E SAYO CIDO CLAVUL ICO: SU EVOLUCI E IMPACTO

Nathalia Andrea Gmez Grimaldos

Aspirante al programa de Maestra en Biotecnologa de la U de A, rea bioprocesos. Los compuestos antibiticos utilizados para el tratamiento de enfermedades humanas causadas por bacterias, como la tuberculosis, no se lograron aislar e identificar sino hasta el siglo XX, cuyo uso remoto lo realizaron los antiguos chinos, hace ms de 2.500 aos. Muchas otras culturas antiguas, incluyendo los antiguos egipcios y griegos usaban moho y ciertas plantas para el tratamiento de infecciones, fenmeno conocido como antibiosis. El principio de la antibiosis fue descrito en 1877 cuando Louis Pasteur y Robert Koch observaron que un bacilo en el aire poda inhibir el crecimiento de la bacteria Bacillus anthracis. La era de la produccin de antibiticos se origin en el descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1929, quien present la primera demostracin de un compuesto antimicrobiano producido naturalmente. La necesidad del uso constante de los antibiticos se dio en la segunda guerra mundial, lo que indujo a estudiar e investigar cmo desarrollarlos (Alan Scragg, 2004). Los antibiticos naturales son en su mayora metabolitos secundarios, generalmente producidos a bajas velocidades de crecimiento o cuando su crecimiento ha cesado. Su produccin a menudo se inicia por la limitacin de un nutriente en su medio de cultivo. Los metabolitos secundarios son estructuralmente diversos e inusuales, generalmente producidos en mezclas con otras sustancias de la misma familia qumica. Hoy se conocen ms de 5000 clases de antibiticos, de los cuales la mayor proporcin se han aislado de los actinomicetos (streptomyces) (Madigan M y Martinko J, 2005). Estos antibiticos ahora son la base de una gran industria que fue quizs el comienzo de la biotecnologa moderna. En la actualidad la definicin de antibitico incluye a los antimicrobianos sintticos y quimioteraputicos antimicrobianos como las quinolonas, sulfamidas y otros agentes antimicrobianos derivados de productos naturales y aquellos con propiedades antibiticas descubiertos empricamente. Las cepas bacterianas y microbianas se vuelven resistentes a los efectos de los antibiticos, lo cual cre la necesidad de buscar sustancias que sean capaces de inhibir estas enzimas inactivadoras de antibiticos. En 1973 fue detectado un grupo de sustancias con potente accin inhibitoria sobre las -lactamasas, las cuales se obtuvieron a partir de cepas de Streptomyces clavuligerus y se denominaron clavams, que tiene una estructura -lactmica con escasa actividad antibacteriana pero con un amplio espectro antienzimtico. La S. clavuligerus es una especie de bacterias Gram-positivas que producen el cido Clavulnico (CA), tres o cuatro aos demoraron en determinar su estructura, propiedades microbiolgicas y bioqumicas (Browm y Cols, 1976). El S. clavuligerus produce ms de 20 metabolitos secundarios, incluyendo a muchos antibiticos -lactamicos, apareciendo el primero y ms potente inhibidor de enzimas -lactamasas, el CA. Para llevar a cabo un proceso de produccin por fermentacin industrial los requerimientos especficos nutricionales del microorganismo usado, son complejos y varan segn el microorganismo en cuestin (bacterias, mohos y levaduras, normalmente). Los microorganismos obtienen la energa para soportar la biosntesis y crecimiento desde los nutrientes en su ambiente. Adems de una fuente de energa, el organismo requiere de una fuente material la cual debe suplir todos los elementos necesarios para la biosntesis de la materia celular, productos en operacin celular, mantenimiento y reproduccin. Algunos microorganismos utilizan elementos en forma de compuestos simples, otros requieren de compuestos ms complejos, usualmente relacionados a la forma en la cual ellos se incorporaran finalmente en la materia celular (Alan Scragg, 2004). En el desarrollo del inoculo, las caractersticas fisiolgicas y genticas de las cepas juegan un papel muy importante en el mejoramiento de la productividad. Se ha demostrado que el perfil de la produccin del CA por S. clavuligerus depende fuertemente de la actividad del inoculo y de su calidad depende el buen desempeo del S. clavuligerus en los procesos de fermentacin. Los criterios conocidos como necesarios para obtener un buen inoculo son: El inoculo debe tener un estado activo y saludable para minimizar el tiempo de la fase de fermentacin. El tamao ptimo del inoculo debe ser de 3-10% de el volumen medio El inoculo debe estar en una forma morfolgica adecuada.

