Cintica de fermentacin alcohlica utilizando como fuente de nitrgeno harina de semilla de guayaba Psidium guajava

Liliana Serna Cock 1*, Daniel Mera Ayala 1, Jorge Angulo Lpez 1, Ana Lucia Gmez 2
1*

Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniera y Administracin, Carrera 32 va Candelaria, Palmira Valle, Colombia. 2 SUCROMILES S.A., Km. 14 Recta Cali-Palmira Valle, Colombia.

1.

INTRODUCCIN

En la industria de las fermentaciones, el costo, la disponibilidad y la estabilidad de los sustratos de fermentacin, son motivo de investigacin, ya que pueden representar hasta el 68 % del costo de produccin de los productos obtenidos por fermentacin [1, 2], siendo las materias primas ms importantes las fuentes de carbono y de nitrgeno. En referencia a la fuente de carbono, la melaza de caa de azcar es uno de los principales subproductos de la industria azucarera, es buena fuente de azcares fermentables y no requiere pretratamiento complejo [3]. Tradicionalmente la urea es la principal fuente de nitrgeno, y el fsforo, es adicionado en la forma de fosfato diamnico por su demostrada facilidad de absorcin por parte de las clulas microbianas, favoreciendo, al igual que la fuente de nitrgeno, el desarrollo celular [4]. La bsqueda de nuevas fuentes de nitrgeno est dirigida a reemplazar suplementos costosos como son los pptidos y algunos factores de crecimiento (Vitaminas del complejo B) los cuales tienen gran importancia en la fermentacin [5]. De otro lado, estudios realizados por Steinhaus et al. [6], afirman que una parte importante de la cosecha de guayaba se procesa en mermeladas, sorbetes, pastas y barras de dulce llamadas bocadillos. Durante la elaboracin de dichos productos se utiliza la pulpa quedando como residuo una gran cantidad de semilla, la cual representa el 4.0 % del peso de la guayaba y posee un contenido importante de protena [6,7]. Altaf et al. [5], establecen una necesidad en la investigacin sobre materiales renovables nitrogenados como alternativa de fuentes de nitrgeno de menor costo, en fermentaciones industriales. El residuo agroindustrial generado en la agroindustrializacin de la guayaba, pueden ser una fuente alterna y potencial de alto inters en el estudio de posibles aplicaciones en la industria de las fermentaciones. Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue evaluar la cintica de fermentacin alcohlica utilizando como fuente de nitrgeno harina de semilla de guayaba Psidium guajava. La cintica se midi en trminos de conversin de sustrato, rendimiento en producto y productividad. 2. METODOLOGA

permanecieron en un bao termosttico (Julabo 13A, Germany) a 34 0.5 C, con aireacin 5 L/min y agitacin a 270 rpm por 4 horas y durante la etapa de fermentacin, permanecieron en el mismo bao termosttico a 32 0.5 C, sin aireacin y agitacin a 270 rpm por 24 horas. 2.5 Cintica de produccin de etanol, consumo de sustrato y formacin de biomasa en fermentacin alcohlica Para realizar las cinticas de produccin de etanol y consumo de sustrato, en cada uno de los tiempos y para cada uno de los sustratos, se tomaron aspticamente 10 mL de sustrato a las 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas de fermentacin (El tiempo 0 correspondi a las condiciones finales de la etapa de reproduccin celular), los cuales se centrifugaron a 4000 rpm por 10 minutos (Eppendorf Centrifuge 5804R, Germany); posteriormente se filtraron en filtros de 0.45 m (Titan, USA). La produccin de etanol se midi en los sobrenadantes mediante cromatografa gaseosa (Cromatgrafo de gases Agilent technologies 7890A, USA) y el consumo de sustrato (Azcares reductores) se determin por espectrofotometra (Thermo Scientific Genesys 10 UV, USA) mediante el mtodo DNS (cido 3,5- dinitrosalicilico) [9]. La cintica de formacin de biomasa se determin por conteo en Cmara de Neubauer; el seguimiento de la formacin de biomasa se llev a cabo durante 4 horas con el fin de garantizar que el nmero de clulas inoculadas fuera superior a 3x108 CelmL-1 acorde a la metodologa establecida por Caldern, [4]. Se calcul la conversin de sustrato (CS), el rendimiento en producto (Yp/s) y la productividad mediante las Ecuaciones 1, 2 y 3.

2.1 Material biolgico Se trabaj con semilla de guayaba Psidium guajava suministrada por la empresa Dulces San Antonio la Tentacin, del Municipio de Vlez Santander, Colombia. La semilla se someti a un proceso de secado (Binder ED 115-UL, Germany) y molienda (FRITSCH Pulverisette 14, Germany) para la obtencin de la harina. 2.2 Determinacin del contenido de nitrgeno del material biolgico Se determin el contenido de nitrgeno mediante el mtodo Kjeldahl [8]. 2.3 Microorganismo Se utiliz una cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red (Division of S.I. Leaffre Group, France) 2.4 Fermentacin Las cinticas se llevaron a cabo en 6 fermentaciones en discontinuo, usando como sustrato, melaza ms urea y fosfato diamnico MUFA (Azcares reductores 23 gL-1, urea 1.1 gL-1 y fosfato diamnico 0.67 gL-1) y melaza ms harina de semilla de guayaba MHSG (Azcares reductores 23 gL-1 y harina de semilla de guayaba 51.42 gL-1). Los sustratos se ajustaron a pH 4.6 utilizando cido sulfrico al 98 % y se esterilizaron a 121 C y 0.11 MPa por 15 min (Autoclave esterilizador Medical Essen 250 I, Colombia). Para la etapa de reproduccin se utiliz el 30 % (v/v) de inculo con respecto al volumen del sustrato. Las fermentaciones se realizaron en un bioreactor de 1500 mL, con un volumen de trabajo efectivo de 1000 mL; en la etapa de reproduccin de la levadura,

