economa nacional debido al desarrollo del
sector agropecuario, ya que los biocombustibles lquidos, en especfico los de primera
generacin, se producen a partir de agrocultivos.

Debido a que en Mxico la demanda de energa an no excede la capacidad de produccin, los
biocombustibles podran ser una alternativa viable de energa ya que estos podran satisfacer
un porcentaje considerable de la demanda nacional de energticos. El uso de cultivos como la
yuca para la produccin de bioetanol podra ser una solucin sustentable, ya que este tipo de
tubrculos pueden ser cultivados bajo condiciones extremas de suelo, agua y temperatura;
pudindose aprovechar gran parte del territorio mexicano, que en su mayora son terrenos de
agostadero, marginales o semidesrticos.

La rentabilidad de los procesos de produccin de biocombustibles depende en gran parte del
costo de la materia prima, su pre-tratamiento y su conversin a producto final. Por este motivo,
la mayora de los estudios relacionados con la produccin de biocombustibles se centran en la
optimizacin del pre-tratamiento de la materia prima y la fermentacin de la fuente de carbono.
Un factor importante en la fermentacin es el microorganismo utilizado. Dos de los principales
microorganismos que se usan en la produccin de etanol son Saccharomyces cerevisiae y
Zymomonas mobilis. Debido a que Z. mobilis es una bacteria osmo y etanol tolerante su uso en
la industria de los biocombustibles (bioetanol) ha ido creciendo considerablemente.

27
4. OBJETIVOS.

4.1. General.

Evaluacin de la produccin de etanol con clulas libres de Zymomonas mobilis, usando como
principal fuente de carbono azcares, provenientes de la hidrlisis del almidn de la harina de
tubrculos.

4.2. Especficos.

Seleccin y evaluacin del contenido de almidn de la materia prima (Yuca, Camote y
Malanga) que servir como fuente de carbono para la formulacin del medio de cultivo.

Desarrollo y comparacin de los procesos de pre-tratamiento para la hidrlisis del almidn de
Yuca, Malanga o Camote.

Formulacin de un medio de cultivo simple y compuesto, utilizando como fuente de carbono el
almidn hidrolizado de la harina de Yuca, Malanga o Camote para la produccin de etanol con
clulas libres de Zymomonas mobilis.

Produccin de bioetanol en matraz con clulas libres de Zymomonas mobilis, usando tres
diferentes medios de cultivo.

Produccin de etanol en un biorreactor agitado de 2 L con clulas libres de Zymomonas
mobilis.




28
5. MATERIALES Y MTODOS.


5.1. Estrategia de trabajo.

El proyecto se realiz en diferentes fases (Figura 9), las cuales se describen a continuacin:

- Fase 1. Seleccin y pre-tratamiento de la materia prima.
- Fase 2. Seleccin y mantenimiento del microorganismo.
- Fase 3. Formulacin del medio de cultivo para la produccin de bioetanol.
- Fase 4. Produccin de bioetanol en matraz con Z. mobilis B-806.
- Fase 5. Produccin de bioetanol en biorreactor con Z. mobilis B-806.
- Fase 6. Anlisis estadstico.




Figura 9. Estrategia de trabajo.






Seleccin y pre-tratamiento de la
materia prima
Materia prima:
Camote
Malanga
Yuca
Pre- tratamiento:
Hidrlisis cida
Hidrlisis
enzimtica
DISEO EXPERIMENTAL FACTORIAL
Seleccin y mantenimiento del
microorganismo
Microorganismo:
Zymomonas
mobilis NRRL B-806
Medio de Cultivo
Medio YP (Yeast
Peptone)
Formulacin del medio de
cultivo
Formulacin del medio de cultivo
para la produccin de bioetanol
con Z. mobilis NRRL B-806.
MEDIO 1
MEDIO3
MEDIO 2
Produccin de etanol en
matraces
Fermentacin en matraz de
tres dif erentes medios de cultivo
con Z. mobilis B-806.
Seleccin del medio de cultivo
en base a la produccin de
bioetanol.
Produccin de etanol en
biorreactor
Fermentacin del medio de cultivo
seleccionado en un Biorreactor New
Brunswick Scientif ic Biof lo 110 de 2
L con Z. mobilis B-806.

29
5.2. Fase 1. Seleccin y pre-tratamiento de la materia prima.

Se desarroll una metodologa que facilit la biodisponibilidad del almidn contenido en el
sustrato, es por esto que dentro del pre-tratamiento se incluyen mtodos mecnicos, trmicos,
fisicoqumicos y enzimticos. Es importante mencionar que en la parte del pre-tratamiento se
plane estudiar los rendimientos obtenidos con diferentes: materias primas, tratamientos
fsicos, qumicos y biolgicos. Esto con la finalidad de obtener la mayor cantidad de azcares,
para su posterior fermentacin con Z. mobilis NRRL-806.

5.2.1. Seleccin y determinacin de la cantidad de almidn soluble en el
agua de la materia prima.
De acuerdo a la bibliografa consultada se seleccionaron tres diferentes tubrculos: yuca
(Manihot esculenta Crant), camote (Ipomea batata) y malanga (Colocasia esculenta Schott). Se
determin la cantidad de almidn soluble al agua contenido en la yuca, camote y malanga;
siguiendo la metodologa descrita en la Figura 10 (Liu, 1997 en Liu, 2003).


Figura 10 . Metologa de la extraccin de almidn en tubrculos.(Fuente: Liu, 1997 citado en Liu,
2003).
Se pesaron 100 g del
tubrculo fresco (yuca,
camote, y malanga).
Los tubrculos se lavaron,
pelaron y cortaron en cubos
de aproximadamente 2 cm.
Se determin el peso de la
cscara de cada tubrculo
(base hmeda).
Los cubos de cada tubrculo se
sumergieron en bisulfito de sodio
20 mM, cido ctrico 10 mM y
agua destilada, durante 2 h.
Los cubos de cada tubrculo se
molieron en un homogenizador,
durante 2 minutos.
La pulpa obtenida se filtr con
una gaza, el filtrado obtenido se
re suspendi en 1 volumen de
agua destilada.
La solucin obtenida se dej
sedimentar durante 30 minutos.
Posteriormente se decant el
sobrenadante y se recupero el
sedimento (almidn).
El al midn (sedimento) se lavo 3
veces con 1 volumen de agua
destilada.
El al midn recuperado de cada
tubrculo, se sec en un horno a
40C durante 24 h. Final mente el
almidn seco se pes.
Se determin el rendimiento
de almidn soluble al agua,
de cada tubrculo, por
diferenciade pesos.

30
5.2.2. Preparacin de la harina de yuca y malanga.
Se prepar harina de yuca y malanga para su uso en los tratamientos de hidrlisis. Los
tubrculos se lavaron, pelaron y cortaron en cubos de aproximadamente 2 cm. Se secaron en
un horno a 40C durante 24 horas. Despus los cubos de tubrculos se pulverizaron en un
homogenizador y se tamizaron a un dimetro de 100 m. Finalmente se embas en un
recipiente de plstico y se guard en congelacin a -37C hasta su uso.

5.2.3. Hidrlisis cida de la harina de Yuca y Malanga.
Se realiz un diseo experimental factorial 2
3
con el fin de encontrar las condiciones en las que
se obtenga un mayor rendimiento en la hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga. Dentro
del diseo experimental se estudiaron tres factores a dos niveles: temperatura (60C y 95C),
concentracin de cido sulfrico (1 % y 5 %) y tiempo (1 h y 5 h). Los ensayos de la hidrlisis
cida de la harina de yuca y malanga se realizaron como se muestra en la Figura 11.



Figura 11. Hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga.



Se adicionaron 50 mL de la solucin
del cido sulfrico a evaluar en un
matraz Erlenmeyer de 200 mL, se
incubo con la temperatura a estudiar
durante 15 minutos.
Al matraz anterior se adicionaron 1.66 g
de la harina de yuca o malanga.
Inmediatamente se tom una alcuota
de 5 mL y se enfri sbitamente en un
bao Mara invertido. Esta muestra se
utiliz como blanco o tiempo 0.
La hidrlisis cida se desarrollo durante
el tiempo a evaluar y por triplicado. Una
vez transcurrido el tiempo deseado se
tom una alcuota de 5 mL se enfri
sbitamente en un bao Mara
invertido.
Las muestras obtenidas se filtraron con
papel filtro y se les ajust el pH de 4 a 6.
Se determinaron los azcares reductores
por el mtodo del cido 3, 5
Dinitrosaliclico (DNS) descrito en el
punto 5.2.3.1.

31
Para la realizacin del diseo experimental se utiliz el programa Minitab 15 Statistical
Software, la serie de ensayos que se realizaron para poder determinar las condiciones en las
cuales la hidrlisis cida tuvo mejores rendimientos de azcares reductores, se muestran en el
Cuadro 8.

Cuadro 8. Diseo Experimental Factorial 2
3
para la hidrlisis cida de la harina de yuca y
malanga.
EXPERIMENTO (POR
TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
[CIDO SULFRICO]
(%)
TIEMPO (h)
1 60 1.0 1
2 95 1.0 1
3 60 5.0 1
4 95 5.0 1
5 60 1.0 5
6 95 1.0 5
7 60 5.0 5
8 95 5.0 5


5.2.3.1. Cuantificacin de azcares reductores.
Se determin la concentracin de azcares reductores por el mtodo del cido 3, 5
Dinitrosaliclico (DNS) (Durn y Muoz , 2003).

Preparacin del cido 3,5-dinitrosalcilico.
Se disolvieron 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada, despus se agregaron
1.6 g de NaOH (previamente disuelto en agua destilada) y 1.0 g de DNS (disuelto en agua
destilada), esta solucin se afor a 100 mL con agua destilada, se protegi de los rayos de luz
almacenndolo en un frasco color mbar, antes de usar dejar reposar por 15 minutos,
finalmente determinar su absorbancia a 540 nm contra un blanco.

Determinacin de la concentracin de azcares reductores.
Se colocaron 0.5 mL del reactivo de DNS y 0.5 mL de muestra en un tubo de ensaye de 10mL,
despus se homogeniz la solucin en el vrtex y se calent en un bao de agua a ebullicin
(100C) durante 5 minutos.


32
Inmediatamente de que se cumpla el tiempo indicado, se coloc la solucin en un bao de
agua fra durante 10 minutos, posteriormente se aadieron 5 mL de agua destilada y se volvi
a homogenizar con el vrtex. Se determin la absorbancia en el espectrofotmetro a una
longitud de onda de 540 nm contra un blanco (el blanco contena 0.5 mL de agua destilada en
vez de la muestra y se trat de la misma forma que la mezcla de reaccin).

Curva patrn de glucosa.
Se prepararon 25 mL de una solucin de glucosa 0.2% (2 g/L), posteriormente se realizaron las
diluciones de acuerdo al Cuadro 9 (por duplicado) y tratarlas segn la tcnica de determinacin
de azcares reductores con el reactivo DNS.

Cuadro 9. Diluciones para la curva patrn de maltosa.
MUESTRA (POR
DUPLICADO)
|GLUOCOSA EN LA MUESTRA|
(g/L)
VOLUMEN DE LA
SOLUCIN DE
GLUCOSA DE 2 g/L
(mL)
VOLUMEN DE AGUA
DESTILADA (mL)
1 (blanco) 0.0 0.00 1.00
2 0.20 0.10 0.90
3 0.40 0.20 0.80
4 0.60 0.30 0.70
5 0.80 0.40 0.60
6 1.00 0.50 0.50
7 1.20 0.60 0.40
8 1.40 0.70 0.30
9 1.60 0.80 0.20
10 1.80 0.90 0.10
11 2.00 1.00 0.00


Se elabor la curva patrn en donde se grafic en el eje de las abscisas (eje x) el promedio
de la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de las ordenadas (eje y) el promedio de
la concentracin de glucosa determinada en g/L. Se determin la ecuacin de la lnea recta que
relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b
(5)


33

En donde y representa la absorbancia que se determin a 540 nm, x representa la
concentracin de glucosa que se determin en g/L, m representa la pendiente de la lnea
recta y b es la interseccin al origen.

De esta manera se pudo determinar la ecuacin 6:

Concentracin de glucosa (g/L) = pendiente (absorbancia a 540 nm) + b
(6)


Figura 12 .Curva patrn realizada para determinar la cantidad de azcares reductores con el
mtodo del DNS. La ecuacin de regresin de la curva es: y=0.5272x + 0. y su R
2
=0.99.


5.2.4. Hidrlisis enzimtica de la harina de Yuca y Malanga.
Para poder determinar las condiciones de la hidrlisis enzimtica, en las que se obtengan altas
concentraciones de azcares reductores, se realiz un diseo factorial central 2
3
en el
programa Minitab 15 Statistical Software; se consider que los principales factores eran la
temperatura, el tiempo y el pH. A diferencia de la mayora de los ensayos relacionados con la
hidrlisis enzimtica de almidn, en donde se realizan las reacciones de licuefaccin y
sacarificacin por separado; en este proyecto se realiz la reaccin de hidrlisis efectuando
ambas reacciones al mismo tiempo.
Por este motivo en el diseo factorial se usaron dos niveles para cada factor, correspondientes
a las condiciones de reaccin especificadas para cada enzima utilizada. Las series de ensayos
que se realizaron para poder determinar las condiciones en las cuales la hidrlisis enzimtica
tuvo los rendimientos ms altos de azcares reductores, se muestran en el Cuadro 10.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00
A
b
s

(
5
4
0
n
m
)
[Gl ucosa] (g/L)

34
5.2.4.1. Preparacin de la solucin de harina de yuca y malanga.
Debido a que se realizaron ensayos con soluciones de diferente pH, primero se prepar el
regulador de pH (solucin reguladora de citratos 20 mM). Se prepar una solucin 0.1 M de
cido ctrico y una solucin 0.1 M de citrato de sodio dihidratado; ambas soluciones se
diluyeron cinco veces, obteniendo finalmente las dos soluciones a una concentracin 20 mM.
Despus en un vaso de precipitados se mezclaron ambas soluciones hasta obtener el pH
deseado (4.08, 4.8, 5.85, 6.9 y 7.6) para cada ensayo. Con el regulador de citratos se
prepararon las soluciones al 1 % de harina de yuca y malanga.

