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Presentado por: Nathalia Andrea Gómez Grimaldos

Estudiante de maestría en Biotecnología-CAA


Asesor: Juan Carlos Quintero Diáz. Ing. Químico, PhD.
Grupo de Bioprocesos de la Universidad de Antioquia
Los requisitos específicos de nutrición de los microorganismos para
biosíntesis y crecimiento utilizados en procesos de fermentación son tan
complejos y variados como los microorganismos (tipo, especie y cepa).

 La fuente de carbono y/o nitrógeno pueden influir notablemente la


producción de ácido clavulánico por S. clavuligerus.
 La productividad de los metabolitos microbianos está estrechamente
relacionada con el proceso de fermentación utilizado.

El glicerol es esencial para la biosíntesis de ácido clavulánico y los


aminoacidos como la arginina y la ornitina son bien metabolizados por S.
clavuligerus, como precursores directos del AC.

La inhibición de productos en sistemas de producción biológica tiene


implicaciones importantes para el diseño y como instancia, el éxito de los
procesos biotecnológicos.
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La mayoría de experimentos industriales suelen implicar un gran
número de factores:

diseño factorial + gran número de experimentos: Reducir el No. de


experimentos a un nivel práctico (pequeño conjunto de posibilidades).

Se especifican los requerimientos nutricionales que se mejoran en los


cultivos de Streptomyces clavuligerus para la producción de ácido
clavulánico
Estudiar la biosíntesis y los precursores del ácido clavulánico, el
posible efecto de los productos de descomposición y la degradación,
así como estrategias en procesos en lote y lote alimentado.

Aumentan la obtención de productos biotecnológicos, con la


aplicación de estas herramientas y complementar de manera muy
eficiente un proceso, hasta obtener muy buenos resultados.

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Artículo 1: Variación de Concentración inicial (Co) de glicerol (Gly) para estudiar su
efecto sobre la producción del Ácido Clavulánico (AC).

Rango definido de Co→Trabajar proceso en lote y lote alimentado en matraces.

Trabajar en sistema de lote y lote alimentado en fermentador o bioreactor.

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Efecto de la concentración inicial
de glicerol
12

Ácido clavulánico (mg/g X)


10

4
2

0
0 10 20 30 40
Glicerol (g/L)
Figura 1. Efecto de la concentración inicial de Glicerol en el medio de cultivo sobre la
producción de Ácido clavulánico a partir de S. clavuligerus en cultivo por lote agitado a
T: 28°C y 200 rpm. X: Peso seco celular

Rango de Cglyo: 10-20 g/L


Producción de AC se inhibe a Cglyo > 15 g/L

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Consumo de Glicerol Producción de AC
Cultivo 1 Cultivo 1
16 400
Cultivo 2 Cultivo 2

Concentración de AC
14 350
Glicerol (g/L)

Cultivo 3 Cultivo 3
12 300
Cultivo 4 Cultivo 4
10 250
Alimentación con Alimentación
8

(mg/L)
200 con glicerol
6 glicerol (on)
150 (on)
4 100
2 50
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (h) Tiempo (h)
Peso Seco celular
Cultivo 1: Control sin 12
alimentación
Peso seco celular (g/L)

10

8
Desde las 60 h se
adicionaron 2 mL/12h de 6
Cultivo 1 La producción de AC
solución de glicerol 4 Cultivo 2 en el cultivo 4 fue 2,3
(125g/L) hasta: 2
Cultivo 3 veces > Cultivo 1
•Cultivo 2 (84 h) Cultivo 4
0
•Cultivo 3 (108 h)
0 20 40 60 80 100 120 140
•Cultivo 4 (132 h). Tiempo (h) 6
Consumo de Glicerol Producción de AC
25 Alimentación Lote 300
con glicerol

Concentración de AC (mg/L)
20 (on) Lote alimentado 250
Glicerol (g/L)

200
15
Alimentación
150
con glicerol
10 (off)
100
Lote
5 50
Lote alimentado
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (h) Peso Seco celular Tiempo (h)

20
Lote
Peso seco celular (g/L)

Lote alimentado
15 •En lote: La prod. AC
•La X en lote es 230 mg/L (73 h).
alimentado comenzo a 10 •En lote alimentado:
disminuir a las 48 h. La prod. AC: 280 mg/L
•La prod. AC 5 a 130 h

0
0 20 40 60
Tiempo (h)
80 100 120 140
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Artículo 2: Optimización del medio por el método de diseño experimental de matriz
ortogonal de Taguchi L16.

