TCNICAS BACTERIOLGICAS

Morfologa bacteriana

Coco: esfrica; pueden agregarse en pares (diplococo), en cadena (estreptococo), en racimos (estafilococo), en ttrada o sarcina. Bacilo: en forma de bastoncillo; puede tender a ser esfrico (cocobacilo) o alargado (bacilo fusiforme). Espirilo: en forma helicoidal Vibrio Espiroqueta: en forma de tirabuzn

Tinciones simples y especiales Tincin de Gram

Primer colorante (cristal violeta): bsico, en contacto con las bacterias cargadas negativamente reacciona colorendolas. Solucin mordiente (Yodo de Gram): fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las bacterias. Agente decolorante (alcohol-acetona): disolvente orgnico que se utiliza como lavado para eliminar colorante no fijado. Colorante de contraste (safranina): colorante bsico de distinto color al primer colorante. Bacterias Gram (+) se tien de prpura por el cristal violeta y retienen la coloracin por su gruesa capa de peptidoglicanos. Bacterias Gram (-) perdern la coloracin inicial del cristal violeta por su delgada capa de peptidoglicanos y se teirn derojo debido a la safranina.

Tincin de Anthony Las cpsulas no se tien normalmente con colorantes bsicos como el cristal violeta o la safranina. Tincin negativa de cpsulas en que la leche litmus se tie con violeta cristal como contraste de un fondo morado con el halo transparente de la cpsula incolora. Tincin de Meller Las esporas permiten a las bacterias pasar a un estado latente en condiciones ambientales adversas. Su principal componente es Ca2+ fijado a cido dipicolnico. El calor despus de la tincin con carbol-fuscina con permite que rompa la estructura que protege la espora para que as pueda penetrar el colorante. Con el lavado de agua se retira todo tinte que se adhiri a la bacteria, para despus

teirse con azul de metileno. Resalta de color rojo la espora y de color azul, la bacteria. Cultivo de bacterias y aislamiento de colonias Mtodo de estras y vertido

El mtodo de estras es el ms utilizado para el aislamiento de colonias bacterianas. Mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inculo sobre un medio slido para obtener un nmero reducido de bacterias distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa de Petri que al incubar, cada una originar una colonia. El mtodo de vertido es el ms utilizado para el recuento bacteriano, es importante el conteo de colonias para conocer la velocidad con que se reproducen y calcular el nmero de bacterias por volumen de solucin (UFC: unidades formadoras de colonias).

Efecto de los agentes qumicos y fsicos sobre las bacterias Prueba de sensibilidad a antibiticos Mtodo de difusin en plato

La bacteria inoculada se enfrenta sobre la superficie del medio de agar a una solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro o en pastillas. El medio de cultivo ms frecuentemente empleado es el deMeller-Hinton. Su pH debe estar entre 7,2-7,4 y grosor entre 4-6 mm. El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland y la inoculacin se debe efectuar con hisopo de algodn estril. La lectura se realiza entre 18-24 h, adecuado nicamente para bacterias patgenas de rpido crecimiento.

Mtodo de dilucin en plato Los mtodos de dilucin pueden realizarse en medio slido (en agar) o en medio lquido (en caldo). La adaptacin a microplatosde 96 pocillos utilizando volmenes de 50-200 uL permite testar un gran nmero de antibiticos de forma sencilla, rpida yeconmica.

Antibiograma E-test Tcnica que combina los mtodos de difusin en agar y dilucin para determinar la CIM. La sistemtica es similar al mtodo de difusin en agar pero en lugar de discos utiliza tiras de Etest. Estas tiras contienen un gradiente del antimicrobiano en la superficie inferior que difunde en el agar estableciendo un gradiente continuo del mismo a lo largo de la tira. Despus de la incubacin se forma una zona elptica de inhibicin del crecimiento y la CMI corresponde con el punto donde el rea de inhibicin del crecimiento intersecciona con la tira. CIM (concentracin inhibitoria mnima): menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. CBM (concentracin bactericida mnima): menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.

2. COCOS GRAM (+) PIGENOS DE IMPORTANCIA MDICA

Morfologa de cocos con tincin de Gram

Los cocos Gram positivos pueden ser: Staphylococcus o Streptococcus

Prueba de catalasa

Bacterias que viven en ambientes aerobios requieren de catalasapara convertir el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Es positiva la prueba cuando se ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con H2O2 3% y se producen burbujas de oxgeno. Se emplea para diferenciar el gnero Staphylococcus (catalasapositivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).