Cuadro 10. Diseo Experimental Central 2
3
de la hidrlisis de la harina de yuca y malanga.
EXPERIMENTO
(POR TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
pH TIEMPO (h)
1 6.36 5.85 3.00
2 20.00 4.80 1.00
3 20.00 4.80 5.00
4 20.00 6.90 1.00
5 20.00 6.90 5.00
6 40.00 4.08 3.00
7 40.00 5.85 0.50
8 40.00 5.85 3.00
9 40.00 5.85 6.36
10 40.00 7.61 3.00
11 60.00 4.80 1.00
12 60.00 4.80 5.00
13 60.00 6.90 1.00
14 60.00 6.90 5.00
15 73.63 5.85 3.00

La reaccin de hidrlisis se realiz de acuerdo a las condiciones descritas en el Cuadro 10 y
siguiendo la metodologa detallada en la Figura 13.

5.2.4.1. Preparacin de las soluciones enzimticas.
En la reaccin de hidrlisis se utilizaron dos enzimas:
- La -Amilasa realiz la licuefaccin del almidn de la harina de yuca y malanga. De
acuerdo a la informacin proporcionada por el fabricante (SIGMA-ALDRICH) sta se
aisl a partir de Aspergillus oryzae y vena en una presentacin de 47 U/mg slido.

35
La actividad enzimtica reportada por el fabricante fue: una unidad de -Amilasa libera
1.0 mg de maltosa a partir de almidn en 3 minutos, pH 6.9 a 20C.
- La Amiloglucosidasa realiz la sacarificacin de las molculas liberadas por la reaccin
de licuefaccin. De acuerdo a la informacin proporcionada por el fabricante (SIGMA-
ALDRICH) sta se aisl a partir de Aspergillus niger y vena en una presentacin 300
U/mL de solucin. La actividad enzimtica reportada por el fabricante fue: una unidad de
Amiloglucosidasa libera 1mol de glucosa por minuto con un pH 4.8 y 60C.

De acuerdo a Kunamneni et al. (2005), se prepararon soluciones de ambas enzimas por
separado en regulador de citratos 20 mM. En el caso de la -Amilasa (Solucin 1), se prepar
una solucin con regulador de citratos 20 mM a un pH de 6.9 y con una concentracin de 3
U/mg de harina. La solucin de Amiloglucosidasa (Solucin 2) se prepar con regulador de
citratos 20 mM con pH de 4.8 y una concentracin de 0.02 U/mg de harina.



Figura 13. Metodologa utilizada para llevar a cabo la hidrlisis enzimtica de la harina de
yuca y malanga.
En un tubo eppendorf de 1.5 mL se
adicion 1 mL de la solucin de harina
de yuca o malanga al 1% (w/v)
preparada en punto 5.2.4.1.
La solucin de harina se incub en un
termoximer a la temperatura evaluada
durante 15 minutos y 300 rpm.
Enseguida se adicionaron las soluciones
1 y 2 (enzi mas) al mismo tiempo,
preparadas en el punto 5.2.4.2.
Esta solucin se suplemento con CaCl
2

2H
2
O (1 mM) y MgCl
2
2H
2
O (1 mM)
(Kunamneni et al., 2005).
Inmediatamente tomar una alcuota de
0.5 mL y enfriarla sbitamente en un
bao Mara invertido. Esta muestra ser
el tiempo 0 o blanco.
Se determin la cantidad de azcares
reductores de cada muestra mediante
el mtodo de DNS descrito en los puntos
anteriores.
Se desarroll la reaccin de hidrlisis de
acuerdo a los tiempos a evaluar. Una
vez que se cumpli el tiempo de
reaccin, est se detuvo enfriando
sbitamente en un bao Mara
invertido.
Se tomaron 0.5 mL de la solucin
anterior y se diluy, con regulador de
citratos (preparados anteriormente) , lo
necesario para poder determinar la
cantidad de azcares.

36

Figura 14. Ensayos realizados para el Diseo Experimental de la hidrlisis enzimtica de la
harina de yuca y malanga. Imagnes: Tubo eppendorf (Clker.com by Brain Waves), Termomixer Comfort
(http://www.eppendorf.com).

5.2.5. Cintica de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca.
Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el diseo experimenta, se monitore la
hidrlisis enzimtica de la harina de yuca. Se puso en un clula de Lewis (50 mL de capacidad)
30 mL una de la solucin de harina de yuca al 1 % (w/v) en regulador de citratos 20 mM , pH
4.08 y se incub a 73.4 C durante 15 minutos (se agit vigorosamente con una barra
magntica mediante de una placa de agitacin) el sistema que se mont se observa en la
Figura 15. Se agregaron 3 U de la enzima o-Amilasa por cada mg de harina de yuca y 0.025 U
de la enzima Amiloglucosidasa por mg de harina de malanga. Se tom inmediatamente 0.5 mL
de la mezcla de reaccin y se adicion a un tubo conteniendo 0.5 mL del reactivo DNS (ste
fue el blanco para la determinacin de la absorbancia).
La reaccin se desarrollo hasta que se completaran 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24
horas, en cada uno de estos tiempos se tomaron 0.5 mL y se fueron adicionando a tubos que
contenan 0.5 mL del reactivo DNS. Se trataron todos los tubos al mismo tiempo segn la
tcnica del DNS. La reaccin se realiz por triplicado.


Figura 15. Sistema montado para la realizacin de la cintica enzimtica de la harina de
yuca.
Solucindeharina 1%(w/v) +
o Amilasa (3U/mg deharina)+
Amiloglucosidasa(0.02U/mg deharina)
Reaccinpor
triplicado

37
5.2.6. Anlisis y cuantificacin de los azcares reductores obtenidos de la
hidrlisis cida y enzimtica de la harina de yuca y malanga usando la
tcnica de HPLC (High performance liquid chromatograpy).
Como se mencion anteriormente, hasta ahora se sabe que Zymomonas mobilis es una
bacteria que consume azcares como la glucosa, sacarosa y fructosa; debido al origen de la
fuente de carbono utilizada para este proyecto, es de suma importancia realizar un anlisis de
las cantidades y los tipos de azcares generados en los ensayos descritos en los puntos 5.2.3.
y 5.2.4. Para la realizacin de este anlisis se utiliz como mtodo de separacin la
cromatografa de lquidos de alta resolucin o HPLC (por sus siglas en ingls). Slo se
seleccionaron los hidrolizados con las concentraciones ms altas de azcares reductores
obtenidos de los ensayos realizados en los puntos 5.2.3 y 5.2.4 de esta metodologa.

5.2.6.1. Preparacin de la fase mvil.
A travs de un sistema de filtracin Millipore como el que se muestra en la Figura 16 y una
membrana Millipore de 0.22 m de dimetro de poro se filtr H
2
O grado HPLC. El agua se dej
al vaco durante 30 minutos, posteriormente el lquido se verti con mucho cuidado en un
recipiente limpio y se sonic durante 40 minutos para eliminar las burbujas contenidas en el
lquido.

Figura 16. Sistema de filtracin Millipore. Fuente: Millipore
TM
.

5.2.6.2. Preparacin de las muestras (hidrolizados de harina de yuca y
malanga).
En un tupo eppendorf (1.5 mL capacidad) se agregaron 50 L de la muestra a valorar,
previamente diluida con la fase mvil (H
2
O grado HPLC); posteriormente esta solucin se filtr
a travs con una membrana de 0.22m dimetro de poro. La solucin filtrada se verti en un
vial estril de 2 mL de capacidad. El vial se guard en refrigeracin (4C) hasta su tratamiento.


38
5.2.6.3. Calibracin de la columna (SUPELCOGEL
TM
Ca) para la
determinacin de carbohidratos.
Antes de instalar la columna en el equipo de HPLC, se purgaron la lneas de las bombas del
cromatgrafo con la fase mvil (H
2
O grado HPLC), flujo de 0.1 mL/min. Despus se instal la
columna (SUPELCOGEL
TM
Ca) en el horno conectado al cromatgrafo de acuerdo a las
indicaciones proporcionadas por el distribuidor. Una vez instalada la columna se equilibr
durante 12 horas (hasta que se mantuvo estable la lectura IR) con la fase mvil (H
2
O grado
HPLC) con un flujo de 0.2 mL/min a temperatura ambiente (25C). A continuacin el flujo se
increment hasta alcanzar un caudal de 0.8 mL/min en 30 min y se dej estabilizar el equipo
con estas condiciones.

5.2.6.4. Determinacin de carbohidratos mediante cromatografa de
lquidos de alta definicin (HPLC).
Una vez preparadas las muestras de acuerdo al punto 5.2.6.2 y calibrada la columna de
acuerdo al punto 5.2.6.3 de esta metodologa, se determin la cantidad y tipo de carbohidratos
contenidos en la muestra. Se automatiz el proceso utilizando el software 32 Karat versin
7.0, los viales con las muestras a analizar se colocaron en un automuestreador en el equipo de
HPLC, las condiciones que se utilizaron para llevar a cabo la cormatografa de lquidos fueron:
Flujo de 0.8 mL/min, temperatura de 40 C y finalmente un tiempo de 15 minutos.

Curva patrn de glucosa.
Se prepararon 25 mL de una solucin de glucosa 0.3% (3 g/L), posteriormente se realizaron las
diluciones de acuerdo al Cuadro 11 (por duplicado), posteriormente las muestras se prepararon
y trataron de acuerdo a los puntos 5.2.6.2 y 5.2.6.4 descritos en esta metodologa.

Se elabor la curva patrn en donde se grafic en el eje de las abscisas (eje x) el promedio
de la concentracin de glucosa determinada en g/L y en el eje de las ordenadas (eje y) el
promedio del rea del pico obtenido en los cromatogramas. Se determin la ecuacin de la
lnea recta que relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b

(7)

En donde y representa el rea bajo la curva (del pico obtenido del cromatograma), x
representa la concentracin de glucosa que se determin en g/L, m representa la pendiente
de la lnea recta y b es la interseccin al origen.


39
De esta manera se pudo determinar la siguiente ecuacin:

Concentracin de glucosa (g/L) = pendiente (rea del pico obtenido) + b

(8)

Cuadro 11. Diluciones para la curva patrn de glucosa para la calcular la concentracin de
este azcar en los hidrlizados .
MUESTRA (POR
DUPLICADO)
|GLUCOSA EN LA MUESTRA|
(g/L)
VOLUMEN DE LA
SOLUCIN DE
GLUCOSA DE 3 g/L
(mL)
VOLUMEN DE AGUA
DESTILADA (mL)
1 (blanco) 0.00 0.00 1.00
2 0.30 0.10 0.90
3 0.60 0.20 0.80
4 0.90 0.30 0.70
5 1.20 0.40 0.60
6 1.50 0.50 0.50
7 1.80 0.60 0.40
8 2.10 0.70 0.30
9 2.40 0.80 0.20
10 2.70 0.90 0.10
11 3.00 1.00 0.00


Curva patrn de maltosa.
Se prepararon 25 mL de una solucin de maltosa 0.3% (3 g/L), posteriormente se realizaron las
diluciones de acuerdo al Cuadro 12 (por duplicado), posteriormente las muestras se prepararon
y trataron de acuerdo a los puntos 5.2.6.2. y 5.2.6.4 descritos en esta metodologa.

Se elabor la curva patrn en donde se grafic en el eje de las abscisas (eje x) el promedio
de la concentracin de glucosa determinada en g/L y en el eje de las ordenadas (eje y) el
promedio del rea del pico obtenido en los cromatogramas. Se determin la ecuacin de la
lnea recta que relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b

(9)


40
Cuadro 12. Diluciones para la curva patrn de maltosa.
MUESTRA (POR
DUPLICADO)
|MALTOSA EN LA MUESTRA|
(g/L)
VOLUMEN DE LA
SOLUCIN DE
MALTOSA DE 3 g/L
(mL)
VOLUMEN DE AGUA
DESTILADA (mL)
1 (blanco) 0.00 0.00 1.00
2 0.30 0.10 0.90
3 0.60 0.20 0.80
4 0.90 0.30 0.70
5 1.20 0.40 0.60
6 1.50 0.50 0.50
7 1.80 0.60 0.40
8 2.10 0.70 0.30
9 2.40 0.80 0.20
10 2.70 0.90 0.10
11 3.00 1.00 0.00


En donde y representa el rea bajo la curva (del pico obtenido del cromatograma), x
representa la concentracin de glucosa que se determin en g/L, m representa la pendiente
de la lnea recta y b es la interseccin al origen.

De esta manera se pudo determinar la siguiente ecuacin:

Concentracin de glucosa (g/L) = pendiente (rea del pico obtenido) + b

(10)

Las curvas patrn obtenidas a partir de loa Cuadros 11 y 12 se muestran en las Figuras 17, 18
y 19.










41




Figura 17.Curva tipo de la Glucosa, pico I.La ecuacin de regresin es: y=189959x-22371,
R
2
=0.995.



Figura 18. Curva tipo de la Glucosa, pico II.La ecuacin de regresin es: y=112232x-14019,
R
2
=0.994.



-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

r
e
a

d
e

P
i
c
o
[ Glucosa] (g/L)
-50000
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

r
e
a

d
e

P
i
c
o
[ Gl ucosa] (g/L)

42

Figura 19. Curva tipo de la Maltosa. La ecuacin de regresin es: y=193787x-2631.3,
R
2
=0.990.

5.3. Fase 2. Seleccin y mantenimiento del microorganismo.

Los criterios de seleccin del microorganismo se basaron en las caractersticas del
microorganismo, considerando a los tiempos y rendimientos de produccin principales factores
de eleccin. Debido al alcance del proyecto la eleccin del microorganismo se hizo
comparando los datos proporcionados por el Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos (Agricultural Research Service Culture Collection, NRRL) de cada microorganismo.
Dentro de la informacin proporcionada de compararon los rendimientos de produccin de
etanol y la materia prima a partir de la cual se realiz la fermentacin de azcares.

5.3.1. Seleccin y mantenimiento de la cepa de Zymomonas mobilis NRRL
B-806.
De acuerdo a la informacin proporcionada por el Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos se seleccion a la cepa de Zymomonas mobilis NRRL B-806 proveniente de la misma
coleccin. La cepa de Zymomonas mobilis NRRL B-806 se activ inoculando el pellet liofilizado
bajo condiciones de esterilidad en 50 mL del medio YP (Yeast Peptone) mostrado en el Cuadro
13. El matraz semilla se incub a 28C y 100 rpm, se monitore el crecimiento de la cepa.
Despus de 48 h se observ crecimiento, se realiz una tincin de Gram para verificar la
pureza del cultivo.
-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

r
e
a

d
e

P
i
c
o
[Mal tosa] (g/L)

43
Cuadro 13. Medio YP (Yeast-Peptone)
4
.
REACTIVO CANTIDAD
Peptona de Casena 10.00 g
Extracto de levadura 3.00 g
NaCl 3.00 g
NaHPO4 2.00 g
Agar
5
20.00
Agua destilada 1.00 L

Con el caldo de cultivo obtenido se inocularon placas y tubos de ensaye (preparados con
medio YP semislido) mediante la tcnica de estra cruzada y se incubaron a 28 C durante 48
horas. Las placas y tubos se almacenaron a 4 C. Mensualmente se realizaron resiembras
siguiendo la misma metodologa.

