1.

TEMA

2. OBJETIVOS Identificar las bacterias presentes en una muestra desconocida, siguiendo un algoritmo de trabajo apropiado para el aislamiento de las bacterias y el posterior reconociendo con las pruebas bioqumicas realizadas. 3. FUNDAMENTO TERICO TCNICAS DE SIEMBRE EN CAJAS PETRI Siembre en cajas de petri por la tcnica de estriacin Es un buen mtodo para el aislamiento de colonias (obtencin de colonias aisladas); mediante esta tcnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inculo. Para su realizacin: (I) se toma la caja de petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por el flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo es un rea perifrica de la capa haciendo movimientos circulares para homogenizar el inculo. (II) El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no daarlo); a continuacin se realiza una estra partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que en cada seccin de la caja, las estras quedan trazadas con mayor separacin. (III) Repita el paso II, por tres veces( algunos autores reportan solo dos) , recordando flamear y enfriar el asa cada vez que culmine una estra y solo tocar con el asa la estra inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla.

(I)

(II)

(III)

Siembra en cajas de Petri por la Tcnica de siembra en cuadrantes El objetivo de esa tcnica, es el de diluir el inculo a medida que se realizan estras en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriogrfico por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inculo), Las cajas as sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria. Con esta tcnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (ltima estra realizada), se encuentren colonias de la bacteria aislada.

Siembras en cajas de Petri por la tcnica de siembra masiva.

Este mtodo es muy utilizado para obtener un gran nmero de microorganismos (incremento de inculo), en la superficie de un agar. Esta tcnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa.

TCNICAS DE SIEMBRE EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS La siembre de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante del aire pude superar en crecimiento al microorganismo de inters, por lo tanto deben tener las siguientes precauciones: Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las en las paredes extremas del tubo y no en la boca de este. Los tampones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el tubo, sostenindolos entre el dedo meique, el anular y el dedo del corazn. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algn lugar otro lugar. Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin. Esterilizar el asa adecuadamente (toda la Procin que entra en contacto con el medio de cultivo). Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo. Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo. Siempre trabaje con material abierto, en cmara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen. En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as como, utilice asa totalmente rectas.

Siembra en tubos por estra simple Se realiza en un tubo con medio slido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estras. (Fig. A). Siembra mixta en tubos Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con un asa recta y luego haciendo una siembra en estra sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando las estras; de tal manera que, con el asa cargada se realiza los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo. (Fig. B). Siembra en tubos por picadura Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta e tubos con medios slidos y semislidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo. (Fig. C y D).

Siembra en tubo en medio lquido Para transferir material a partir de un medio lquido o slido a otro lquido, puede usarse el asa bacteriolgica (de argolla), o algunos casos, pipetas estriles o hisopos. Si usted utiliza asa bacteriolgicas, inocule el microorganismo en le medio lquido hacindola rotar del mango. (Fig. E).

METODOS DE DESINFECCION La desinfeccin es uno de los procedimientos ms antiguos en el medio hospitalario que fuera utilizada en un primer momento para eliminar microorganismos del ambiente e higienizar las manos. Existen dos mtodos de desinfeccin: los fsicos y los qumicos. Mtodos Fsicos. A. Pasteurizacin: Utilizado originalmente por el francs Louis Pasteur. Con este proceso se realiza la DAN y por el cual el agua es llevada a 77 C de temperatura durante aproximadamente treinta minutos. As destruye todos los microorganismos excepto las esporas bacterianas. En nuestro medio no es utilizado. B. Hervido: Este mtodo utiliza el agua hirviendo a temperaturas muy altas para lograr la desinfeccin. Por ejemplo, para una DAN, se hierven los instrumentos en un recipiente con tapa de 5 a 20 minutos contabilizando el tiempo desde que el agua rompe el hervor. Los objetos sern cubiertos por completo con el agua durante el hervido y no se aadir ningn otro mientras est hirviendo. El fuego ser suave, ya que el fuego alto hace rebotar los objetos, disminuye el

nivel de agua y consume ms gas. Se recomienda usar tiempos ms prolongados para lugares de gran altura sobre el nivel del mar. Se seca al aire o con una toalla esterilizada antes de volver a utilizar los materiales o almacenarlos. Este mtodo no se utiliza en el medio hospitalario. C. Desinfectadores de agua o a chorro de agua: Este equipo se utiliza para limpiar y desinfectar los objetos que se utilizan para atender al paciente en la sala. Los desinfectadores a chorro de agua se utilizan para vaciar, limpiar y desinfectar objetos tales como chatas, papagayos y orinales usando un proceso que elimina el lavado manual y en algunos caos utilizando una cantidad mnima de germicidas qumicos. Funcionan a temperaturas mayores de 90 C. MTODOS QUMICOS LQUIDOS. Es el ms utilizado en nuestro sistema hospitalario y existen mltiples agentes germicidas en forma lquida. Los principales desinfectantes utilizados en el mbito hospitalario son: Orthophthaldehdo, glutaraldehdo, cloro y compuestos clorinados, formaldehdo, perxido de hidrgeno, cido peractico, fenoles y amonio cuaternario. Es importante mencionar al respecto que no todos los desinfectantes estn disponibles en nuestro medio. METODOS DE ESTERILIZACIN