Con medio óptimizado trabajar en lote y lote alimentado con Gly, Arginina (Arg) y
Treonina (Tre).

Variación de la Co de la fuente de fosfato del medio de cultivo.

Variación de la Co de 11 Aminoácidos (AA) como suplementos del medio.

Realizar una fermentación en lote y lote alimentado con Co definidas.

8
Arreglo de matriz ortogonal usando el software MINITAB 13.3
No. Glicero Sacarosa Prolina Ácido Glutamico K2HPO4 AC
Muestra l (A) (B) (C) (D) (E) (mg/mL)
1 1(0,375) 1(0,500) 1(0,560) 1(0,420) 1(0,05) 0,114
2 1 2(1,000) 2(1,120) 2(0,840) 2(0,1) 0,373
3 1 3(2,000) 3(2,240) 3(1,680) 3(0,2) 0,317
4 1 4(3,000) 4(3,360) 4(2,520) 4(0,3) 0,354
5 2(0,750) 1 2 3 4 0,328
6 2 2 1 4 3 0,530
7 2 3 4 1 2 0,306
8 2 4 3 2 1 0,290
9 3(1,500) 1 3 4 2 0,328
10 3 2 4 3 1 0,269
11 3 3 1 2 4 0,274
12 3 4 2 1 3 0,218
13 4(2,250) 1 4 2 3 0,218
14 4 2 3 1 4 0,226
15 4 3 2 4 1 0,463
16 4 4 1 3 2 0,475

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Basandose: Co de Gly entre 10-20 g/L (Chen y col, 2002) y que Gly limita la
velocidad de síntesis de la producción de AC (Chen y col, 2003).
S/R=-10 log10(S2) donde S:Desv. Estandar
Ácido clavulánico (mg/mL)

Razón Señal/Ruido (S/R)


Nivel Nivel
Figura #. Gráfica de efectos para la media de Figura #. Gráfica de efectos para la media de
valores de Producción de AC. valores de Producción de AC.

δD(Á. glutámico)>δB(Sacarosa)>δA(Glicerol)>δE(K2HPO4)>δC(Prolina) Representan los valores de las


concentraciones óptimas de c/componente
Componentes Cantidad Componentes Cantidad
(g/L) (g/L)
Glicerol 15,00 K2HPO4 2,00 Rendimiento: 0,580 mg/mL
Sacarosa 20,00 NaCl 5,00 Rendimiento Exp.: 0,640 mg/mL
L-Prolina 22,40 MnCl2.4H2O 0,10 a 96 h
L-Ácido glutámico 16,60 ZnCl2 0,05 Control: 0,2 mg/mL (Medio sin
CaCl2 0,40 MgSO4.7H2O 0.50 optimización)
FeCl3.6H2O 0,10
Tabla #. Medio final optimizado para la producción de AC por Sc.
10
Peso seco celular (mg/mL)

Ácido clavulánico (mg/mL)


Glicerol (mg/mL)

(mg/
Tiempo (h)

Fig #. Efecto de alimentación con arginina a 120 h de fermentación para


producción de ácido clavulánico por S.c. MTCC 1142.

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Efecto de la fuente de fosfato sobre Efecto de adición de Animoácidos en
la producción de AC el medio sobre la producción de AC

Efecto de variación de Co de Gly, L-


Arginina, L-Treonina en el medio sobre la
producción de AC en lote
Efecto de lote alimentado de Co de Gly,
L-Arginina, L-Treonina en el medio sobre
la producción de AC en lote
Producción de AC:
Co 15 g/L de 1,100 mg/mL
L-Arginina (10 mM) de 1,100 mg/mL
L-Treonina (100mM) de 1,700 mg/mL
12
Artículo 3: Optimización de la razón molar Gly:Orn en el medio de cultivo por
medio de un diseño experimental de superficie de respuesta de segundo orden
basado un diseño de composición central (DCC) factorial completo 2K.

Efecto de la alimentación de Gly:Orn en la producción de AC, en un cultivo continuo


a una tasa de dilución (D) predefinida en la literatura.

13
CAC máx. da una razon molar Gly-
Ornitina 40:1 que corresponde a 85
mM y 2,1 mM

14
15
Artículo 4: Escalabilidad (reducción) y medida de OUR (tasa de consumo de
oxigeno)→KLa (coeficiente volumétrico de transferencia gas-liquido) por
comparabilidad matraz de volumen pequeño vs. bioreactor.

Efecto de el ácido clavulánico sobre cultivos de Streptomyces clavuligerus.