Este debe ser libre de contaminacin La biomasa inoculada debe tener la capacidad de retener la formacin del producto de inters.

El S. clavuligerus, es el organismo de mayor importancia industrial dentro de los Streptomycetos y hongos, el cual tiene una esporulacin asexual, esto hace que sea una prctica comn usar una suspensin de esporas como semilla durante la primera etapa del programa de desarrollo del inoculo. Industrialmente se requieren diferentes pasos en el cultivo vegetativo para producir grandes volmenes de medio precultivo, en el cual se inocula el recipiente de produccin. El mayor problema en el uso de cultivos vegetativos es la dificultad de obtener un precultivo estndar uniforme debido a la diferenciacin morfolgica asociada con el crecimiento de este tipo de microorganismo. El mejoramiento de las cepas de S. clavuligerus es una parte esencial del desarrollo del proceso para productos microbianos de fermentacin, haciendo posible la reduccin de costos para el desarrollo de cepas con un incremento en la productividad (Medidas como la concentracin o el rendimiento total). Los programas de rutina para mejorar la cepa tienen buenos rendimientos con alta produccin de mutantes para producir el antibitico (Rekha SS y colaboradores, 2008). Los procesos de fermentacin clsica comercial para la produccin de productos de metabolitos secundarios pueden ser subdivididos en tres fases y el proceso del CA no es la excepcin: La primera etapa es el desarrollo de un inoculo y ocurre secuencialmente en una serie de recipientes de reaccin mezclados. La segunda fase usualmente toma lugar en una reaccin simple y es la etapa en la cual los antibiticos son sintetizados microbiologicamente y la tercera fase es la recuperacin del producto de inters. El CA es el antibitico -lactamico mas importante y fue descubierto independientemente por Brown y colaboradores (1976) y Napier y colaboradores (1981) como un producto del organismo Streptomyces clavuligerus. El S. clavuligerus haba sido aislado en 1971 en un programa de investigacin para producir compuestos -lactamicos con mejor resistencia a las enzimas -lactamasas. El CA, es un poderoso inhibidor natural de la -lactamasa, que es una enzima responsable de la resistencia a los antibioticos -lactamicos como penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, entre otras; esta enzima es producida por algunas bacterias, que hacen del CA el mejor antibitico -lactamico producido por el organismo Streptomyces Clavuligerus, con amplio espectro para atacar bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Rekha SS y colaboradores, 2008). El CA tiene una baja actividad antimicrobiana intrinseca, pero su principal funcin es la de inhibidor de amplio espectro de la -lactamasa segregada por las bacterias Gram positivas y Gram negativas, haciendo que la accin del antibitico sea sumamente efectiva, lo que restaura la actividad antimicrobiana de antibiticos -lactamicos. El cido clavulnico (clavams) muestra una dbil actividad antibitica, por lo cual se usa en combinacin con las penicilinas para tratar a los organismos productores de B-lactamasa (Fevang L, 1996). Existen tres factores que influyen en la eficiencia de un inhibidor: la velocidad de inactivacin de la enzima, el nmero de molculas del inhibidor que se hidrolizan hasta inactivar la enzima, y la estabilidad de la enzima inactivada. Por ejemplo, el cido clavulnico en menos de un minuto logra que el 50% de la -lactamasa estn transitoriamente inhibidas y a los 15 minutos estn irreversiblemente inhibidas (inactivacin permanente). La estructura qumica del CA fue determinada por Howarth y colaboradores (1976), ver figura 1. Este compuesto fue encontrado haciendo analoga con la estructura bsica de la penicilina, en la molcula del CA, el tomo de sulfuro es sustituido por un oxigeno (Rekha SS y colaboradores, 2008).
H O OH

H S

NHR
N O COOH

N O

1 2 Fig.1. La estructura del cido Clavulnico (1) y la estructura representativa de las penicilinas (2).