Con la finalidad de almacenar la cepa de Zymomonas mobilis B-806 durante ms tiempo (6
meses a un ao) se tom una de las colonias que crecieron en las placas con medio YP y se
inocularon 25 mL de medio YP lquido, se incub a 28 C durante 48 horas con agitacin de
100 rpm, se puso una alcuota del caldo de cultivo de 1 mL en un vial de 1.5 mL conteniendo
200 L de glicerol estril y se almacen a una temperatura de -37 C.


5.4. Fase 3. Formulacin de los medios de cultivo.

Se realiz la formulacin del medio de cultivo usando como principal fuente de carbono los
azcares reductores obtenidos de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca.

Los hidrolizados obtenidos se analizaron como se describe en el punto 5.2.6 y se determin su
concentracin de azcares. stos se diluyeron en agua destilada hasta obtener
aproximadamente 20 g/L de azcares reductores en la solucin y finalmente se filtraron tres
veces con una gasa de algodn. De la solucin obtenida se formularon tres diferentes medios
de cultivo mostrados en los Cuadros 14, 15 y 16.


4
Una vez mezclados todos los reactivos se ajust el pH a 7.2. El medio de cultivo se esteriliz a 1.5 Kg/cm
2
, 121 C
durante un tiempo de 15 minutos.
5
El agar slo se adicion al medio utilizado para la siembra en placa y tubo de Z. mobilis B-806 para su
mantenimiento.

44
Cuadro 14. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M1)
6
.
REACTIVO CANTIDAD
Azcares reductores 20.00 g
Agua destilada 1.00 L

Los medios de cultivo descritos en los Cuadros 15 y 16 se formularon en base al medio RM
(Atlas, R., 2004). En el caso del medio de cultivo M2 slo se cambio la glucosa por los
azcares reductores producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca; por otra parte,
al medio de cultivo M3 adems de cambiar la glucosa por los azcares reductores, procedentes
de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, se le adicion peptona de casena.

Cuadro 15. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M2)
7
.
REACTIVO CANTIDAD
Azcares reductores 20.00 g
Extracto de Levadura 10.00 g
KH
2
PO
4
2.00 g
Agua destilada 1.00 L
*Nota: Los azcares utilizados son los producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, por lo que de la solucin
obtenida al final de la reaccin se tom el volumen al cual correspondan a 20 g de azcares y se llevaron a un litro de agua
destilada.

Cuadro 16. Medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis (M3)
8
.
REACTIVO CANTIDAD
Azcares reductores 20.00 g
Extracto de Levadura 10.00 g
Peptona de casena 10.00 g
KH
2
PO
4
2.00 g
Agua destilada 1.00 L
*Nota: Los azcares utilizados son los producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, por lo que de la solucin
obtenida al final de la reaccin se tom el volumen al cual correspondan a 20 g de azcares y se llevaron a un litro de agua
destilada.


6
Los azcares reductores utilizados fueron los producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, se ajust
el pH a 6.80.2.
7
Los azcares reductores utilizados fueron los producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, se ajust
el pH a 6.80.2.
8
Los azcares reductores utilizados fueron los producidos en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, se ajust
el pH a 6.80.2.

45
Los medios de cultivo M1, M2 y M3 se esterilizaron a 1.5 Kg/cm
2
, 121 C durante un tiempo de
15 minutos.


5.5. Fase 4. Fermentacin en matraz de los medios de cultivo M1, M2 y M3 con
Zymomonas mobilis.

Con la finalidad de evaluar los rendimientos en la produccin de etanol a partir de los azcares
reductores (derivados de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca) se evalu la
fermentacin de los mismos con la cepa Zymomonas mobilis B-806. Por tal motivo, se estudi
la cintica de crecimiento, consumo de sustrato y produccin de bioetanol con tres diferentes
medios de cultivo (M1, M2 y M3).

5.5.1. Estimacin de la concentracin de azcares reductores por el
mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) para la elaboracin de la
curva patrn de glucosa.
Se estim el consumo de los azcares reductores por medio del mtodo del cido 3,5-
dinitrosaliclico de acuerdo a lo establecido en el punto 5.2.3.1 de la presente metodologa.

5.5.2. Estimacin de la concentracin de biomasa por peso seco.
Para la biomasa libre en el caldo de fermentacin se pusieron 10 mL de muestra (caldo de
cultivo) en un tubo Falcon de 50 mL de volumen y se centrifug a 5000 rpm durante 20
minutos. Se decant el sobrenadante, despus se mezcl la biomasa precipitada en el tubo
Falcon con 1 mL de agua salina (solucin estril de cloruro de sodio al 0.9%) y se homogeniz
utilizando el vrtex. Posteriormente se verti la suspensin celular en una charola de aluminio
de peso conocido y se meti la charola conteniendo la suspensin celular dentro del horno a 70
C y durante 24 horas o hasta peso constante. Se determin el peso de la biomasa seca por
diferencia de pesos. El peso de la muestra seca y de la charola, menos el peso de la charola
sola, resulta en el peso seco de la biomasa contenida en los 10 mL de muestra.

5.5.3. Determinacin de la cantidad de etanol mediante la oxidacin del
etanol con la enzima Alcohol Oxidasa.
Se determin la cantidad de etanol producido por Zymomonas mobilis B-806 en las muestras
de las cinticas realizadas con cada uno de los medios de cultivo formulados (M1, M2 y M3)
usando un mtodo enzimtico (Ethanol assay kit, Biovision). El kit de diagnstico se
conformaba de cinco elementos, descritos a continuacin:

46
Regulador de pH (Ethanol Assay Buffer, 25 mL)
Compuesto de reaccin (Ethanol Probe, liophilized, 1 vial)
Dimetilsulfoxido (DMSO) (Dimethylsulfoxide, 0.4 mL)
Enzimas (Ethanol Enzyme Mix, liophilized, 1 vial)
Etanol estndar (Ethanol Standard, 0.5 mL)

5.5.3.1. Preparacin de reactivos.
Se prepar el compuesto colorimtrico disolviendo el contenido del vial denominado Ethanol
Probe con 220 L de DMSO, esta solucin se preserv a -20 C y se us en un periodo no
mayor a dos meses. Tambin se prepar la solucin enzimtica, adicionando 220 L del
regulador de pH al vial denominado Ethanol Enzyme Mix, el cual contena a las enzimas, se
guard a -20 C y se us en un periodo que no excedi dos meses.
La mezcla de reaccin se prepar en el momento en que se realizaron los ensayos para
determinar la concentracin de etanol; por cada muestra de etanol se prepararon 50 L de la
mezcla de reaccin, la cual estaba compuesta por: Regulador de pH (46 L), compuesto
colorimtrico (2 L) y solucin enzimtica (2 L). Se prepar la cantidad de mezcla de reaccin
de acuerdo al nmero de ensayos realizados.

5.5.3.2. Determinacin de la concentracin de etanol.
En un tubo eppendorf (1.5 mL capacidad) se agregaron 50 L de la muestra a valorar,
previamente diluida en regulador de pH; posteriormente se adicionaron 50 L de la mezcla de
reaccin. La reaccin se incub durante 60 minutos a temperatura ambiente y se protegi de la
luz. Se determin la absorbancia en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 570 nm
contra un blanco (el blanco contena 50 L del regulador de pH en vez de la muestra y se trat
de la misma forma que la muestras). Est metodologa se realiz de acuerdo a las
especificaciones proporcionadas por el fabricante (Biovision).

5.5.3.3. Curva patrn de etanol.
Se prepar una curva tipo de etanol siguiendo el siguiente protocolo: se adicionaron en un tubo
eppendorf 11.7 L de etanol estndar y 988.3 L del regulador de pH, se mezclaron
vigorosamente con un vrtex. De esta mezcla se tomaron 10 L y se disolvieron nuevamente
con 990 L de regulador de pH, obteniendo una concentracin de 2 nmol/L de etanol.
Posteriormente se realizaron las diluciones de acuerdo al Cuadro 17 (por duplicado) y se
trataron de acuerdo la tcnica de la determinacin de la concentracin de etanol descrita
anteriormente.

47

Cuadro 17. Diluciones para la curva patrn de etanol.
MUESTRA (POR
DUPLICADO)
|ETANOL EN LA MUESTRA|
(mg/L)
VOLUMEN DE LA
SOLUCIN DE ETANOL
DE 2 nmol/(L
(L)
VOLUMEN DEL
REGULADOR DE pH (L)
1 (blanco) 0.0 0.00 50.00
2 0.7 4.00 46.00
3 2.2 12.00 38.00
4 3.0 16.00 34.00
5 3.6 20.00 30.00



Se elabor la curva patrn en donde se grafic en el eje de las abscisas (eje x) el promedio
de la concentracin de etanol determinada en mg/L y en el eje de las ordenadas (eje y) el
promedio de la absorbancia determinada a 570 nm. Se determin la ecuacin de la lnea recta
que relaciona a los dos parmetros:
y = mx + b

(11)

En donde y representa la absorbancia que se determin a 570 nm, x representa la
concentracin de etanol que se determin en mg/L, m representa la pendiente de la lnea
recta y b es la interseccin al origen.

De esta manera se pudo determinar la siguiente ecuacin:

Concentracin de glucosa (g/L) = pendiente (absorbancia a 570 nm + b

(12)
La curva patrn obtenida para la determinacin de la concentracin de etanol se observa en la
Figura 20.


48

Figura 20.Curva patrn realizada para determinar la cantidad de etanol mediante la oxidacin
de etanol con la enzima Alcohol Oxidasa. La ecuacin de regresin de la curva es: y=47.851
0.0067 y su R
2
=0.993.


5.5.4. Cintica de la fermentacin de los azcares reductores contenidos
en los medios M1, M2 y M3 con la bacteria Zymomonas mobilis B-806.
Como se mencion anteriormente en la cintica se evaluaron los rendimientos de produccin
de bioetanol, los tiempos de consumo y crecimiento. En las cinticas realizadas con cada
medio (y por triplicado), se sigui el mismo procedimiento mostrado en la Figura 21.


Figura 21. Diagrama de la cintica de crecimiento, consumo y produccin de bioetanol.
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004
O
.

D
.

5
7
0

n
m
[Etanol Estndar] (g/L)
Del matraz semilla se tomaron 35 mL
y se inocularon en un matraz que
contena 200 mL del medio a evaluar
(por triplicado).
Los matraces se incubaron a 28C, 100
rpmy 72 h.
De cada matraz se tomaron 10 mL del
caldo de cultivo cada 6 h. Las
muestras del caldo de cultivo se
guardaron en tubos de 50 mL de
capacidad .
Los 10 mL se centrifugaron a 5000
rpm, temperatura ambiente durante
20 minutos.
Se tom 1 mL y se guard en
congelacin 35C, hasta anali zar la
muestra de acuerdo a los puntos
5.5.1. y 5.5.3.
El pellet sedimentado se us para
determinar la cantidad de biomasa de
acuerdo a la metodologa descrita en
el punto 5.5.2.

49
Los resultados obtenidos en las cinticas de produccin de etanol permitieron decidir qu
medio de cultivo era el ideal para el siguiente experimento.



5.6. Fase 5. Fermentacin, en un Biorreactor de 2 L New Brunswick Scientific
Bioflo 110, del medio de cultivo M3 con Zymomonas mobilis.

La fermentacin de los azcares reductores con la bacteria Zymomonas mobilis B-806 se llev
a cabo en un Biorreactor New Brunswick Scientific Bioflo 110 de 2 L de capacidad, Figura 22.
Como se puede observar la tapa contaba con entradas para inocular y para suministrar la
solucin cida y bsica. Las condiciones de esterilidad se lograron esterilizando el biorreactor
conteniendo 1.2 L del medio M3 en el autoclave a 1.5 Kg/cm
2
, 121 C durante 15 minutos; la
fermentacin se llev a cabo dentro de un cuarto estril, al inocular y tomar muestras se
utilizaban dos mecheros encendidos cerca del biorreactor. En la Figura 23 se muestra la
metodologa que se sigui en la cintica de la fermentacin con Z. mibilis 806.


Figura 22. Biorreactor New Brunswick Scientific Bioflo 110 2 L conectado al mdulo de
control.

50


Figura 23. Diagrama de la cintica de fermentacin en un Biorreactor de 2 L.
La cintica de la fermentacin de los azcares reductores contenidos en el M3 se desarroll
por duplicado.


5.7. Fase 6. Anlisis estadstico.

Usando el Software Minitab versin 15.0; se realiz un diseo experimental factorial 2
3
y un
diseo experimental factorial central 2
3
para el anlisis estadstico de los datos obtenidos en la
hidrlisis cida y la hidrlisis enzimtica, respectivamente. Adems de realizar el ANOVA para
cada uno de los diseos. Los datos fueron analizados con un nivel de confianza del 95%,
o=0.05 y los ensayos se realizaron por triplicado.

Para las cinticas de fermentacin se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) mediante un
Diseo Completamente Aleatorio para determinar diferencias significativas en los datos de
produccin de etanol, se utiliz un nivel de confianza del 95% y todos los experimentos se
realizaron por triplicado.



Biorreactor con 1.2 L del medio de
cultivo (M3), condiciones
controladas: temperatura 28C, pH
6.8 y agitacin 100 rpm.
El biorreactor se inocul con Z. mobilis
NRRL B806 al 15 % (v/v) bajo
condiciones estriles.
Inmediatamente se tom una alcuota de 10 mL,
considerando este el tiempo cero (T0). Esta muestra
se deposit en un tubo de 50 mL. Posteriormente se
tomaron alcuotas de 10 mL cada 6 h hasta completar
108 h de fermentacin.
Los 10 mL se centrifugaron a 5000
rpm, temperatura ambiente durante
20 minutos.
Se tom 1 mL y se guard en
congelacin 35C, hasta anali zar la
muestra de acuerdo a los puntos
5.5.1. y 5.5.3.
El pellet sedimentado se us para
determinar la cantidad de biomasa de
acuerdo a la metodologa descrita en
el punto 5.5.2.
Esterilizacin del
biorreactor con el
medio de cultivo.
Automatizado por
medio de un mdulo
de control .