Donde, S0: Concentracin inicial de azcares reductores (gL-1), S: Concentracin final de azcares reductores (gL-1), hasta el tiempo en que P es mximo; P: Concentracin mxima de etanol (gL-1), mp: Masa de etanol producida (g), VT: Volumen total de fermentacin (L) y t: Tiempo de fermentacin (h). 2.6 Anlisis estadstico Se us un diseo factorial de 2*6 con dos factores y tres replicas as: Factor sustrato de fermentacin, con dos niveles: melaza ms urea y fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). Factor tiempo de fermentacin, con 6 niveles: 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas de fermentacin, donde el tiempo 0 correspondi a las condiciones finales de la etapa de reproduccin celular. Las variables de respuesta fueron: Conversin de sustrato, rendimiento en producto y productividad. Los resultados se analizaron con el paquete estadstico SAS 9.2 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC., USA) [10]. La comparacin entre promedios se llev a cabo a travs de la prueba DMS (Diferencia Mnima Significativa) con una probabilidad de P < 0,05. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN

La harina de semilla de guayaba present un contenido de nitrgeno del 1.23 % en base seca. El sustrato MHSG present el mayor rendimiento en producto (Yp/s) y la mayor conversin de sustrato a las 18 y 24 horas de fermentacin respectivamente (6.11 gg-1 y 47.58 %). La productividad a las 24 horas de fermentacin en el sustrato MUFA fue mayor que la del sustrato MHSG con valores de 2.59 y 2.50 gL-1h-1 respectivamente. Esto indica que el sustrato MHSG al finalizar el proceso presenta la mayor conversin de sustrato, pero el rendimiento en producto es mejor a las 18 horas de la fermentacin.

8,50 Log (CelmL-1) 8,40 8,30 8,20 8,10 8,00 0 1 2 3 4 5 Tiempo (h) MUFA - Formacin de biomasa MUFA - Consumo de sustrato

120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00

Azucares reductores (gL-1)

8,60

140,00

sulfato de amonio, por lo cual, la harina de semilla de guayaba se puede considerar una fuente de nitrgeno viable para la fermentacin alcohlica. 4. CONCLUSIONES

MHSG - Formacin de biomasa MHSG - Consumo de sustrato

Figura 1: Cintica de formacin de biomasa y consumo de sustrato de Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de reproduccin, utilizando sustratos: melaza ms urea y fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). La figura 1 muestra que los azcares reductores mostraron un incremento en su concentracin durante la primera hora de reproduccin, lo anterior se explica por la presencia de sacarosa en la melaza, la cual es catalizada por la enzima invertasa presente en la levadura [11]. La hidrlisis de la sacarosa trae consigo un ligero aumento en las concentraciones de fructosa y glucosa [12], y por ende un aumento en los azcares reductores.
8,80 8,70 8,60 8,50 8,40 8,30 8,20 8,10 8,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Azcares reductores (gL-1) 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00

La harina de semilla de guayaba es una buena alternativa como fuente de nitrgeno en fermentaciones alcohlicas, cuando se utiliza como sustrato MHSG, se pueden obtener mayor conversiones de sustrato y mejores rendimientos en producto durante la etapa de fermentacin. El uso de esta fuente de nitrgeno podra disminuir los costos operacionales alrededor del 35 %, comparado con el uso de las fuentes habituales, generando adems un valor agregado interesante a este residuo agroindustrial que puede perderse en la agroindustrializacin de la fruta. Agradecimientos Los autores expresamos los agradecimientos al Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y a las empresas SUCROMILES S.A. y Dulces San Antonio la Tentacin, por los aportes a sta investigacin. 5. REFERENCIAS

Tiempo (h) MUFA - Formacin de biomasa MUFA - Consumo de sustrato

MHSG - Formacin de biomasa MHSG - Consumo de sustrato

Figura 2: Cintica de formacin de biomasa y consumo de sustrato de Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de fermentacin, utilizando sustratos: melaza ms urea y fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). En la figura 2 el incremento de los azcares reductores durante las 6 primeras horas, fue debido, al suministro de sustrato que se realiz cada hora durante este periodo. La formacin de biomasa disminuy por efectos de dilucin, ocasionada a su vez por el suministro de sustrato. Al finalizar la etapa de fermentacin se presentaron diferencias estadsticamente significativas P < 0.05 entre los dos sustratos, tanto para el consumo de sustrato, como para la formacin de biomasa.
9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tiempo (h) MUFA MHSG

Figura 3: Cintica de produccin de etanol de Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de fermentacin, utilizando sustratos: melaza ms urea y fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). La produccin de etanol (figura 3) mostr un comportamiento similar para los dos sustratos, estos no presentaron diferencias estadsticamente significativas P > 0.05 a las 24 horas de fermentacin, igual comportamiento se present en estudios realizados por Turhan et al. [13], quienes utilizaron extracto de levadura y extracto de algarroba con fuente de nitrgeno. Mientras que Tang et al. [14], reportan una concentracin de etanol del 8.50 % a las 48 horas de fermentacin utilizando melaza ms

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Log (CelmL-1)

Etanol (% v/v)