La produccin industrial del CA es llevada a cabo a gran escala de fermentacin de S. clavuligerus. Hay cepas capaces de soportar un alto nivel de productividad del CA, las cuales han sido derivadas desde el tipo S. clavuligerus silvestre (Alan Scragg, 2004). Al igual que con otros compuestos -lactamicos, el CA en su forma cruda es qumicamente inestable. Varios autores investigaron la estabilidad de CA en soluciones acuosas en buffer de pH diferentes (Mayer y Deckwer, 1996; Bersanetti y colaboradores, 2005), los cuales observaron que la degradacin del CA sigue una cintica de seudo-primer orden, y que esta degradacin fue catalizada por sales buffer utilizadas para mantener el pH constante. Haginaka y colaboradores (1981), quienes investigaron la estabilidad del CA a 35C y una fuerza inica () de 0.5 a diferentes pH, observaron que la velocidad de degradacin constante depende en gran medida del pH, que el CA tiene su estabilidad mxima a pH igual a 6.4 y que la temperatura tiene un efecto importante sobre la degradacin de CA. El CA o sus sales se pueden extraer directamente del medio de cultivo de diversas formas, pero normalmente las clulas de S. clavuligerus son las primeras eliminadas del medio de cultivo por filtracin o centrifugacin antes de comenzar los procedimientos de extraccin. Los procedimientos de extraccin pueden ser: Extraccin por solvente, Tecnologa de membranas y cromatografa de intercambio de in La extraccin por solvente desde el caldo clarificado del medio de cultivo ajustado a pH cido, y la utilizacin de materiales aninicos naturales a pH neutro, tales como el uso de resinas de intercambio aninico, han resultado ser especialmente til para el aislamiento del CA. El metil isobutil cetona es el solvente especialmente adecuado en la extraccin de la cultivo filtrado acidificado. Despus de la separacin de las fases, el CA se encuentra en la fase orgnica. Zhang y McKnight (2003) informaron de un proceso similar para la preparacin de una sal metlica farmacuticamente aceptable de CA. Ellos extrayeron el CA desde el caldo de fermentacin acuoso en un solvente orgnico, convertido en un intermedio terciario butilamina clavulanato a un pH inferior a 6, y finalmente convertido a la sal amina clavulanato de potasio. Estos procesos de purificacin tienen una desventaja inherente, ellos pueden introducir trazas de la amina, o llevar trazas residuales de sal de CA con la amina, en el producto final (Rekha SS y colaboradores, 2008). Esta base de procesos de extraccin presenta un problema cuando se prepara el CA, ya que el CA es particularmente sensible al agua, lo que puede dar lugar a la degradacin hidroltica. Por Tecnologa de membranas (Alves y colaboradores, 2002) consiste en una, dos o tres operaciones de membrana en secuencia. La primera operacin, dirigida hacia la separacin slido-lquido de los caldos de fermentacin es en general, una microfiltracin (MF) (Adikane y colaboradores, 1999) o una ultrafiltracin (UF) (Morao y colaboradores, 2001), donde se obtienen un concentrado que contiene todos los caldos de la biomasa y un permeado que contiene el antibitico, sales y agua. En segundo lugar una ultrafiltracin la cual acta como un paso de purificacin para el primer perneado y una diafiltration (DF) que suele ser necesaria para mejorar el rendimiento de la UF del segundo permeado. Por Cromatografa por intercambio de ion, el proceso de purificacin de CA incluye una serie de pasos al final de la fermentacin, el caldo es en primer lugar clarificado por filtracin o centrifugacin y el micelio de S. clavuligerus se descarta. La extraccin primaria incluye procesos tales como adsorcin, cromatografa de intercambio inico o extraccin lquido-lquido. Hasta el da de hoy, estos dos mtodos de separacin de fases, son la principal opcin para los compuestos de bajo peso molecular que se presenta en soluciones diluidas, como es el caso de los antibiticos producidos por la fermentacin, y esto es debido a su bajo costo y alto rendimiento (Mayer y Deckwer, 1996). El cido clavulnico considerado por su composicin qumica como una oxapenama, presenta una escasa actividad frente a la mayoria de las bacterias mostrandose activo solo frente a . menigitidis, . gonorrhoeae, B. catarralis y L. pneumophila. Sin embargo, al ejercer una potente accin inhibitoria sobre las -lactamasas, mejora su espectro al combinarse con amoxacilina, el cual se amplia a: Staphylococcuss aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducrey, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Klebsiella sp y Proteus mirabilis, entre otras que se pueden investigar an. Al combinarse el cido clavulnico con la ticarcilina, su espectro incluye los microorganismos habitualmente sensibles a la ticarcilina: Pseudomona aeruginosa, Enterobacter sp, Proteus indoligenos, Serratis marcescens y otros que no lo son por su produccin de betalactamasas como son: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Branhamella catarralis, Klebsiella pneumoniae,