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae es la especie de mayor relevancia clnica dentro del gnero bacteriano Klebsiella, compuesto por bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae, que desempean un importante papel como causa de las enfermedades infecciosas oportunistas. El gnero fue llamado as en honor a Edwin Klebs, un microbilogo alemn de finales del siglo XIX. El bacilo ahora conocido como Klebsiella pneumoniae tambin fue descrito por Karl Friedlnder, y durante muchos aos se conoci como el bacilo de Friedlnder. Son bacterias gram negativas , la asimilacin y la fermentacin de la lactosa se puede observar en el Agar MacConkey donde las colonias son de color rosado y en el medio Kliger o TSI donde son cido/cido, es decir fermentador de la lactosa ms produccin de gas; y en la fermentacin acetnica o prueba de Voges Proskauer son positivos. Por ltimo, sus condiciones ptimas de cultivo son en agar nutritivo a 37 C, ph de 7.0, presin osmtica de 1 atm. Cuadros Clnicos Klebsiella pneumoniae, dentro de este gnero bacteriano, est implicada principalmente en infecciones nosocomiales.1 Es el agente causal de infecciones del tracto urinario, neumonas, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirrgica. Son especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, neonatos, y pacientes con EPOC, diabetes mellitus o alcohlicos. A da de hoy tambin existe una fuerte teora que la relaciona con la espondilitis anquilosante.2 Causa alrededor del 1% de las neumonas bacterianas y puede causar condensacin hemorrgica extensa del pulmn. Adems, en ocasiones provoca infeccin del aparato urinario y bacteriemia a partir de lesiones focales en pacientes debilitados que puede terminar con la vida del paciente. Algunas de las complicaciones ms frecuentes son el absceso pulmonar y el empiema. Tambin suele encontrarse en las infecciones de la toracotoma para realizacin de by pass o revascularizacin coronaria. Suele responder en estos casos al imipenem, 1 g IV cada 6 horas por 21 das + ciprofloxacina, 400 mg IV cada 12 h por 21 das,

acompaado todo esto de enrgica cura diaria realizada por el cirujano cardiovascular y colocacin de Intrasite Gel (hidrogel de carboximetilcelulosa) cada 2 o 3 das dentro del lecho de la herida cuando ya no hay ms secrecin. El cierre por segunda intencin es la regla. Diagnstico El diagnstico comienza a partir de la clnica; en los casos de neumona, es especialmente til el estudio radiogrfico. El diagnstico definitivo lo obtenemos a partir del cultivo de muestras obtenidas de las mucosas del tracto respiratorio superior. Tratamiento No se recomienda el uso de penicilinas, cefalosporinas (todas las generaciones), monobactames y carbapenemes independientemente de la sensibilidad in vitro. Opciones de tratamiento (requieren demostrar sensibilidad): agentes no betalactamicos. (Segun: SERVICIO ANTIMICROBIANOS - INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS (INEI) Buenos Aires, Argentina). Se recomienda el uso de aminoglucsidos como la gentamicina o amikacina Salmonella

Salmonella es un gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. No tienen metabolismo fermentativos. Es un agente productor de zoonosis de distribucin universal. Se transmite por contacto directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el procesador de alimentos o en el hogar, tambin por va sexual. Algunas salmonellas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo cual puede ser importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y alimentos.

Microbiologa Salmonella crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3 milmetros. En laboratorios de microbiologa clnica se asla con medios selectivos, Selenito, Hektoen, SS o XLD para inhibir el crecimiento de otras bacterias patgenas y de la flora intestinal saprfita. Tienen los siguientes antgenos: Somtico O, del lipopolisacrido en la pared celular, termoestable y es la base de la clasificacin en subgrupos. Flagelar H, de la protena flagelina, termolbil, es la base de la clasificacin de especies. Envoltura Vi, termolbil, responsable de la virulencia de varias especies patognicas. Patogenia Produce salmonelosis con un perodo de incubacin de entre 5 horas y 5 das, diarrea y dolor abdominal. A travs de las heces (excremento) del enfermo se elimina un gran nmero de esta bacteria y se observa fiebre entrica con un periodo de incubacin de 7 a 28 das, causante de dolor de cabeza, fiebre, dolor abdominal y diarrea, erupcin mculo-papulosa en pecho y espalda. Los enfermos presentan un perodo de convalecencia entre 1 y 8 semanas y las personas curadas eliminan Salmonella. Tambin puede ocasionar fiebres entricas o infeccin intestinal por intoxicacin con algunos alimentos. 4. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales Balanza (0,1g) Probeta Placas de Vidrio Caja petri de Plstico 3 Erlenmeyer 250ml Pipeta graduada de 1mL Pipeta graduada de 10mL Pera de Succin Asa de Inoculacin Aguja de inoculacin Tubos de ensayo Reactivos Medio de cultivo MAC Medio de cultivo EMB Medio de cultivo TSA Medio de cultivo TSB Medio de cultivo S.S Medio de cultivo OF Medio de Cultivo TSI Medio de Cultivo SC Medio de cultivo RM-VP Medio de cultico SIM Manitol Cristal violeta Lugol Alcohol-Acetona Safranina Agua estril