51

5.8. Material y equipo.

Los materiales y equipos usados en el trabajo experimental se enlistan a continuacin:

- Homogenizador Osterizer Super d Luxe.
- Incubadora orbital ESEVE, INO-65OV-7.
- Balanza Sartorius CP324S.
- Ultracentrifuga Hermile 2300.
- Congelador REVCO, -34C.
- Espectrofotmetro DU 630 UV-VIS Beckman.
- Bao Polystat temperatura controller Cole-Parmer.
- Bao Julabo TW20.
- Vrtex Thermolyne, Maxi Mix Plus.
- Parrilla de agitacin Barnstead Thermolyne.
- Potencimetro Oakton, pH 2500 series.
- Autoclave Yamato, SM510.
- Microscopio electrnico ambiental Olympus CX3.
- Thermomixer comfort 1.5 mL.
- Sistema de filtracin Millipore.
- HPLC Beckman System Gold 116.
- Detector IR Jasco RI-1530.
- Autosampler 508 Beckman.
- Horno estabilizador de temperatura de columnas Beckman.
- Columna para Carbohidratos SUPELCOGEL
TM
Ca, 30 cm x7.8 mm.
- Software HPLC 32 Karat 7.0.
- Gasas.
- Papel filtro Whatman No. 1.
- Portafiltro Swinnex.
- Membranas de filtracin MF- Millipore, 0.22 m.
- Tubos eppendorf 1.5 mL.
- Tubos Falcon 50 mL.
- Viales Screw top, 4.6 mm y 6.0 mm with septa, 2.0 mL.
- Pipetas 1-10 L, 20-200 L, 100-1000 L, 1-5 mL y de 2-10 mL.
- Matraces Erlenmeyer 100, 250 y 500 mL.

52


5.9. Soluciones.

- Bisulfito de Sodio 20 mM.
- cido ctrico 10 mM.
- cido Sulfrico 1 y 5 % (v/v).
- Regulador de citratos 20 mM.
- cido 3,5-dinitrosalcilico (DNS).
- Solucin de glucosa 0.2% (w/v).
- Solucin enzimtica 1 (o-Amilasa 3 U/mg de harina).
- Solucin enzimtica 2 (Amiloglucosidasa 0.02 U/mg de harina)
- H
2
O grado HPLC.
- Ethanol assay kit BioVision.
- Solucin salina 0.9% (w/v).
- Solucin de etanol 70% (v/v).



53
6. RESULTADOS Y DISCUSIN.

Dentro del presente trabajo se busc principalmente comprobar la biodisponibilidad de la fuente
carbono (a partir de un yuca, malanga o camote) para la produccin de bioetanol con una cepa
de Z. mobilis (Zymomonas mobilis NRRL-806). Para poder lograr este objetivo se realizaron
experimentos relacionados con el pre-tratamiento de la materia prima y con cinticas de
produccin de bioetanol.

6.1. Seleccin y pre-tratamiento de la materia prima.

Se seleccionaron tres tubrculos (races): yuca (Manihot esculenta Crant), camote (Ipomea
batata) y malanga (Colocasia esculente Schott), como posible materia prima para la produccin
de etanol con Zymomonas mobilis B-806. Estos tubrculos se seleccionaron debido a que son
cultivados en Mxico y no son una fuente de alimento importante para la poblacin mexicana.
Cabe sealar que los tubrculos utilizados en este proyecto se compraron en el mercado de
San Juan, ubicado en la calle Ernesto Pugibet entre Jse Marroqu y Luis Moya, a cuatro
cuadras del Eje Central Lzaro Crdenas, Ciudad de Mxico.


Tambin se decidi utilizar tres diferentes medios de cultivo, utilizando como fuente de carbono
los azcares producidos en el proceso de pre-tratamiento. La finalidad de este experimento fue
evaluar el rendimiento de la produccin de etanol con Z. mobilis NRRL-806 en cada uno de los
medios de cultivo.


6.1.1. Determinacin de la cantidad de almidn, soluble al agua, contenido
en las races de yuca, camote y malanga.
Se determin la cantidad de almidn soluble al agua en cada uno de los tubrculos elegidos,
los valores obtenidos se muestran en el Cuadro 18. En el caso del camote se obtuvo una
concentracin del 7.25 0.43 % (w/v) de almidn, que a diferencia del valor obtenido por
Panda et al (2007) donde el contenido de almidn en el camote (Ipomea batata) fue de 14.8
3.5 % (w/v), se observ una diferencia en la cantidad de almidn de aproximadamente la mitad
del valor reportado por Panda et al (2007). Esta diferencia se puede explicar debido a la
diferencia entre las variedades de camotes utilizadas en ambos trabajos; ya que tan slo en
Mxico, existen de forma generalizada, tres variedades: la blanca, la amarilla y la morada.
Mientras que es ms comn encontrar las variedades blanca y amarilla durante todo el ao, la

54
variedad morada (ms dulce) slo es temporal. En nuestro caso utilizamos la variedad amarilla,
que de acuerdo a Linares, E. et al (2008) contiene 11.8 % de almidn y 74% de humedad,
valores que se acercan ms a los las cantidades expresadas en el Cuadro 18.

Cuadro 18. Concentracin de almidn en 100 gramos de tubrculo en base hmeda .
MUESTRA
TUBRCULO
RENDIMIENTO DE ALMIDN
BASE HMEDA (%)
HMEDAD (%)
CAMOTE 7.25 0.43 78.00
MALANGA 20.91 0.38 68.40
YUCA 27.35 0.42 62.00


En el caso de la malanga se obtuvo una concentracin de almidn del 20.91 0.38 % (w/v),
este valor es aproximado al reportado por la Comisin Veracruzana de Comercializacin
Agropecuaria en el 2006, Cuadro 7.

La cantidad de almidn que se obtuvo de la yuca es menor a la concentracin reportada por
Bradbury y Holbway (1988), en su trabajo reportaron que por 100 g de yuca haban 31 g de
almidn, lo que representa el 31 % (w/v) (Cuadro 5). An as, el rendimiento de la cantidad de
almidn en la yuca obtenido en el presente trabajo es el ms alto de los tres tubrculos
analizados.

Tomando en cuenta los valores expresados en el Cuadro 18, se eligi a la yuca y a la malanga
como posibles materias primas para producir bioetanol. Sin embargo, esto se decidi en los
siguientes puntos, al comparar el rendimiento de los azcares reductores producidos en la
parte de la hidrlisis.

Otro inconveniente por el cual se descart el uso del camote en la siguiente etapa fue que al
momento de realizar la harina
9
de cada tubrculo, el camote present caractersticas en su
textura difciles de manipular, esto debido a la gran cantidad de fibra contenida en el mismo.






9
Para las pruebas de hidrlisis se utiliz la harina de cada tubrculo.

55










Figura 24. Arriba: Yuca (Manihot esculenta). Abajo: Malanga (Colocasia esculenta).




6.2. Hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga.

Con ayuda del software Minitab 15.0 se realiz el Diseo Experimental Factorial 2
3
de la
hidrlisis cida de la harina de malanga y yuca, en este tipo de diseo se estudiaron tres
factores considerados importantes en la reaccin. Estos factores fueron: temperatura,
concentracin de cido sulfrico (H
2
SO
4
) y tiempo, los cuales se estudiaron a dos niveles, uno
bajo y otro alto. Con este diseo se busc encontrar las condiciones de hidrlisis cida a la
cuales se obtuvieran altos rendimientos de azcares reductores.

El Diseo Experimental Factorial diseado en Minitab 15.0 arroj 8 diferentes combinaciones
de los factores y sus niveles, lo cual se traduce a 8 ensayos diferentes llevados a cabo de
forma experimental (realizados por triplicado). En los Cuadros 19 y 20 se muestran las
combinaciones obtenidas en el diseo del experimental y la respuesta obtenida despus de
realizados los experimentos. Se observ que las condiciones experimentales de la prueba 8
son las ms favorables para la reaccin ya que se obtiene el rendimiento ms alto de azcares
reductores. Por otra parte se realiz el ANOVA (anlisis de varianza) para poder determinar si
la hiptesis nula Ho es aceptada o rechazada, se quiere comprobar si alguno de los efectos
evaluados tiene efectos significativos en la respuesta.




56



Cuadro 19. Diseo Experimental Factorial 2
3
de la hidrlisis cida de la harina de malanga.
EXPERIMENTO
(POR
TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
[CIDO
SULFRICO]
(%)
TIEMPO (h) RENDIMIENTO (g GLUCOSA/
g HARINA DE MALANGA)
1 60 1 1 0.057
a

2 95 1 1 0.089
a

3 60 5 1 0.030
a

4 95 5 1 0.352
b

5 60 1 5 0.086
a

6 95 1 5 0.260
b

7 60 5 5 0.143
b

8 95 5 5 0.795
c

* Nota: Mediante el Mtodo LSD de Fisher se determin la existencia de igualdad entre medias. Los rendimientos
marcados con la misma letra no muestran diferencias significativas de acuerdo a este Mtodo. 7. LSD = 0.326.






Cuadro 20. Diseo Experimental Factorial 2
3
de la hidrlisis cida de la harina de yuca.
EXPERIMENTO
(POR
TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
[CIDO
SULFRICO]
(%)
TIEMPO (h) RENDIMIENTO (g
GLUCOSA/ g
HARINA DE YUCA)
1 60 1 1 0.036
a

2 95 1 1 0.144
a

3 60 5 1 0.047
a

4 95 5 1 0.379
b

5 60 1 5 0.163
a

6 95 1 5 0.491
b

7 60 5 5 0.179
a

8 95 5 5 0.526
b

* Nota: Mediante el Mtodo LSD de Fisher se determin la existencia de igualdad entre medias. Los rendimientos
marcados con la misma letra no muestran diferencias significativas de acuerdo a este Mtodo. LSD = 0.181.





57
Para las respuestas (rendimiento de azcares reductores) obtenidas en ambos diseos la tabla
del anlisis de varianza (ANOVA) usando un nivel de confianza del 95%, o=0.05, mostr lo
siguiente:

Considerando que para ambos diseos experimentales (hidrlisis cida de la harina de yuca y
malanga):

- A (concentracin de H
2
SO
4
).
- B (Temperatura).
- C (Tiempo).

En el caso de la hidrlisis cida de la harina de malanga la hiptesis nula de que el factor A no
afecta el rendimiento de azcares reductores se rechaz, ya que la concentracin de H
2
SO
4
s
tiene efectos significativos en la reaccin de hidrlisis cida de la harina malanga. La hiptesis
nula de que el factor B no afecta el rendimiento de azcares reductores se rechaz, ya que la
temperatura s tiene efectos significativos en la reaccin de hidrlisis cida de la harina
malanga. La hiptesis nula de que el factor C no afecta el rendimiento de azcares reductores
se rechaz, ya que el tiempo de reaccin s afecta el rendimiento de los azcares reductores
en la reaccin de hidrlisis.

Por otra parte para el diseo experimental de la hidrlisis cida de la harina de yuca las
hiptesis nulas de que los factores A y B (concentracin de H
2
SO
4
y tiempo de reaccin) no
afectan el rendimiento de azcares reductores se rechazaron, ya que de acuerdo al ANOVA
estos factores tuvieron efectos significativos en la respuesta.

Para hacer ms evidente la informacin obtenida del ANOVA se us una Grfica Normal de
Efectos Estandarizados (Figura 25) para comparar la magnitud relativa y la significacin
estadstica de los efectos principales y su interaccin. En la Figura 25 se observa una grfica
con una lnea que atraviesa el grfico, en esta lnea es donde se espera que caigan todos los
puntos, s el efecto fuera nulo. Por lo general, s los puntos no estn cerca de esta lnea es una
seal de que su efecto es significativo en la respuesta y mientras ms se alejen de sta su
efecto ser mayor.






58

Figura 25. Grfica normal de los efectos estandarizados, que muestra la significancia de los
efectos encontrados en a) La hidrlisis cida de la harina de malanga y b) La hidrlisis cida de
la harina de yuca.


En la Figura 25 a) se observa que los 3 factores estudiados en la hidrlisis cida de la harina
de malanga tienen efectos significativos en la respuesta. El factor que tiene un mayor efecto es
la concentracin del cido ya que es el punto ms apartado de la lnea. El efecto de este factor
es seguido por la interaccin de los factores AB, el efecto de esta interaccin significa que el
efecto de la temperatura no es el mismo utilizando diferentes concentraciones de cido.
Por otro lado, en la Figura 25 b) se muestra que slo dos factores tienen efectos significativos
sobre la hidrlisis cida de la harina de yuca, stos son la concentracin de cido sulfrico y el
tiempo de reaccin.
4 3 2 1 0 -1 -2 -3
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Standardized Effect
P
e
r
c
e
n
t
A [cido Sulfrico] (%)
B Temperatura (C)
C Tiempo
Factor Name
Not Significant
Significant
Effect Type
AB
C
B
A
Normal Plot of the Standardized Effects
(response is [Azcares reductores] (g/L), Alpha = 0.05)
7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Standardized Effect
P
e
r
c
e
n
t
A [cido sulfrico] (%)
B Temperatura (C)
C Tiempo (h)
Factor Name
Not Significant
Significant
Effect Type
C
A
Normal Plot of the Standardized Effects
(response is [Azcares reductores] (g/L), Alpha = 0.05)
a)
b)

59
Esta misma informacin nos la proporciona el Diagrama de Pareto, en donde se grafican de
forma descendiente los factores y el grado de significancia de los mismos. Esta significancia es
dada por la lnea que atraviesa el grfico y nos muestra que slo los factores que atraviesan
esa lnea tienen efectos significativos en la respuesta. En la Figura 26 se muestra el Diagrama
de Pareto obtenido a partir del diseo experimental de: a) la hidrlisis cida de la harina de
malanga y b) de la hidrlisis cida de la harina de yuca. De carcter un poco ms grfico que la
figura anterior, se puede observar lo ya mencionado en el prrafo anterior.


Figura 26. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados, en donde se observan los
efectos de los factores estudiados en a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la
hidrlisis cida de la harina de yuca.