Proteus vulgaris, Yersinia enterocalitica y Bacteroides sp. La accin de estos inhibidores de la -lactamasas pueden ser reversible o irreversible. En el primer caso, despus de la unin con la enzima esta puede recobrar su actividad. En el segundo caso, el inhibidor se fija a la enzima un tiempo suficiente para que el antibitico acte sobre la bacteria y dentro de este grupo se encuentran los llamados inactivadores suicidas (como el cido clavulnico) los cuales al fijarse a la enzima se alteran en su estructura qumica y resulta irreversible la unin a costa de su propia inactivacin. El CA debido a su baja actividad antimicrobiana ha dado como resultado, que no ha sido posible el uso del CA como un nico producto antibacterial administrado. Comnmente se encuentra combinado junto con la amoxacilina o la ticarcilina. Este es muy co-formulado con otros antibiticos de amplio-espectro, los cuales son susceptibles a la -lactamasa. Indiscutiblemente la aparicin de estas sustancias -lactmicas de poca actividad antibacteriana, pero de potente accin inhibitoria sobre las enzimas bacterianas inactivadoras de los antibiticos betalactmicos, cambi la forma de los procedimientos mdicos de la sepsis, ya que favoreci la ampliacin del espectro de los medicamentos y por tanto su efectividad frente a sus grmenes generadores de estas enzimas. Las combinaciones como amoxacillina - cido clavulnico y la ticarcilina - cido clavulnico se encuentran en los estudios de la antibiticoterapia para enfrentar la posible sepsis de un paciente crtico. El cido clavulnico es la marca antibacterial mas comn, dentro de los medicamentos para resistencia bacterial es el medicamento mas competido comercialmente (Rekha SS y colaboradores, 2008). La efectiva combinacin de la inhibicin de -lactamasa y la actividad antibacterial del CA lo hace un producto muy importante, clnica y econmicamente. Dentro de las acciones farmacolgicas del CA la eficacia de la combinacin sustancia -lactamica/inhibidor -lactamasa contra patgenos Gram-negativos depende de muchos factores de interaccin, uno de los cuales es la penetracin del inhibidor a travs de la membrana externa de las bacterias. Estas combinaciones de sustancias antimicrobianas e inhibidoras como ampicilina-sulbactam y amoxicilina-CA sigue manteniendo excelente actividad en contra de la mayora de determinados agentes patgenos, a pesar de 20 aos de uso clnico, estn bien establecidos en la terapia de una amplia gama de infecciones en hospitales y atencin primaria como resultado de su propia actividad de amplio espectro y buena tolerancia (Akalin, 1996). Estos agentes son particularmente adecuados para la profilaxis y el tratamiento de infecciones polimicrobianas. Se ha demostrado su eficacia en aplicaciones clnicas como en el tratamiento de infecciones del pie diabtico, infecciones intra-abdominales, infecciones pulmonares, abscesos cerebrales, enfermedad inflamatoria pelvica, infecciones del tracto respiratorio inferior (desde hace casi 25 aos), infecciones del tracto urinario (UTI) (Legnani, 1997), reduce la incidencia de ostetis alveolar asociados con la extraccin de terceros molares mandibulares (Oringer, 2003) y en el tratamiento de los abscesos endodnticos; la combinacin amoxicilina/CA es eficaz en el tratamiento del sobrecrecimiento bacteriano relacionado con la diarrea. Los inhibidores aminopenicillin/-lactamasa proporcionan tratamiento o profilaxis, que son ms rentables que si se realizaran con otros agentes antimicrobianos. Como una rara reaccin adversa, la disfuncin heptica es asociada a la combinacin Amoxicilina/CA de antibiticos. Finalmente, la importancia de una comprensin de los mecanismos implicados en la produccin de CA con el fin de mejorar su productividad, nace de que su produccin actual es baja y costosa (Neto A.B, 2005). Los esfuerzos dirigidos a estabilizar la molcula, sin prdida de bioactividad, la elaboracin de tcnicas nuevas y ms sencillas, el desarrollo de nuevas y ms efectivas formulaciones que contengan el CA dirigido contra los organismos que afecta la salud humana, son la necesidad del da. Para ello sera necesaria una amplia labor de investigacin interdisciplinaria en el campo de la biologa molecular, tecnologa de fermentacin y la industria farmacutica, entre otros. El avance de la produccin de los antibiticos muestra que un descubrimiento cientfico por si solo, no puede provocar grandes cambios, sino que requiere la creacin de tecnologa asociada para efectuar un buen proceso comercial. El estudio para la obtencin del cido clavulnico con sus diferentes combinaciones, es un tema de investigacin actual en biotecnologa por los beneficios que aporta a la generacin de nuevo conocimiento al servicio de la humanidad en el campo de la salud.

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