5. MTODO MUESTRA

Aislamiento (TSA) Colonias Pequeas Colonias Grandes

Tincin de Gram Bacilos gram (-) Enriquecimiento (TSB) Aislamiento (TSA) Cultivo en Mac Conkey Lac (+) Cultivo en EMB Agar

Tincin de Gram

Enriquecimiento (TSB)

Aislamiento (TSA)

Lac (-) Cultivo en SS Agar

Colonias mucosas confluentes, con centros negros

Colonias incoloras con centros negros

Posible Klebsiella Pruebas Bioqumicas

Posible Salmonella

TSI OF-manitol SIM Voges Proskauer Rojo de Metilo Citrato Oxidasa

A/A, no productora de H2S A-A (-), inmvil (-) (+) (+) (-) 9

TSI Oxidasa SIM Voges Proskauer Rojo de Metilo Citrato

K/A, productora de H2S (-) +, mvil, productora de H2S (-) (+) (+)

6. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Caractersticas de las colonias del microorganismo MEDIO DE CULTIVO EMB (Eosina Azul de metileno) Caractersticas morfolgicas colonias Forma MacConkey Agar

Redondas, borde entero

Color Tamao Sustancia Inhibidora del crecimiento Prueba bioqumica estudiada

Transparentes, con centros negros Pequeas Eosina y azul de metileno Consumo de azcares lactosa y sacarosa.

Redondas, presentan elevacin, borde entero Transparentes y fuscias Pequeas y medianas Sales Biliares y cristal violeta Degradacin de lactosa.

Prueba Coloracin de gram Oxidasa Fermentacin de la glucosa Fermentacin de la lactosa Indol Rojo de metilo Voges proskauer Utilizacin de citrato Produccin de gas sulfhdrico Movilidad

Klebsiella Resultado

Salmonella

Medio de cultivo utilizado

(-), bacilos (-) (+), (-) (-) (+) (-) (+) (-) (-)

(-), bacilos (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+)

Ninguno Ninguno TSI TSI, MAC SIM RM-VP RM-VP Simmons Citrato TSI,SIM SIM

Klebsiella pneumoniae: SIM VP RM SC

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OF-Manitol Tubo abierto Tubo cerrado

Salmonella spp: SIM VP RM SC

En el medio de cultivo Mac conkey, se observ el crecimiento de dos tipos de colonias, este resultado nos indica que a pesar de haber dos tipos diferentes de bacterias ambas son bacilos gram negativos, unas son fucsias y otras transparentes, esto nos indica que las colonias fucsias son LAC positivas y las transparentes son LAC negativas; las colonias LAC positivas son violetas debido a que estas fermentan la lactosa produciendo acidez en el medio disminuyendo el pH bajo a 6.8, provocando el viraje del indicador, el otro tipo de colonias LAC negativas son transparentes debido a que utilizan la peptona del medio produciendo amonio, que aumenta el pH del medio y de igual manera provoca el viraje del indicador.