BC
ABC
AC
B
C
AB
A
4 3 2 1 0
T
e
r
m
Standardized Effect
2.120
A [cido Sulfrico] (%)
B Temperatura (C)
C Tiempo
Factor Name
Pareto Chart of the Standardized Effects
(response is [Azcares reductores] (g/L), Alpha = 0.05)
ABC
BC
AC
B
AB
C
A
7 6 5 4 3 2 1 0
T
e
r
m
Standardized Effect
2.120
A [cido sulfrico] (%)
B Temperatura (C)
C Tiempo (h)
Factor Name
Pareto Chart of the Standardized Effects
(response is [Azcares reductores] (g/L), Alpha = 0.05)
a)
b)

60
La diferencia entre los efectos producidos en la hidrlisis cida de las dos diferentes materias
primas puede ser provocada por la composicin de las mismas, ya que para dicho experimento
se utiliz la harina de los tubrculos y no slo el almidn, entonces debemos de tomar en
cuenta que parte de la harina no slo es almidn, sino tambin fibra y otros compuestos.

De acuerdo al ANOVA los factores con efectos significativos afectan positivamente a la
respuesta, esto quiere decir que si seguimos aumentando el valor de las variables
(concentracin de H
2
SO
4
, temperatura y tiempo) la concentracin de azcares reductores
tambin podra aumentar.

Sin embargo, en ambos casos el punto mximo de produccin de azcares reductores (0,795
g
azcares
/g
harina de malanga
y 0.526 g
azcares
/ g
de harina de yuca
) se registr a los 95C, tiempo de 5 horas y
una concentracin de H
2
SO
4
del 5 % (v/v). Despus de este tiempo la concentracin de
azcares reductores fue disminuyendo, esto pudo ser ocasionado a la probable
descomposicin de los azcares en cidos orgnicos, furfural o compuestos fenlicos (Aguilar,
R. y Canizales, L., 2004).

En Grfica de Efectos Principales sobre la respuesta (rendimiento de los azcares reductores),
(Figura 27) se observa de forma detalla el efecto por separado de cada factor al nivel evaluado.
En el caso de la hidrlisis cida de la harina de malanga los tres factores en su nivel ms alto
producen rendimientos altos de azcares reductores. Por otra parte, en el caso de la hidrlisis
de la harina de yuca slo observamos que la concentracin del cido y el tiempo son factores
que tienen efectos significativos en su nivel alto sobre la respuesta.

Dado que, en el caso de la temperatura se obtuvo la mxima produccin de azcares
reductores a los 95 C en todos los ensayos realizados, en un futuro se podran realizar otros
ensayos variando la concentracin del cido y el tiempo. No obstante, la finalidad del presente
trabajo slo fue encontrar dentro de los factores evaluados y sus niveles las condiciones a las
cuales se produce una mayor cantidad de azcares.

Como se mencion anteriormente, se trat de evaluar la hidrlisis a tiempos mayores, como lo
hace Ferrer, J. R. et al. (2002), los cuales evaluaron la cintica de la hidrlisis cida del
bagacillo de caa en tiempos de hasta 8 y12 horas; sin embargo, debemos observar la gran
diferencia existente entre el bagacillo de caa integrado principalmente por lignocelulosa y la
harina utilizada en el presente trabajo.


61


Figura 27. Grfica de los efectos principales, en donde se observa el efecto de los factores
evaluados en a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la hidrlisis cida de la harina
de yuca.

Con la finalidad de facilitar la visualizacin de la forma de la superficie de respuesta en tres
dimensiones se realiz la Grfica de Contornos (Figura 28) de cada uno de los diseos
experimentales, en este tipo de grfica las curvas de los valores iguales de respuesta se
grafican en un plano donde los ejes coordenados representan los niveles de los factores. Cada
curva representa un valor especfico de la altura de la superficie, es decir un valor especfico de
Y.
5 1
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
5 1
[cido sulfrico] (%)
M
e
a
n
Tiempo (h)
Main Effects Plot for [Azcares reductores] (g/ L)
Data Means
a)
b)

62
Esta grfica nos ayuda a enfocar nuestra atencin en los niveles de los factores a los cuales
ocurre un cambio en la altura de la superficie.


Figura 28. Grfica de contornos, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b) la
hidrlisis cida de la harina de yuca.

En las figuras anteriores se observa que conforme van subiendo los niveles de los factores el
rendimiento de los azcares tambin aumenta. Se observa que cuando se alcanzan los niveles
ms altos de los factores evaluados, de igual forma, se observa la mxima produccin de
azcares reductores (dentro de los lmites estudiados) utilizando ambas materias primas.


Tiempo
[

c
i
d
o

S
u
l
f

r
i
c
o
]

(
%
)
5 4 3 2 1
5
4
3
2
1
>





< 0.1
0.1 0.3
0.3 0.5
0.5 0.7
0.7 0.9
0.9 1.1
1.1
(g/L)
reductores]
[Azcares
Contour Plot of [Azcares reduct vs [cido Sulfrico, Tiempo
Tiempo (h)
[

c
i
d
o

s
u
l
f

r
i
c
o
]

(
%
)
5 4 3 2 1
5
4
3
2
1
>





< 0.1
0.1 0.2
0.2 0.3
0.3 0.4
0.4 0.5
0.5 0.6
0.6
(g/L)
reductores]
[Azcares
Contour Plot of [Azcares reduct vs [cido sulfrico, Tiempo (h)
a)
b)

63
Finalmente se obtuvieron las superficies de respuesta (Figura 29) de ambos diseos
experimentales, stas se graficaron a partir de las ecuaciones de regresin correspondientes
(ecuaciones 13 y 14). Estas ecuaciones son lineales, es decir que no se obtuvieron puntos
medios (mximos o mnimos).

Ecuacin de regresin de la hidrlisis cida de la harina de malanga:

D = -0.531 + 0.0735 A + 0.00511 B + 0.0471 C

(13)

Ecuacin de regresin de la hidrlisis cida de la harina de yuca:

D = -0.253 + 0.0699 A + 0.00192 B + 0.0471 C

(14)

En donde:
A = Concentracin de cido sulfrico (% v/v)
B = Temperatura (C)
C = Tiempo (h)
D = Concentracin de azcares reductores (g/L)

Las superficies de respuesta derivadas de cada diseo experimental se exponen en la Figura
29, se puede observar que en ambas graficas la tendencia es lineal y que el rendimiento ms
alto de azcares reductores (concerniente a este experimento y dentro de los valores
estudiados) se alcanza en la interaccin de los puntos ms altos de los factores estudiados.

Con todo lo anterior se puede deducir que el factor que tiene mayores efectos sobre el
rendimiento de los azcares reductores es la concentracin de H
2
SO
4
.

Estos resultados son
similares a los encontrados por Kim y Hamdy (1985), quienes observaron que, para el almidn
de camote, la velocidad de hidrlisis dependa de la concentracin de cido (HCl), temperatura
y tiempo; observaron tambin que con elevadas concentraciones de cido y altas temperaturas
haba una rpida formacin de azcares reductores, pero stos se destruan de la misma
forma. En otro estudio realizado por Ferrer et al., (2002) se lleg a la conclusin de que la
mayor produccin de azcares reductores en la hidrlisis de bagacillo de caa fue de 50.3 %
(w/v) utilizando una concentracin de H
2
SO
4
al 6 % y 4 horas de reaccin, se obtuvo un
mximo rendimiento. Esto nos sugiere que posiblemente la fuente de carbono tambin sea un
factor a considerar, ya que de acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo las

64
condiciones de hidrlisis cida que favorecen la produccin de azcares reductores fueron
diferentes a la encontradas por Ferrer et al., (2002). En el caso de la malanga se observ un
rendimiento poco menor al encontrado por Kim y Hamdy (1985) con la hidrlisis del almidn de
camote (84.2 %), sin embargo, cabe aclarar que en este trabajo se utiliz la harina de yuca y
malanga, a diferencia del estudio realizado por Kim y Hamdy donde se us slo el almidn de
camote. Ello nos sugiere que el grado de pureza del almidn tambin afecta el proceso de
hidrlisis. Cabe mencionar que la hidrlisis cida es un proceso poco amigable con el
ambiente, aparte se deben estudiar con detenimiento la concentracin del cido y el tiempo de
reaccin, ya que es posible que las mismas condiciones de reaccin degraden las molculas
de los azcares reductores formados y de esta manera se obtengan rendimientos bajos de
azcares.


Figura 29. Superficie de respuesta de a) la hidrlisis cida de la harina de malanga y b)
la hidrlisis cida de la harina de yuca.
[
A
z

c
a
r
e
s
r
e
d
u
c
t
o
r
e
s
]
(
g
/
L
)
Tiempo(h)
[
A
z

c
a
r
e
s
r
e
d
u
c
t
o
r
e
s
]
(
g
/
L
)
Tiempo(h)
a)
b)

65
6.3. Hidrlisis enzimtica de la harina de yuca y malanga.

Con ayuda de la herramienta estadstica Minitab 15.0 se realiz el Diseo Experimental Central
Factorial 2
3
de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca y malanga, en este diseo se
estudiaron tres factores (considerados importantes en la reaccin de hidrlisis). Estos factores
fueron: temperatura, pH y tiempo. Se estudiaron dos niveles, correspondientes a las
especificaciones de las enzimas utilizadas y proporcionadas por Sigma Aldrich:
- -Amilasa: Una unidad de -Amilasa libera 1.0 mg de maltosa a partir de almidn en 3
minutos, pH 6.9 a 20C.
- Amiloglucosidasa: Una unidad de Amiloglucosidasa libera 1mol de glucosa por minuto
con un pH 4.8 y 60C.
Cabe mencionar que, a diferencia de Kunamneni et al. (2005), Magee et al. (1985) y Mera et al.
(2003), la reaccin de hidrlisis se realiz de manera que existiera sinresis entre ambas
enzimas, por lo que stas se adicionaron al mismo tiempo. El nmero de experimentos, las
combinaciones originadas a partir del diseo experimental y la respuesta obtenida para cada
ensayo se muestran en los Cuadros 21 y 22.
Cuadro 21. Diseo Experimental Central Factorial 2
3
de la hidrlisis enzimtica de la harina
de malanga.
EXPERIMENTO
(POR
TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
pH TIEMPO (h) RENDIMIENTO (g
GLUCOSA/ g HARINA
DE MALANGA)
1 40 5.85 3.00 0.035
a

2 60 4.80 1.00 0.107
b

3 6.3 5.85 3.00 0.029
a

4 20 6.90 1.00 0.052
a

5 60 6.90 1.00 0.070
b

6 40 5.85 6.36 0.073
b

7 40 5.85 0.36 0.074
b

8 60 4.80 5.0 0.096
b

9 73.4 5.80 3.0 0.113
c

10 40 4.08 3.0 0.171
c

11 20 4.80 5.00 0.116
c

12 20 4.80 1.00 0.052
a

13 60 6.90 5.00 0.062
b

14 20 6.90 5.00 0.096
b

15 40 7.61 3.00 0.070
b
* Nota: Mediante el Mtodo LSD de Fisher se determin la existencia de igualdad entre medias. Los rendimientos
marcados con la misma letra no muestran diferencias significativas de acuerdo a este Mtodo. LSD = 0.055.

66

Cuadro 22. Diseo Experimental Central Factorial 2
3
de la hidrlisis enzimtica de la harina
de yuca.
EXPERIMENTO
(POR
TRIPLICADO)
TEMPERATURA (C)
pH TIEMPO (h) RENDIMIENTO (g
GLUCOSA/ g
HARINA DE YUCA)
1 40 5.85 3.00 0.064
a

2 60 4.80 1.00 0.184
b

3 6.3 5.85 3.00 0.022
a

4 20 6.90 1.00 0.055
a

5 60 6.90 1.00 0.104
a

6 40 5.85 6.36 0.061
a

7 40 5.85 0.36 0.037
a

8 60 4.80 5.0 0.063
a

9 73.4 5.80 3.0 0.255
b

10 40 4.08 3.0 0.181
b

11 20 4.80 5.00 0.104
a

12 20 4.80 1.00 0.055
a

13 60 6.90 5.00 0.123
c

14 20 6.90 5.00 0.078
a
15 40 7.61 3.00 0.065
a

* Nota: Mediante el Mtodo LSD de Fisher se determin la existencia de igualdad entre medias. Los rendimientos
marcados con la misma letra no muestran diferencias significativas de acuerdo a este Mtodo. LSD = 0.074.

El rendimiento mximo de conversin para la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga) se
obtuvo en los experimentos 9, 10 y 11 del Cuadro 21. Los rendimientos obtenidos en este
grupo de datos no muestran diferencias significativas, estadsticamente son iguales.

Los rendimientos ms altos generados en la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, se
produjeron en los experimentos 2, 9 y 10 del Cuadro 22, por lo que son estadsticamente
iguales.

Para comprobar si alguno de los factores tuvo mayor efecto sobre la respuesta se realiz el
ANOVA para poder determinar si la hiptesis nula (Ho) se aceptaba o rechazaba. La hiptesis
nula (Ho) para este trabajo significa que no existen efectos significativos sobre la respuesta.


67
Para las respuestas (rendimiento de azcares reductores) obtenidas en ambos diseos la tabla
del anlisis de varianza (ANOVA) usando un nivel de confianza del 95%, o=0.05, mostr lo
siguiente:

En la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga la hiptesis nula de que la temperatura y el
pH no tienen efectos significativos sobre la respuesta se rechaz, ya que stos dos factores si
tuvieron efectos significativos sobre el rendimiento de azcares reductores; las hiptesis de que
el cuadrado de la temperatura, el pH y el tiempo no muestran efectos sobre la respuesta,
tambin se rechazaron y finalmente la hiptesis de que la interaccin de la temperatura y el
tiempo no afectan la respuesta, tambin se rechaz.

Todo lo anterior quiere decir que la temperatura, el pH, la temperatura
2
, el pH
2
, el tiempo
2
y la
interaccin entre la temperatura y el tiempo, son factores que afectan los rendimientos de los
azcares reductores en la reaccin de hidrlisis enzimtica de la harina de malanga. Cabe
mencionar que de acuerdo al ANOVA tanto el pH y la interaccin de la temperatura y el tiempo
tienen efectos negativos sobre la respuesta, esto significa que si aumentamos el valor del
factor, disminuye el valor de la respuesta.

Por otra parte en el caso de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca se rechaza la hiptesis
nula de que la temperatura, el pH, temperatura
2
, el pH
2
y la interaccin de la temperatura y el
tiempo no tuvieron efectos significativos sobre la respuesta. El pH y la interaccin entre la
temperatura y el tiempo tuvieron efectos negativos sobre la respuesta.