Prueba de manitol sal

Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. NaCl 7,5% le proporciona lo selectivo ya que slo estos microorganismos osmotolerantes u osmfilos pueden multiplicarse en l. Manitol es el nico azcar fermentado por las cepas patgenas de este gnero bacteriano. La produccin de cidos proveniente de la fermentacin del manitol es detectada por el viraje del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus epidermidis no fermenta el manitol, dar lugar a colonias pequeas rodeadas de un halo prpura.

Prueba de coagulasa

Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). La tcnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada. Mecanismo de accin de la coagulasa libre: procoagulasa(enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo anlogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibringeno formando un cogulo de fibrina en ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de agregacin acta directamente sobre el fibringeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmticos.

 Prueba de hemlisis en agar sangre Detecta la presencia de hemolisina, enzima que permite la clasificacin de los Streptococcus en alfa (hemlisis parcial, incompleta que torna color verdoso), beta (hemlisis total) y gamma hemolticos (no existe hemlisis) . Muchas otras bacterias, aparte de los Streptococcus, pueden tener esta enzima como B. megaterium; se usa el cultivo para demostrar el grado de hemlisis (hemlisis beta) en la cual se puede observar claramente por detrs de la siembra.

Antibiograma con optoquina para Streptococcus alfahemolticos

Permite diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible aoptoquina (etilhidroxicuprena, Taxo P) de otras especies deStreptococcus alfa-hemolticos, en especial del grupo viridans que son resistentes.

Antibiograma con bacitracina para Streptococcus betahemolticos

Permite diferenciar estreptococos beta-hemolticos del grupo A (S. pyogenes), que son sensibles a bacitracina, del resto de estreptococos betahemolticos que son resistentes. Solo un porcentaje muy pequeo de Streptococcus de los grupos B, C y G son sensibles a la bacitracina (Taxo A).

Prueba de CAMP para Streptococcus beta-hemolticos

Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una protena difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-hemlisis de Staphylococcus aureus. S. aureus (sembrado desde la parte superior hasta la parte inferior de la placa) produce esfingomielinasa C que se puede unir a las membranas de los eritrocitos. Cuando son expuestas al factor CAMP del grupo B, las clulas sufren hemlisis.

Prueba de bilis esculina para Streptococcus gammahemolticos

Los enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los enterococos de otros cocos Gram (+) catalasa-negativos. En la prueba positiva, el tubo torna de color chocolate oscuro,

caracterstico al desdoblar la bilis esculina. Enterococcus faecalis es la antigua categora taxonmica para Streptococcus faecalis.

3. BACILOS GRAM (+) AEROBIOS

Prueba SIM

En el medio de SIM se mide la motilidad de las bacterias, espositiva cuando se existe turbidez en el medio pero negativo, cuando se observa la penetracin del inculo.

Prueba de glucosa y salicina

Prueba de gelatinasa

Permite medir la presencia de gelatinasa. Si luego de cierto tiempo de refrigeracin, la gelatina sigue en estado lquido, es indicativo de que la prueba result positiva y por tanto la bacteria tiene gelatinasa al licuar el medio.

En este caso, el B. subtilis no posee la enzima gelatinasa, y por ende, el medio se solidific en refrigeracin.

Prueba de leche litmus

Prueba de amilasa

Utilizando agar almidn, se siembra el B. megaterium en cuatro puntos equidistantes. Se deja incubar, y luego para definir si hubo o no consumo de almidn, y por ende presencia de amilasaen la bacteria, se aade yodo de Gram. La prueba positiva muestra un halo incoloro en donde hubo crecimiento.

4. MICROORGANISMOS TRANSMITIDOS SEXUALMENTE

Neisseria gonorrhoeae Es el agente etiolgico de la gonorrea, se trata de cocos Gram negativos que se disponen en pares (diplococos) cuyas caras adyacentes estn aplanadas. No son mviles ni forman endosporas. Son oxidasa positivo y la mayora de este gnero producen catalasa. N. gonorrhoeae es una bacteria exigente, necesita medios de cultivo complejos para crecer y se puede ver afectado de manera adversa por la desecacin y por los cidos grasos. La temperatura ptima de crecimiento es de 35 a 37C adicionado una atmsfera suplementada con CO2. Medio de agar chocolate Thayer Martin para Neisseria gonorrhoeae Medio enriquecido preparado con un medio base tal como agartripticasa (TSA) o agar infusin cerebro corazn (BHIA) suplementado con sangre animal desfibrinada y calentada a 80C durante 10 min. A veces el calentamiento excesivo destruye el factor V (NAD), por lo que se suele adicionar este factor. Es un medio adecuado para el cultivo de N. gonorrhoeaey varias especies de Haemophilus, entre otras bacterias. Treponema pallidum con tincin argntica de Fontana