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En el medio de cultivo EMB agar, se observaron colonias transparentes con centros negros, esto nos indica que la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa; la ausencia de Brillo metlico en las colonias descarta que la bacteria sea una E. coli y nos permite identificar que posiblemente es una Klebsiella. Mediante la utilizacin del microscopio ambas bacteria se observ como bacilos gram negativos de color rojo, este resultado negativo se debe a que la pared de celular de este tipo de bacterias gram negativas contiene una pequea cantidad de peptidoglicano, incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y por lo tanto la clula se decolora; posteriormente al agregar el colorante de contraste se torna de color rojo caracterstico de una tincin gram negativa. La prueba bioqumica de la oxidasa dio un resultado negativo para ambas bacterias, esto se debe a que tanto la Salmonella como la Klebsiella no presenta en sus mitocondrias el sistema citocromoxidasa; es decir no posee la enzima oxidasa, capaz de oxidar rpidamente al colorante redox, y por lo tanto no hay coloracin violeta, este resultado negativo adems nos permite indicar que amabas bacterias pertenecen a la familia de las Enterobacterias. En el medio de cultivo TSI se realiz la prueba bioqumica de la fermentacin de la glucosa, obtenindose un resultado K/A, esto nos indica que la Salmonella solo fermenta la glucosa, adems en este medio se observ un precipitado negro por lo tanto la bacteria adems es capaz de producir Gas sulfhdrico, que al reaccionar con el hierro presente en el medio forma el precipitado de sulfuro de hierro. En el medio de cultivo TSI se realiz la prueba bioqumica de la fermentacin de la glucosa, obtenindose un resultado A/A, esto nos indica que la Klebsiella es capaz de fermentar los tres azcares del medio, adems en este medio no se observ un precipitado negro; es decir la bacteria no es capaz de producir Gas sulfhdrico, que reaccionaria con el hierro presente en el medio formando el precipitado de sulfuro de hierro. La prueba bioqumica del indol fue negativa al agregar el reactivo de Kovacs a dos medios de cultivo SIM despus de haber sido incubado por un dia, este resultado se debe a que tanto la Salmonella como la Klebsiella, no contiene la enzima triptofanasa por lo cual no es capaz de metabolizar el triptfano produciendo indol. Para la prueba bioqumica del Rojo de Metilo se la realiz para las dos bacterias y se agreg el indicador Rojo de Metilo donde permaneci el color rojo, lo que comprueba que tanto la Salmonella como la Klebsiella es capaz de metabolizar la glucosa, originando productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico); este resultado positivo anula inmediatamente a la prueba bioqumica de Voges Proskauer, que sera positivo si los productos finales de la fermentacin de la glucosa fueran neutros. Se realiz la prueba bioqumica de la utilizacin de Citrato tanto para Salmonella como para la Klebsiella; dando en ambos casos resultados positivos, este resultado indica que amabas bacterias son capaces de utilizar como nica fuente de carbono al citrato, donde dichas bacterias presentan la enzima citrato permeasa; utiliza tambin como nica fuente de nitrgeno al fosfato de amonio presente en el medio de cultivo

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utilizado, al utilizar el fosfato de amonio genera un medio alcalino el cual es evidenciado por el viraje del indicador de un color verde a azul. La prueba bioqumica de OF-manitol dio un resultado A-A, este resultado nos indica que la bacteria es capaz de crecer en aerobiosis como anaerobiosis, por lo tanto podemos decir que la bacteria Klebsiella es anaerobia facultativa, y que puede fermentar u oxidar azcares es este caso al manitol.

7. CONCLUSIONES Con los datos obtenidos experimental las bacterias identificadas son Klepsiella pneumoniae y Salmonella spp. La bacteria Klebsiella pneumoniae es una bacteria anaerobia facultativa, bacilo gram negativo, no productora de Gas Sulfihdrico, indol negativo, fermenta la glucosa, fermenta el manitol, pero no fermenta la lactosa por lo tanto en una LAC (-), en inmvil, no contiene en sus mitocondrias el sistema citocromo oxidasa es decir la prueba de la oxidasa es negativa, utiliza el citrato como nica fuente de carbono. La bacteria Salmonella de acuerdo a los resultados obtenidos, un bacilo gram negativo, mvil y productora de gas sulfhdrico carente del sistema citocromoxidasa en sus mitocondria, fermenta la glucosa, carece de la enzima triptofanasa por lo tanto la da prueba de indol negativo, es capaz de metabolizar la glucosa originando productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico) ,resulta negativo para la prueba de Voges Proskauer y utiliza al citrato como nica fuente de carbono.

8. RECOMENDACIONES Se recomiendo que necesariamente tanto el rea de trabajo como los materiales e implemento para desempear la prctica estece estriles, para que no haya contaminaciones, por parte de hongos u otro tipo de microorganismos; que nos dara resultados errneos. Este proyecto se favorecera si hay pava capacitacin autnoma es decir por parte de estudiante, acerca de tcnicas de asepsia, esterilizacin y sobre todo de siembra en medios; que de esta forma permitir obtener una mejor entendimiento de los resultados obtenidos. Para obtener los resultados esperados se debe trabajar de forma ordenada, es decir jerrquicamente, primeramente cultivar en medios de enriquecimiento, posteriormente aislar; una vez aislados podemos hacer tinciones de Gram e ir reconociendo a la vez como son las colonias e irlas comparando bibliogrficamente, y finalmente identificar utilizando las pruebas bioqumicas que permitir identificar ms detalladamente las caractersticas como la presencia o no de ciertas enzimas.

9. BIBLIOGRAFA ROJAS, Alberto., CONCEPTOS Y PRCTICA DE MICROBIOLOGA GENERAL, 2011, Pgs.(50-53).

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BORJA, Ana., MANUAL DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN HOSPITALARIA, 2002, Pgs.(33-41, 57-73).

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