De acuerdo a Kunamneni, A. y Singh, S. (2005), el factor ms importante en la reaccin de
hidrlisis es la temperatura, en su trabajo ellos estudiaron la hidrlisis del almidn de maz;
seguido por la concentracin de o-amilasa en el proceso de pre-cocimiento del almidn de
maz.

Antes de mostrar las superficies de respuesta, originadas a partir de los diseos
experimentales, resulta importante presentar las Grficas de Contornos de las hidrlisis
enzimticas estudiadas. En la Grfica de Contornos y la superficie de respuesta slo se
graficaron los factores de temperatura, pH y la respuesta, ya que de acuerdo al ANOVA el
tiempo en este diseo y con los valores estudiados es un factor que no presenta efectos sobre
el rendimiento de azcares reductores.


68

Figura 30. Grfica de contornos, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga y b)
la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca.

Como ya se haba mencionado anteriormente, el propsito de la Grfica de Contornos es
simplificar el anlisis de la superficie de respuesta. En la Figura 30 se observan crculos o
curvas que representan los niveles de los factores estudiados, esto quiere decir que en la
superficie de respuesta cada crculo representa en su interior valores iguales de respuesta
(rendimiento de azcares reductores). En la Figura 30 a) se observa que los rendimientos ms
altos se obtuvieron a 70 C y un pH de 4 aproximadamente. De la misa manera sucede en la
Figura 30 b).
Temperatura
p
H
70 60 50 40 30 20 10
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
Tiempo 3
Hold Values
>






< 0.050
0.050 0.075
0.075 0.100
0.100 0.125
0.125 0.150
0.150 0.175
0.175 0.200
0.200
(gGlu/gharina)
Rend.
Contour Plot of Rend.(gGlu/ gharina) vs pH, Temperatura
Temperatura
p
H
70 60 50 40 30 20 10
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
Tiempo 3
Hold Values
>






< 0,050
0,050 0,075
0,075 0,100
0,100 0,125
0,125 0,150
0,150 0,175
0,175 0,200
0,200
Rend(gGlu/gharina)
Contour Plot of Rend(gGlu/ gharina) vs pH; Temperatura
a)
b)

69
Se realizaron las superficies de respuesta (Figura 31) de los diseos experimentales de la
harina de malanga y yuca, la cuales se graficaron a partir de las ecuaciones de regresin
correspondientes (ecuaciones 15 y 16). Estas ecuaciones son cuadrticas y como se puede
observar en las superficies de respuesta generadas se obtuvieron puntos mnimos.

Las ecuaciones originadas a partir del ANOVA, son:

Ecuacin de la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga:

D = 0.926 + 0.002 A - 0.307 B + 2.6x10
-5
0.0471 A
2
+ 0.026 B
2
+ 0.002 C2 4.023x10
-4
AC

(15)

Ecuacin de regresin de la hidrlisis cida de la harina de yuca:

D = 0.774 4.07x0-4 A - 0.243 B + 3.23x10
-5
A
2
+ 0.017 B
2
4.92x10
-4
AC

(16)

En donde:
A = Temperatura (C)
B = pH
C = Tiempo (h)
D = Concentracin de azcares reductores (g/L)

Las superficies de respuesta generadas a partir de las ecuaciones 15 y 16, se muestran en la
Figura 26, en donde se observa que al centro de la superficie hay un mnimo, para ambos
casos. Esto quiere decir que en esta zona de la superficie de respuesta los rendimientos de los
azcares son los ms bajos. A pesar de esto, se puede ver que en las dos superficies hay un
punto en donde se obtienen los mximos rendimientos de azcares reductores. Este punto
corresponde a la interaccin al nivel ms alto de la temperatura y al nivel ms bajo de pH.

Los rendimientos mximos de los azcares reductores para ambos diseos se obtuvieron a
73.4 C, pH 4.08 y 3 h.

70

Figura 31. Superficie de respuesta, en donde se observan las condiciones en las cuales se
obtienen los rendimientos ms altos de a) la hidrlisis enzimtica de la harina de malanga y b)
la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca.

Los rendimientos ms altos estuvieron en el orden de 0.15-0.20 (g
azcares
/g
harina de malanga o yuca
) en
las hidrlisis enzimticas de la harina de yuca y malanga, se podra considerar que son bajos.
Kunamneni, A. y Singh, S. (2005) estudiaron el efecto de la concentracin del sustrato en la
reaccin y encontraron que obtenan los mximos rendimientos (72, 78 y 85 % de conversin)
con concentraciones del 10, 15 y 20% (w/v) del almidn de maz.
7
6
0.05
0.10
0.15
0
0.20
5
20
40 4
60
Rend.(gGlu/ gharina)
pH
Temperatura
Tiempo 3
Hold Values
Surface Plot of Rend.(gGlu/ gharina) vs pH; Temperatura
7
0.05
6
0.10
0.15
0
0.20
5
20
40 4
60
Rend(gGlu/ gharina)
pH
Temperatura
Tiempo 3
Hold Values
Surface Plot of Rend(gGlu/ gharina) vs pH; Temperatura
a)
b)

71
En los experimentos realizados en el diseo factorial del presente trabajo se utiliz una
concentracin de harina de yuca o malanga del 1 % (w/v), de acuerdo a la metodologa descrita
por Durn, P. y Muoz, A. (2003).

Kunamneni, A. y Singh, S. (2005) estudiaron el proceso de hidrlisis en tres partes: un pre-
cocimiento con o-amilasa, la licuefaccin con o-amilasa durante 30 minutos y la sacarificacin
con la amiloglucosidasa durante 72 h. Los autores observaron que la mxima eficiencia de
conversin (89%) ocurra con las siguientes condiciones: la licuefaccin de 70-90 C (ya que la
o-amilasa es termoestable) a un pH de 6 durante 30 minutos; mientras que la sacarificacin de
50-60 C con un pH de 5 durante 72 horas de reaccin.

Los valores de temperatura y pH considerados en este trabajo para producir altos rendimientos
de azcares reductores fueron similares a los encontrados por Kunamneni, A. y Singh, S.
(2005). No as, la concentracin del sustrato y los tiempos de reaccin, por tal motivo se decidi
hacer una cintica enzimtica cambiando el tiempo de reaccin a 12 h y la concentracin del
sustrato a 20 % (w/v) de la harina a evaluar (DNM). Se obtuvieron rendimientos de azcares
del 79.6 % (w/v) en el caso de la yuca y de 63.3 % (w/v) para la malanga. En este punto se
decidi escoger a la materia prima que, tras la reaccin de hidrlisis, generaba mayores
rendimientos de azcares reductores. Por lo que el siguiente paso fue realizar una cintica
enzimtica, con la harina de yuca 20 %(w/v), a 73.4 C, pH de 4.08 y durante 24 h (DNM). Se
obtuvieron 128 (g
azcares
/L) lo cual representa el 64% de conversin de la harina de yuca.

















72
6.4. Anlisis y cuantificacin de los azcares reductores obtenidos de la
hidrlisis cida y enzimtica de la harina de yuca y malanga usando la
tcnica de HPLC (High performance liquid chromatography).

La reaccin de hidrlisis (cida o enzimtica) dio como resultado una mezcla de carbohidratos,
que pueden ser fermentables. Debido a que se escogi para el proceso de fermentacin a la
bacteria Z. mobilis NRRL-806 y que sta slo puede fermentar azcares como la glucosa,
fructosa y sacarosa; fue de gran importancia realizar el anlisis de los componentes y sus
cantidades en los hidrolizados obtenidos. Para este anlisis slo se seleccionaron los
hidrolizados con los rendimientos ms altos de azcares reductores.

De forma generalizada, la cromatografa de lquidos permite el anlisis de una mezcla basada
en la separacin de los componentes y su posterior deteccin. En este tipo de cromatografa
hay una fase lquida que arrastra la muestra con un flujo constante de presin provocado por
una bomba, este flujo lleva a la mezcla hasta una columna donde se encuentra la fase
estacionaria. Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase
estacionaria y con la fase mvil; de este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria
a distintas velocidades y se van separando (Lough, W. J. y Warner, I. W., 1996). La aplicacin
de la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) permite separar y cuantificar azcares
elementales provenientes de la hidrlisis cida y enzimtica (Saeman et al., 1945; Montan D.
et al., 1994).

Existe una gran variedad de columnas que permiten la separacin de diversos compuestos, en
este proyecto se us la columna SUPELCOGEL Ca HPLC, empacada con una resina de
estireno sulfonado- divinilbenceno (S/DVB) de intercambio inico. sta es una resina aninica
(SO
3
-
H
+
) de intercambio catinico (Ca
2+
), ver Figura 32. Este tipo de columna est diseada
para separar carbohidratos, polioles (alcoholes de azcar) y productos de fermentacin.



73

Figura 32.Reaccin de intercambio inico en la Columna SUPELCOGEL
TM
Ca.


Los tiempos de retencin, para los carbohidratos que se pueden separar con la columna
SUPELCOGEL
TM
Ca, reportados en las especificaciones de la columna se muestra en el
Cuadro 23.

Cuadro 23. Tiempo de retencin de los azcares que pueden separarse con la Columna
SUPELCOGEL
TM
Ca.Fuente: Sigma-Aldrich Co, No. De catalogo: 59305-U.
AZCAR TIEMPO DE RETENCIN (min)
Melezitosa 9.30
Maltosa 10.50
Glucosa 12.50
Manosa 14.80
Fructosa 16.00
Ribitol 18.00




Sulfonato
Ca
2+
Ionesdelamortiguador
ocontraiones(H
2
O)
Las sustancia con
carga negativa
pasan a travs de la
fase negativa, sin
unirse.

74

Hay que considerar que los tiempos de retencin mostrados en el Cuadro 23 se obtienen con
un flujo de 0.5 mL/min. Como ya se mencion anteriormente, para la produccin de etanol con
Z. mobilis NRRL-806 slo se pretendi utilizar como materia prima el hidrolizado que present
una mayor concentracin de glucosa, ello nos llev (con fines prcticos) a aumentar la
velocidad de flujo de 0.5 mL/min a 0.8 mL/min para poder determinar los tiempos de retencin
con este flujo y adems poder calcular la cantidad de glucosa y maltosa en las muestras.

Los tiempos de retencin para la glucosa y la maltosa, con una velocidad de flujo de 0.8
mL/min, se muestran en el Cuadro 24.



Cuadro 24. Tiempos de retencin de los azcares de intres para la produccin de etanol
con una velocidad de flujo de 0.8 mL/min.
AZCAR TIEMPO DE RETENCIN (min)
Maltosa 6.76
Glucosa (Pico I) 7.86
Glucosa (Pico II) 8.62



Al realizar la curva tipo de la glucosa se utiliz un reactivo grado industrial, por este motivo en
los cromatogramas se observaron dos picos correspondientes a los ismeros de la glucosa, la
L-glucosa y la D-glucosa.

En la Figura 33 se muestran los cromatogramas de las muestras con mayores rendimientos de
azcares reductores provenientes de la hidrlisis cida de la harina de yuca y malanga,
originados a partir de la medidas realizadas con el detector IR Jasco del ndice de refraccin.


75

Figura 33. Cromatogramas de los hidrlizados de a) la harina de malanga y b) la harina de
yuca; producidos en la reaccin de hidrlisis cida.

En el cromatograma a) de la Figura 33, se observa que el pico ms grande tiene un tiempo de
retencin de 5.74 min, adems de otro pico pequeo con tiempo de retencin de 6.75, seguido
por dos picos ms, uno con tiempo de retencin de 7.88 min y el ltimo con 8.50 min. Esto nos
indica que en la hidrlisis cida de la harina de malanga se forma maltosa (15 g/L), y glucosa (I
y II) (80 g/L), sin embargo se forma otro azcar en mayor cantidad, de acuerdo al Cuadro 23,
podra ser melezitosa.
b)
a)

76
De forma similar, en la hidrlisis cida de la harina de yuca (Figura 33 b)se detect un
compuesto con tiempo de retencin de 5.88 min, seguido por dos pequeos picos con tiempos
de retencin de 7.90 y 8.50 min, respectivamente. Los productos de la hidrlisis cida de harina
de yuca son con una menor cantidad la glucosa (I y II) y significativamente mayor el compuesto
que podra ser la melezitosa.

Sin embargo, sucedi algo completamente diferente en el cromatograma obtenido a partir de
las muestras de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca. En la Figura 34 se observan 5
picos, en orden ascendente del tiempo de retencin son: pico1 (1.66 min), pico 2 (5.13 min),
pico 3 (7.78 min), pico 4 (8.40 min) y pico 5 (12.46 min).

Los picos 3 y 4 corresponden, de acuerdo al Cuadro 24, a la glucosa (L y D) con una
concentracin de 128.0 g/L.

Con base en los resultados obtenidos se decidi usar a la yuca como materia prima y a la
hidrlisis enzimtica como pre-tratamiento para generar los azcares fermentables utilizados en
el medio de cultivo para la produccin de etanol con Z. mobilis NRRL-806.




Figura 34. Cromatograma del hidrolizado producido en la hidrlisis enzimtica de la harina
de yuca.

77

6.5. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en los medios M1,
M2 y M3 con la bacteria Zymomonas mobilis NRRL-806.

Una vez que se eligi la materia prima y su pre-tratamiento para la obtencin de azcares, se
decidi estudiar su biodisponibilidad para la produccin de bioetanol con Z. mobilis NRRL-806,
al mismo tiempo se compararon tres diferentes medios de cultivo que contenan la misma
fuente de carbono (azcares reductores 20 g/L, obtenidos de la hidrlisis enzimtica de la
harina de yuca). Las condiciones de las cinticas de fermentacin fueron 28 C, 100 rpm y pH
6.8.
Mediante un Diseo Completamente Aleatorio (Minitab 15.0) se busc encontrar diferencias
estadsticas significativas en la produccin de etanol entre los tres diferentes medios de cultivo
evaluados. Los resultados de las cinticas de fermentacin de cada uno de los medio de cultivo
se presentan en la figura 34 (las cinticas se realizaron por triplicado).

Las concentraciones de etanol producidas al final de cada fermentacin (72 h) se muestran en
el Cuadro 25.

Cuadro 25. Etanol producido a las 72 h de fermentacin con cada medio de cultivo
evaluado.
TRATAMIENTO ETANOL (g/L)

CINETICA 1 CINETICA 2 CINETICA 3
MEDIO 1 5.49 5.36 5.80
MEDIO 2 9.58 9.55 9.23
MEDIO 3 15.12 13.03 11.58


En la tabla de ANOVA, el valor de p proporcion suficiente evidencia de que existen
diferencias estadsticamente significativas entre las cantidades de etanol producidas en cada
medio de cultivo (F
2,4
= 41.03, p<0.05).