Es el agente etiolgico de la sfilis, se trata de una bacteria con morfologa de espiroqueta delgada y en forma de espiral que no puede crecer en cultivos acelulares. Las espiroquetas son demasiado delgadas como para ser vistas al microscopio ptico en las muestras teidas con Gram o con Giemsa. Sin embargo, las formas mviles se pueden ver con un microscopio de campo oscuro o mediante la tincin con anticuerpos especficos antitreponema marcados con colorantes fluorescentes. Candida albicans con tincin de Gram en raspado vaginal Es el agente etiolgico de la candidiasis, no es una bacteria sino una levadura que ante la tincin de Gram es positiva. Con una excepcin, una caracterstica morfolgica llamativa de las levaduras del gnero Candida es que multiplican formandoblastosporas, pseudohifas e hifas septadas.

5. BACILOS GRAM (-) FERMENTADORES Y NO FERMENTADORES

Tincion de Gram con bacilos Gram (-) Las enterobacterias son bacilos cortos gram negativos no esporulados, que pueden o no tener motilidad. Son anaerobios facultativos o anaerbicos. Medio de agar McConkey Medio selectivo por contener sales biliares y violeta cristalque inhiben el crecimiento de bacterias no entricas. Tambin es un

medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). Las bacterias capaces de fermentar lactosa producirn un cambio en el pH del medio por liberacin de productos cidos. Como consecuencia sus colonias aparecern de colorfucsia/violeta, contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias incapaces de fermentar la lactosa. Medio de agar SS (Salmonella-Shigella) Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Est compuesto por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirn cidos y cambiar el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la produccin de cido sulfhdrico de las bacterias sulfato-reductoras. Este cido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro. Medio de agar EMB (eosin methylene blue) Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentacin de azcares. Escherichia coli produce un color verde metlico caracterstico para esta prueba positiva. Medio con citrato de Simmons Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio como nica fuente de fosfato y azul de bromotimolcomo como indicador de pH. nicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrn multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (bsicos) que junto con la eliminacin decitrato (cido) generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul. Prueba de urea El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo plido hasta un rojo fucsia. Prueba SIM (sulfuro indol movilidad) La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminocido triptfano a indol. Al aadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene p-dimetilaminobenzaldehdo, reacciona tanto con el indol como con el triptfano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la

interferencia del triptfano, el reactivo est disuelto en alcohol isoamlicoinmiscible en agua. A diferencia del triptfano, el indol es soluble en el alcohol y slo este compuesto reaccionar con el aldehdo produciendo el anillo coloreado caracterstico de esta prueba. Medio con TSI (triple sugar iron) Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de ste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (cido) de color amarillo. K/A Si la bacteria metaboliza slo la glucosa: en la superficie la utilizar por va respiratoria, y donde la tensin de oxgeno disminuya lo suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilacin oxidativa de las protenas. Como resultado, el medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearn desde el primer momento la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo. A/A Si la bacteria, adems fermenta lactosa: los cidos producidos modificarn tambin el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiar a amarillo. K/K Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azcares son respirados, degradndose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. A/A(g) aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo. K/A(H2S) aparicin de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobinticas son capaces de emplear el tiosulfato sdio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a cido sulhdrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro. Prueba de fermentacion de azucares

Medio MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)

Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en 2 fases: 1. Metabolismo aerbico (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio 2. Metabolismo anaerbico (fermentacin) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: 2.1 fermentacin cido-mixta: productos finales son cidos orgnicos(frmico, actico, lctico y succnico) y etanol 2.2 fermentacin butiln gliclica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario. La liberacin de cidos orgnicos generar un acusado descenso del pH que podr ser detectado aadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0). Si la fermentacin que se ha llevado a cabo produce acetona puede ser detectada aadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarn con este compuesto produciendo rojo caracterstico.

Prueba de fenilalanina En este medio, el aminocido presente es la fenilalanina, empleado para determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en bacterias. La accin de esta enzima se evidencia por la aparicin en el medio del producto resultado (cido fenilpirvico) que se detecta mediante adicin de cloruro frrico, resultando un compuesto de coloracin verde oscuro.