Efecto de el AC descompuesto sobre cultivos de S. c.

Modelo del diseño experimental se ajusta a:

16
Criterio de escalabilidad (reducción): Valores de KLa

17
Efecto de ácido clavulánico sobre cultivo de S.c.

18
Efecto del ácido clavulánico descompuesto sobre cultivo de S.c.

19
•Estrategias para optimización del medio de cultivo en pro de mejorar la
producción de AC

•Aumento de la producción de AC en cultivos agitados de S.c. y una mayor


estabilidad de los productos en la fermentación.

•Reafirmar que el Gly es esencial para sintetizar y obtener el AC.

•En procesos de lote alimentado y continuo, la alimentación intermitente de Gly


parece mantener el metabolismo celular y así poder aumentar la producción de AC.

•La adición de AA (Tre) aumenta la producción de AC ya que es un precursor de


C3 en la biosíntesis del AC

•La adición intermitente de solución de Gly:Orn (40:1) en el medio de cultivo para


sistema en lote alimentado y continuo, aumenta la producción de AC.

•El aumento de la concentración de AC y de sus productos de descomposición


en el medio de fermentación afecta la fisiología de la S.c. y por tanto la producción de
AC.
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•Las herramientas estadísticas utilizadas en los artículos ofrecieron buena
información, disminuyendo el número de experimentos y utilización de materiales,
su efectividad fue comprobada experimentalmente.

•Hay artículos muy bien escritos que se pueden ser interpretados a partir solo de
sus gráficas.

•El artículo 1 no muestra la aplicación de la herramienta de diseño experimental de


Taguchi, aunque lo nombra.

•El artículo 2 habla de la limitación que ejerce la L-valina pero al observar la gráfica
reportada se puede pensar que la L-leucina causa un efecto similar y no fue
estudiado.

•En el artículo 2, el rendimiento de AC presentado en este trabajo como el más alto


alcanzado hasta ahora con una cepa silvestre de S. clavuligerus. El mecanismo
exacto de acción estimulante de la treonina en la producción de ácido clavulánico
es desconocido y lo deja pendiente como una labor futura.

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• La treonina parece ser un eslabón importante en la biosíntesis de ácido
clavulánico en S. clavuligerus.

•En el artículo 3 se ve que la alimentación intermitente de una solución Gly:Orn


para sistemas de lote o lote alimentado puede mejorar la producción de AC.

•Se puede ver el efecto del AC y sus productos de descomposición en el medio


durante una fermentación, lo cual sirve de base para buscar más y mejores
estrategias para producir este metabolito.

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 Kuo-Cheng Chen, Yun-Huin Lin, Cheng-Min Tsai1, Chen-Hao Hsieh, Jer-Yiing Houng.
“Optimization of glycerol feeding for clavulanic acid production by Streptomyces
clavuligerus with glycerol feeding”. In: Biotechnology Letters. Vol. 24 (2002) p.455–458.
 Parag S. Saudagar, Rekha S. Singhal. “Optimization of nutritional requirements and
feeding strategies for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus”. In:
Bioresource Technology, Vol. 98 (2007) p.2010–2017
 Letícia C.G. Domingues, Juliana C. Teodoro, Carlos O. Hokka, Alberto C. Badino, Maria
Lucia G.C. Araujo. “Optimisation of the glycerol-to-ornithine molar ratio in the feed
medium for the continuous production of clavulanic acid by Streptomyces clavuligerus”.
In: Biochemical Engineering Journal, 15 de mayo (2009). DOI:10.1016/j.bej.2009.05.006
 Simone Brethauer, Martin Held, Sven Panke. “High Concentrations of Clavulanic Acid
But Not of Its Degradation Products Decrease Glycerol Consumption and Oxygen
Uptake Rates in Cultures of Streptomyces clavuligerus”. In: Biotechnology and
Bioengineering, Vol. 100, No. 3, June 15, 2008
 Kuo-Cheng Chen, Yun-Huin Lin, J-Y Wu, S-C.J. Hwang. “Enhancement of clavulanic
acid production in Streptomyces clavuligerus with ornithine feeding”. In: Enzyme Microb.
Technol. Vol. 32 (2003) p.152–156.
 Gutiérrez Pulido, Humberto. “Análisis y diseño de experimentos”. Mexico: McGraw-
Hill, 2003.
 Shumpe A, Quicker G, Deckwer WD. “Gas solubilities inmicrobial culture media.
Reaction engineering”. Berlin: Springer Verlag. (1982) p. 1-37
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