En la figura 35 se observa que las cinticas iniciaron con 20 g/L en la concentracin del
sustrato. Aunque el inculo utilizado para cada cintica fue producido en el mismo medio que el
utilizado en la cintica de fermentacin, se observ que en el medio 1 el crecimiento de la
biomasa empiez despus de las 12 horas y que en los medios 2 y 3 a las 6 h de haber
iniciado la cintica ya haba cierto crecimiento.

78

Figura 35. Cinticas de fermentacin de Z. mobilis. B-806 con a)Medio, b)Medio 2 y c)
Medio 3.
a)
b)
c)

79
Al inicio de cada cintica se determin la cantidad de biomasa inoculada en el medio de cultivo,
el medio 1 inici con una concentracin de biomasa de 1.64 g/L y despus de 72 h se
cosecharon 2.84 g/L. La cintica realizada con el medio 2, inici con 1.34 g/L de biomasa y
finaliz a las 72 h con 4.12 g/L de biomasa. El medio tena una concentracin de biomasa de
1.52 g/L y a las 72 h present un crecimiento de 4.39 g/L biomasa. Se debe considerar que el
medio de cultivo contena algunas partculas no disueltas, derivadas de los hidrolizados
obtenidos a partir de la hidrlisis enzimtica, aunque esta solucin se filtr, algunas partculas
quedaron suspendidas en el medio de cultivo, por lo que en la determinacin de biomasa
tambin se podra estar considerando a estas partculas. Se observ que la cantidad de
biomasa no aument significativamente en las 72 h que dur la fermentacin. Esto sucede
porque Z. mobilis produce etanol a partir de glucosa por medio de la ruta metablica de Entner
Doudoroff (ED), por lo tanto produce menos biomasa (comparada con la de otros
microorganismos) y ms carbono es canalizado para la produccin de etanol (Torres y Baratti,
1988). Despus de 36 h de ser iniciada la fermentacin se observ la produccin de etanol, en
los tres casos se obtuvo el mximo rendimiento de etanol a las 72 horas. De acuerdo a
Nellaiah, H. et al. (1988) las cepas de Z. mobilis NRRL-14023, NRRL-14022 y NRRL-4286,
presentan el ms alto rendimiento a las 36 h, casi menos del doble que la cepa Z-806. En la
fermentaciones realizadas por Nellaiah, et al. (1988) se utiliz una concentracin del sustrato
de hasta 171 g/L de azcares produciendo rendimientos de hasta 80 g/L de etanol; observaron
que la adicin de extracto de levadura y otros elementos traza (pantotenato de calcio, sulfato
de amonio y sulfato de magnesio) no perjudicaban significativamente la produccin de etanol,
sin embargo slo se pudo llegar a esta conclusin con la cepa NRRL-4286; dando cabida al
futuro estudio de los efectos producidos en los rendimientos de etanol de cada componente de
los medios de cultivo evaluados en el presente trabajo (Madigan, M., et al, 2003 ). Se sabe que
las peptonas aportan nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, que la adicin de
sales sirve para suplir iones, siendo el KH
2
PO
4
una fuente de fsforo considerado un
macronutriente necesario para la sntesis de cidos nucleidos y fosfolpidos; el extracto de
levadura es una excelente fuente de nutrientes ya que es rico en vitaminas (especialmente
complejo B), la adicin de estos compuestos facilita a Z. mobilis el uso de la enzimas
necesarias para su crecimiento y la produccin de etanol . Comparando la grfica a) de la
figura 35 con las grficas b) y c) de la misma figura, se puede observar que la falta de estos
componentes, afectan tanto al crecimiento como a la produccin de etanol. Sin embargo, el
propsito del presente trabajo fue comprobar que la cepa Z. mobilis NRRL-806 era capaz de
fermentar los azcares obtenidos a partir de la hidrlisis enzimtica de la harina de yuca, lo
cual se observa en las tres cinticas (Figura 35), econmicamente hablando el estudio de la
fermentacin de los hidrolizados de la harina de yuca sin la adicin de ningn compuesto

80
podra ser un proceso rentable. Ya que la omisin de estos compuestos reducira los costos de
produccin.

6.6. Fermentacin en un Biorreactor de 2 L New Brunswick Scientific Bioflo
110 con Zymomonas mobilis NRRL-806.

Se realiz la cintica de fermentacin de los azcares obtenidos en la hidrlisis enzimtica de
la harina de yuca (20 g/L) complementada con: extracto de levadura (10g/L), KH
2
PO
4
(2 g/L) y
peptona de casena (10 g/L); en un Biorreactor de 2 L y se mantuvo controlada la temperatura,
el pH y la agitacin durante toda la cintica.
La fermentacin se realiz a 28 C con un pH de 6.8 y 100 rpm. Adems se aument el tiempo
para verificar si con el tiempo aumentaban los rendimientos en la produccin de etanol. Se
realizaron dos cinticas simultneamente, en una se permiti el intercambio de CO
2
entre el
interior del biorreactor y el medio ambiente, en la otra no se permiti este intercambio.

Los datos de las cinticas se observan en los Cuadros 26 y 27.

Cuadro 26. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en el Medio 3,
Biorreactor con intercambio de CO
2
.
TIEMPO (h) BIOMASA (g/L) [AZCARES
REDUCTORES] (g/L)
ETANOL (g/L)
T0 0 1.47 24.88 0.35
T1 12 1.67 22.86 1.05
T2 18 1.81 23.41 1.10
T3 24 1.93 22.60 2.18
T4 36 1.96 20.52 4.70
T5 42 1.92 18.39 6.19
T6 48 1.93 19.57 6.93
T7 60 2.04 14.86 8.97
T8 66 2.18 16.22 9.04
T9 72 2.44 13.39 11.01
T10 84 2.57 9.85 11.02
T11 90 2.71 7.40 11.08
T12 96 2.73 5.38 11.06
T13 108 2.70 4.06 11.03



81

Cuadro 27. Cintica de la fermentacin de los azcares contenidos en el Medio 3,
Biorreactor sin intercambio de CO
2
.
TIEMPO (h) BIOMASA (g/L) [AZCARES
REDUCTORES] (g/L)
ETANOL (g/L)
T0 0 1.71 23.06 0.36
T1 12 1.76 21.31 0.53
T2 18 1.90 20.84 0.92
T3 24 2.07 21.99 1.70
T4 36 2.34 20.20 1.99
T5 42 2.31 18.62 3.89
T6 48 2.40 19.87 4.47
T7 60 2.41 15.37 4.83
T8 66 2.76 15.37 6.96
T9 72 2.77 15.10 7.88
T10 84 2.75 11.55 9.05
T11 90 2.78 11.09 9.20
T12 96 2.85 6.95 9.91
T13 108 2.84 5.55 9.99


En la fermentacin de los azcares reductores de la hidrlisis enzimtica de la yuca, con
intercambio de oxgeno se obtuvo una concentracin final de etanol de 11.03 g/L. En la
fermentacin llevada a cabo sin el intercambio de oxigeno se observ una concentracin de
9.99 g/L. sta merma, en la concentracin de etanol a las 108 h de la cintica mostrada en el
cuadro 27, pudo ser provocada por los productos de inhibicin de Z. mobilis, el cual no se ve
afectado por el efecto Pasteur (Belach y Senez, 1965), razn por la cual se descarta a el etanol
como producto de inhibicin. Existe otro producto de la fermentacin considerado producto de
inhibicin, el CO
2
. Dado que la mayor cantidad de CO
2
se encuentra disuelto en el caldo de
cultivo en un sistema cerrado, causando la supersaturacin del medio, inhibiendo el uso del
sustrato e influyendo negativamente en el transporte de la membrana celular (Jones y Green
fiel, 1982).
Al igual que (McGhee et al, 1982) la mxima concentracin de etanol, en ambos biorreactores
se obtuvo a los cuatro das de iniciada la cintica. Cazetta et al. (2007) observaron que dentro
de la fermentacin de azcares reductores (obtenidos de melazas) con Z. mobilis ATCC-29191,
el tiempo fue un factor importante y que la produccin de etanol aument entre las 24 y 48 h.

82
En la Figura 36, se presentan las grficas de las cinticas de fermentacin de azcares
generadas a partir de los datos de los Cuadros 26 y 27.

Figura 36. Grfica de la cintica de fermentacin de azcares reductores (hidrolizado de la
harina de yuca) en un Biorreactor de 2L a) con intercambio de oxgeno b) sin intercambio de
oxgeno.

En las cinticas mostradas en la figura anterior, se confirm lo observado por Cazetta et al.
(2007), la produccin de etanol comenz a incrementarse a partir de las 24 h de fermentacin.

a)
b)

83
Las concentraciones de etanol producidas en las fermentaciones llevadas a cabo en los
biorreactores son, por poco, menores a las alcanzadas en los matraces. De acuerdo a Jones y
Doelle, (1991) el pH tambin es un factor del cual depende la produccin de etanol, un pH de
6.5 es ptimo para el crecimiento de las clulas de Z. mobilis mientras que un pH de 4.0 es
ptimo para la produccin de etanol, dadas las condiciones de fermentacin, posiblemente la
disminucin del pH en el caldo de cultivo en los matraces promovi la produccin de etanol,
debido a que en el biorreactor se mantuvo el pH de 6.8 las concentraciones de etanol fueron
menores a las obtenidas en los matraces.




84
7. CONCLUSIONES.

- Se determin la cantidad de almidn de yuca, de camote y de malanga soluble al agua
obtenindose rendimientos de almidn del 20.9% 0.38 y 27.35 0.42 % (w/v) de la
malanga y la yuca, respectivamente. Esto nos indica que estos dos tubrculos pueden
utilizarse como materia prima para la produccin de bioetanol.
- En el tratamiento de hidrlisis cida se determin que las condiciones en donde se
alcanzaron los mximos rendimientos de azcares reductores fueron con una
concentracin de H
2
SO
4
del 5 % (v/v), temperatura de 95 C y 5 h de reaccin. Adems,
mediante el diseo factorial 2
3
se encontraron los factores con efectos significativos en
la hidrlisis cida de la harina de la yuca y malanga. Se observ que la concentracin
del cido y el tiempo son factores que afectan significativamente la hidrlisis cida de la
yuca y la malanga.
- En el tratamiento de la hidrlisis enzimtica se determinaron las condiciones de
temperatura, pH y tiempo que producan los ms altos rendimientos de azcares: a una
temperatura de 73.4 C, pH de 4.08 y 24 h de reaccin. Los factores con efectos
significativos en la hidrlisis enzimtica fueron la temperatura y el pH, siendo el pH un
factor que afecta los rendimientos de azcares de forma negativa. Dentro del Diseo
Experimenta Central 2
3
se obtuvieron puntos mnimos. En la cintica enzimtica de 12 h
el rendimiento de los azcares generados a partir de la harina de malanga fue bajo,
comparado con el rendimiento de la harina de yuca, por lo que en este punto se
descart el uso de la malanga con este pre-tratamiento para ser utilizados
posteriormente.
- Se evidenci, mediante el anlisis con HPLC, que la hidrlisis enzimtica realizada con
la enzimas o- amilasa y amiloglucosidasa, produce en su mayora glucosa, en su
formas isomricas (L y D). En la hidrlisis cida se produce en mayor cantidad un
carbohidrato que posiblemente sea la melezitosa.
- El medio de cultivo con el que se obtuvo la concentracin ms alta de etanol es el
compuesto por azcares reductores 20 g/L, extracto de levadura (10 g/L), KH
2
PO
4
(2
g/L) y peptona de casena (10 g/L), mostrando diferencias significativas con las
concentraciones de etanol obtenidas con los otros medios de cultivo evaluados.
- Se demostr que los azcares generados por la hidrlisis enzimtica de la harina de
yuca pueden ser fermentados por Z. mobilis NRRL-806.
- La aireacin y la agitacin son dos operaciones, que deben ser tomadas en cuenta si se
pretende escalar el proceso de fermentacin.

85
8. PERSPECTIVAS

Dentro del Diseo Experimental se evaluaron tres diferentes factores, considerados
importantes en la hidrlisis cida y enzimtica. A partir del ANOVA se determin si tenan
efectos significativos sobre los rendimientos de los azcares reductores generados. Se
determin su efecto en la reaccin; pero para la optimizacin de ambas reacciones (hidrlisis
cida y enzimtica) se requiere que cada factor se evale a varios niveles.
Tambin se puede evaluar la hidrlisis enzimtica, con las mismas condiciones y con las
enzimas inmovilizadas, esto con la finalidad de estudiar si se pueden obtener rendimientos ms
altos. En cuanto a la fermentacin, se podran mejorar los rendimientos en la produccin de
etanol inmovilizando a Z. mobilis y realizando una fermentacin en lote alimentado. As mismo,
co-inmobilizando a Z. mobilis con Saccharomyces cerevisiae y realizando un diseo
experimental que permita optimizar el proceso de fermentacin.


86
9. REFERENCIAS.