Prueba de oxidasa Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en su presencia, produciendo formas coloreadas (azul/morado). Permite diferenciar el grupo. Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del gnero Pseudomonas (que posee citocromo c).

Sistema API para enterobacterias Sistema que permite obtener todos los resultados de las mismas pruebas realizadas arriba, de manera simultnea, rpida y con una menor cantidad de muestras y reactivos.

6. MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Metodo de jarra y vela Se necesita un frasco con tapn de rosca y una vela. Una vez sembradas las placas y los tubos, se colocan en el interior del frasco junto con la vela encendida y se cierra el frasco hermticamente. Cuando la vela consume todo el O2 del frasco, se apaga consiguiendo una atmsfera de 5-7% O2 (microaeroflico) Recipiente Gas Pak Consta de un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermtica. Para crear la atmsfera anaerbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que contiene una tableta de borohidrato sdico y otra debicarbonato sdico y cido ctrico. Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra junto al sobre abierto al que previamente se le han aadido 10 mL de agua destilada estril para generar la liberacin de CO2 e H2. Para confirmar el ambiente anaerobio, se coloca dentro de la jarra un papel indicador (azul de metileno) que vira de color (de azul a blanco) en presencia de CO2. Tapa Brewer Anteriormente era utilizado para tapar el plato Petri y as crear un ambiente con bajo % de oxgeno.

Plato Spray Consta de una lnea central que divide en 2 segmentos: en unocido piroglico y en el otro NaOH que al mezclarlo en el medio de cultivo, reaccionaban formando H2O y CO2.

Cultivo en caldo de carne de Clostridium La capa de aceite mineral estril permite que la superficie del caldo con carne molida de corazn de vaca quede totalmente cubierta para impedir la difusin de O2 al medio. Antes de inocular es conveniente hervir el medio durante 10 min para liberar el O2.

Sistema API para anaerobios Se observa el sistema API para las diferentes pruebas bioqumicas propias de los anaerobios, junto con el manual que indica lo positivo de las mismas.

7. MYCOBACTERIAS, NOCARDIAS Y ACTINOMYCES

Cultivos de Mycobacterium Medio de Lowenstein Jensen Hecho a base de huevo, se cocina el huevo batido con estracto de papa y se le aade verde malaquita, inhibidor para bacterias Gram positivas. Posee un fondo cremoso verde plido. Cultivo de M. Tuberculosis No es una mycobacteria atpica. Diagnstico lento debido a su periodo de incubacin de 3-6 semanas. Cultivo de mycobacterias atipicas

Segn Runyon, se clasifican en:

o Fotocromgenas (despus de exposicin a luz) o Estocromgenas (ante oscuridad y luz) o No Fotocromgenas (no pigmentadas de crecimiento lento) M.

M. kansasii, M. marinum, M. simiae

M. flavescens, M. scrofulaceum, M. gordonae

terrae, M. gastric, M. complejo avium-intracellulare o Crecimiento rpido M. chelonae, M. fortuitum

Tincion de Ziehl Neelsen Muestra de esputo BAAR (+)

o Esta tincin demuestra la capacidad de bacterias teidas deresistir a

la decoloracin por cidos y alcoholes. Esto se correlaciona con su alto contenido en lpidos de su pared celular y presencia de cidos miclicos que aumentan el carcter hidrfobo. Mezcla en carbol-fuscina capaz de teir las clulas en caliente. El carbol facilita la penetracin de fuscina en la envoltura celular.

Decolorante orgnico, mezcla de cido y alcohol. Azul de metileno como colorante de contraste. Los Bacilo Alcohol cido Resistente (BAAR) tras la unin de la fucsina, resisten el tratamiento orgnico y se vern teidas derosado/fuscia. El resto de las bacterias se decolorarn y se contrastarn con azul de metileno. El observar BAAR (+) en una muestra de esputo, no significa que esos bacilos sean necesariamente de M. tuberculosis.
Granulo histopatologico de Nocardia

Bacterias Gram positivas filamentosas, pueden producir BAAR (+) y confundirse con M. tuberculosis. Para aislarlo se utiliza elmedio de Sabouraud a temperatura ambiente. Se pueden observar como maraas enredadas en una biopsia pulmonar que pudieran bien confundirse con un artefacto histolgico.