1. Aguilar, R. N., Canizales, L. M. J. 2004. Cintica de la hidrlisis cida de la cascarilla de
cebada. Revista Mexicana de ingeniera Qumica. 03: 257-263.
2. AIE (Agencia Internacional de Energa). 2004. Biofuels for transport: an international
perspective. 9 rue de la Fdration, 75739 Pars Cedex 15, France. Disponible desde
www.iea.org.
3. AIE (Agencia Internacional de Energa). 2006. World Energy Outlook. 9 rue de la
Fdration, 75739 Pars Cedex 15, France. Disponible desde www.iea.org.
4. AIE (Agencia Internacional de Energa). 2007. World Energy Outlook. 9 rue de la
Fdration, 75739 Pars Cedex 15, France. Disponible desde www.iea.org.
5. AIE (Agencia Internacional de Energa). 2008. Key World Energy Statistics. 9 rue de la
Fdration, 75739 Pars Cedex 15, France. Disponible desde www.iea.org.
6. Atlas, R. 2004. Handbook of Microbiological Media. CRC PRESS. Tercera Edicin. 1508.
7. Bai, F. W., Anderson, W. A., Moo-Young, M. 2008. Etanol fermentation Technologies from
sugar and starch feedstocks. Biotecnology Advances. 26: 89-105. Disponible desde
www.elsevier.com.
8. Belaich, I. P., Senez, J. C. 1965. Influence of aeration and of pantothenate on growth
yields of Zymomonas mobilis. J. Bacteriol. 89: 1195.
9. BeMiller, J. N., Whistler, R. L. 1996. Carbohydrates. 157-224. En: Fennema, O. R. Food
Chemistry. Tercera Edicin. New York: Marcel Dekker Inc. 191-203.
10. Berrnfeld, P. 1951. Enzymes of starch degradation and synthesis. Advances in Enzymol.
12: 379-428.
11. Biofields. 2010. Energa Renovable y Sustentable. Disponible desde
http://www.biofields.com.
12. Bradbury, J. H., Holloway, W. D. 1988. Chemistry of tropical root crops: Significance for
nutrition and agriculture in the Pacific. Australian Centre for Internacional Agricultural
Research, Canberra.
13. Carrillo A. 2007. Comercio Internacional de Biocombutibles. Conversus. Marzo. 24-26.
14. Carrizales, V., Senz, D. 1986. Enriquecimiento protenico del bagacillo de caa
mediante cultivo semi-slido de Chaetomium cellulolyticum. Ac. Cient. Vzlana. 37: 580-
586.
15. Cazetta, M. L., Celligoi, J. B., Buzato, J. B., Scarmino, I. S. 2007. Fermentation of
molasses by Zymomonas mobilis: Effects of temperatura and sugar concentration on
ethanol production. Bioresource Technology. 98: 2824-2828.

87
16. CIIEMAD (Centro Interdisciplinario de Investigaciones y Estudios sobre el Medio
Ambiente y Desarrollo). 2007. Maz: alimento, combustible, transgnico y poltica.
Conversus. Abril. 60-64.
17. Cock, J. H. 1985. Cassava, new potencial for a neglected crop . Westview Press.
Disponible desde www.ejbiotechnology.info. Consultado el 03 de Julio del 2009.
18. Comisin Veracruzana de Comercializacin Agropecuaria. 2006. Malanga: Perfil del
Producto. Gobierno del Estado de Veracruz. Mxico.
19. Davis, L., Rogers, P., Pearce, J., Peiris, P. 2006. Evaluation of Zymomonas-based
ethanol production from a hydrolysed waste starch stream. Biomass & Bioenergy. 30:
809-814.
20. DeFranca, F. P., Leite, S. G. F. 1989. Intracellular etanol and cell viability of Zymomonas
mobilis during fed-batch alcoholic fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 5: 43.
21. DiMarco, A. A., Romano, A. H. 1985. D-Glucose transport system of Zymomonas
mobilis. Appl. Environ. Microbiol. 49: 151.
22. Doelle, H. W., et al. 1993a. Zymomonas mobilis Science and Industrial Application.
Critical Reviews in Biotechnology. Australia. Volumen(1): 57-98.
23. Doelle, H. W., Kenedy, L. D., Doelle, M. B. 1991. Scale-up of etanol production from
sugar cane using Zymomonas mobilis. Biotechnol. Letts. 13: 131.
24. Doelle, M. B., Doelle, H. W., Kirk, L., Crittenden, R., Toh H. 1993b. Zymomonas mobilis-
science and industrial application. Critical Reviews in Biotechnology. 13 (1): 57- 98.
25. Durn P. E., Muoz A. J. 2003. Manual del Laboratorio de Biotecnologa Alimentaria.
UPIBI-IPN. Mxico. 122.
26. Falcao de Morales, J. O., Arajo, J. M., Rios. 1981. Fermentaao alcohlica de mosto
de melado em escala semi industrial por Zymomonas mobilis. Rev. Instit. Antibiot. 20: 3-
10.
27. FAO (Organizacin de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentacin). 2008a.
El estado mundial de la agricultura y la alimentacin. Biocombustibles: perspectivas,
riesgos y oportunidades. Viale delle Terme di Caracalla 00153 Roma, Italia. Disponible
desde www.fao.org. ISSN 0251-1371.
28. FAO (Organizacin de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentacin). 2008b.
Biofuels: back to the future? Fritsche, U. R. El estado mundial de la agricultura y la
alimentaci. Viale delle Terme di Caracalla 00153 Roma, Italia. Disponible desde
www.fao.org.
29. Ferrer, J. R., Pez, L. Moreno, A., Chandker, C., Mrmol, Z., Sandoval L. 2002. Cintica
de la hidrlisis cida de bagacillo de caa de azcar. Rev. Fac. Agron. 19: 23-33.
30. GBEP (Asociacin Mundial de la Bioenerga). 2007. A Review of the current state of
bioenergy develops in G8+5 countries. Roma, Secretaria de la GBEP, FAO.

88
31. Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., Chauhan, B. 2003. Microbial o-
amylases: a biotechnological perspective. Elsevier Science. Volumen(38): 1599-1616.
Disponible desde www.sciencedirect.com.
32. International Food Policy Research Institute (IFPRI). 2010. 2033 K Street, N.W.
Washington, D.C. 20006, U.S.A. Disponible desde http://www.ifpri.org.
33. Instituto de la Vigilancia Mundial. 2006. Biofuels for transportation: global potencial and
implications for sustainable agricultura and energy in the 21
st
century. Washington, DC.
34. Jones, C. W., Doelle, H. W. 1991. Kinetic control of ethanol production by Zymomonas
mobilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 4-9.
35. Jones, R. P., Greenfield, P. F. 1982. Effect of carbon dioxide on yeast growth and
fermentation. Enzyme Microbiol. Technol. 4: 210.
36. Kerr, R. W. 1950. Chemistry and industry of starch. Segunda edicin. New York:
Academic Press, Inc. 472.
37. Kim, K., Hamdy, M. K. 1985. Acid hydrolysis of sweet potato for etanol production.
Biotechnology and Bioengineering. 27(3): 316-320. Disponible desde
www3.interscience.wiley.com.
38. Kim, S., Dale, B. 2004. Global potencial bioethanol production from wasted crops and
crop residues. Biomasa Bioenergy. 26940: 361-375.
39. Kunamneni, A., Singh, S. 2005. Response surface of enzymatic hydrolysis of maize.
Disponible desde www.elsevier.com.
40. Linares, E., R. Bye, D. Rosa-Ramrez y R. Pereda-Miranda. 2008. El camote.
CONABIO. Biodiversitas. 81: 11-15.
41. Liu, Q., Weber, E., Currie V., Yada, R. 2003. Physicochemiical properties of starches
during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51: 213-221. Disponible desde
www.elsevier.com.
42. Lough, W. J., Warner, I. W. 1995. High Performance Liquid Chromatography:
Fundamental Principles and Practice. Primera Edicin. London, Great Britain. Blackie
Academic & Professional Chapman. 270 p. ISNB 0751400769.
43. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. 2003. BROCK: Biologa de los microorganismos.
Pearson Education. Dcima edicin. Madrid, Espaa. 103-108.
44. Magee, R. J., Kosaric, N. 1985. Bioconversion of hemicellulosics. Adv. Biochem. Eng.
32: 61-93.
45. Masera Cerutti, O., et al. 2005. LA BIOENERGIA EN MEXICO. Un catalizador del
desarrollo sustentable. REMBIO. Mxico. 119 p.
46. McGhee, J. E., Julian, G. S., Detroy, R. W., Bothast, R. J. 1982. Etanol production by
immobilized Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum and Zymomonas
mobilis. Biotechnology and Bioengineering. 24: 1155- 1163.

89
47. Mera, I., Hoyos, J. L., Carrera, J., Forero, C. L., Velasco, R. 2003. Caracterizacin
enzimtica de alfa-amilasa y glucoamilasa en la hidrlisis de almidn de yuca (Manihot
esculenta). Facultad de Ciencias Agropecuarias. 1 (1): 83-88.
48. Meyer, K. H., Gibbons, G. C. 1951. The present status of starch chemistry. Advances in
Enzymol. 12: 341-378.
49. Michaud, C. 2003. Intecambio inico: Oxidacin-Oxidantes, Edad y Resinas
Suavizantes. Agua Latinoamrica. 4 (3): 34-37.
50. Montan, D., Salvad, J., Farriol, X. 1994. Chemical analysis of partially hydrolyzed
lignocellulosic biomass. Afinidad. 51:109.
51. Myrbck, K., Neumler, G. 1950. Amylases and the hydrolysis of starch and glycogen.
653-724. En: Sumner, J. B., Myrbck, K. The enzymes. Primera edicin. New York:
Academic Press, Inc.
52. Naylor, R., Liske, A. J., Burke, M. B., Falcon, W. P., Gaskell, J. C., Rozelle, S. D.,
Cassman, K. G. 2007. The ripple effect: biofuels, food security, and the environment.
Environment. 49 (9): 31-43.
53. Nellaiah, H., Karunakaran, T. J., Gunasekaran, P. 1988. Etanol Fermentation of
Cassava Starch by Zymomonas mobilis NRRL B-4286. Biomass. 15: 201-207.
54. Neves, M. A., Shimizu, N., Kimura, T., Shiiba, K. 2007. Kinetics of bioethanol production
from wheat milling by-products. Journal of Food Process Engineering. 30: 338-356.
55. Nigam, P., Singh, D. 1995. Enzyme and microbial system involved in starch processing.
Enzyme Microb. Technol. 17: 770-778.
56. Panda, S., Parmanick, M., Ray R. C. 2007. Lactic acid fermentation of sweet potato
(Ipomea batatas) into pickles. Journal of Food Processing and Presrvation. 31: 83-101.
57. Park, C. S., Baratti, J. 1991. Batch fermentation kinetics of sugar beet molasses by
Zymomonas mobilis. Biotechnol. Bioeng. 38: 304.
58. Park, C. S., Baratti, J. 1991. Comparison of etanol production by Zymomonas mobilis on
sugar beet substrates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 283.
59. Petrobras. 2007. Biocombustibles. Comunicacin Institucional. Brasil.
60. Pramod, K. B., Margaritis, A., Kirk, L. 1985. Kinetics of etanol production by immobilized
cells of Zymomonas mobilis at varying D-glucose concentrations. Enzyme Microb.
Technol. 7: 462- 464.
61. Prasad, S., Singh, A., Joshi, H. C. 2007. Ethanol as an alternative fuel from agricultural,
industrial and urban residues. Resources, Conservation and Recycling. 50: 1-39.
62. Rajagopal, D., Sexton, S. E., Roland-Host, D., Zilberman, D. 2007. Challenge of biofuel:
filling the tank without emptying the stomach?. Environmental Research Letters. 2: 30.

90
63. Ridley, S. C., Lim, M., Heenan S., Bremen, P. 2005. Evaluation of sweet potato cultivars
and healting methods for control of maltose production, viscosity and sensory quality.
Journal of Food Quality. 28: 191-204.
64. Rogers, P. L., Lee, K. J., Lee, J. H., Skotnicki, M. L. 1982. Etanol production by
Zymomonas mobilis. Appl. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 23: 37.
65. Saeman, J. F., Bulb, J. L., Harris, E. E. 1945. Quantitative saccharification of wood and
cellulose. Industrial and Engineering Chemistry. 17:1-35.
66. SAGARPA (Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentacin). 2008. Monografas. Disponible desde www.sagarpa.gob.mx.
67. Scott, G. J., Rosegrant, M. W. and Ringler, M. W. 2000. Roots and tubers for the 21
st

century: trends, projections and policy options. Food, Agriculture and Environment
Discussion Paper 31. International Food Policy Research Institute.
68. SEMARNAT (Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales), INE (Instituto
Nacional de Ecologa). 2008. Anlisis integrado de las tecnologas, el ciclo de la vida y
la sustentabilidad de las opciones y escenarios para el aprovechamiento de la
bioenerga en Mxico. Mxico. Disponible desde www.semarnat.gob.mx.
69. Sprenger, G. A. 1996. Carbohydrate metabolism in Zymomonas mobilis: a catabolic
higway with some scenic routes. FEMS Microbiol Lett. 145 (1): 301-307.
70. Supanwong, K., Ohta, K., Hayashida, S. 1983. Environmental effects of etanol tolerante
of Zymomonas mobilis. Microbial Utilization of Renewable Resources. 3: 122.
71. Swings, J., De Ley, J. 1977. The Biology of Zymomonas. Bacteriological Reviews. 41
(1): 1-46. Disponible desde mmbr.asm.org.
72. Timoshin, A. A., Rapoport, A. I., Beker, M. E. 1989. Effect of temperatura on the state of
lipids in the external memebrane of Zymomonas mobilis during growth. Mikrobiologiya.
58: 576.
73. Torres, E. F., Baratti, J. 1988. Ethanol production from wheat flour by Zymomonas
mobilis . J. Ferment. Technol. 66: 167-172.
74. Ullal, V., Mutharasan, R., Grossmann, E. 1984. New insights into high solids acid
hydrolysis of biomass. Biotechnol. and Bioeng. Symp. 14: 69-93.
75. Underkofler, L. A., Barton, R. R., Rennert, S. S. 1958. Production of Microbial Enzymes
and their Applications. Microbiological Process Report. 6: 212-275.
76. Urbaneja, G., Ferrer, J. R., Pez, G., Arenas de Moreno, L., Colina, G., Sandoval, L.
1997. Hidrlisis y caracterizacin de carbohidratos de la pulpa de caf. Rev. Fac. Agron.
14: 265-275.
77. Westby, A. 2002. Cassava Utilization, Storage and Small-scale Processing. CAB
Internacional. Cassava: Biology, Production and Utilization. University of Greenwich, UK.
281-300.

91
78. Wheals, A. E., Basso, L. C., Alves, D. M., Amorim, H. V. 1999. Fuel ethanol after 25
years. Elsevier Science. Volumen(17): 482-487.
79. Yanase, H., Maeda, M., Hagiwara, E., Yagi, H., Taniguchi, K., Okamoto, K. 2002.
Identification of functionally important amino acid residues in Zymomonas mobilis
levansucrase. J. Biochem. 132: 565-572.
80. Yu, S., Tao, J. 2008. Life cycle simulation-based economic and risk assessment of
biomass-based fuel etanol (BFE) projects in different feedstock planning areas. Energy.
33: 375-384.
81. Zaldivar, J., Roca, C., Le Foll, C., Hahn-Hgerdal, B., Olsson, L. 2005. Ethanolic
frementation of acid pre-treated starch industry effluents by recombinant
Saccharomyces cerevisiae strains. Elsevier Science. 96: 1670-1676. Disponible desde
www.sciencedirect.com.

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Ni siquiera un dios puede cambiar en derrota
la victoria de quien se ha vencido a s mismo
BUDA