Mtodos de anlisis de los componentes celulares

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Espectrofotometra
Absorcin de energa radiante (luz)

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Espectro electromagntico
l
Longitud de onda

n
Frecuencia

Mayor Energa

Menor Energa
Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Frecuencia

Longitud de onda

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Luz Energa
E=h

E = Energa de un fotn h = Constante de Planck -27 (6,6 x 10 erg.s) = Frecuencia

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

l
Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Vibracin

Rotacin

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Estado excitado

Energa

Estado basal Niveles de energa vibracional

Distancia interatmica

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Espectro de absorcin

l1

l2
Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

AMP

Citocromo c Visible

Histidina

Lisozima
Fenilalanina

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

I0 = intensidad de la luz inicial (total)

I1 = intensidad de la luz transmitida

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Ley de Lambert-beer
Transmitancia
T=

I1
I0

I1 = intensidad de la luz transmitida

I0 = intensidad de la luz inicial (total)

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

A=

- log

A=

- log

I1

I0

A = Absorbancia
Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

A=

lC

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Curva de calibracin:

Absorbancia aumenta
Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Determinacin de la concentracin de protenas. Mtodo colorimtrico de Lowry

Se usa como estndar albumina de bovino: BSA

Protena BSA:

25

50

75

100

mL

Marco A. Galleguillos C. Unidad-2

Protena BSA:

25

50

75

100

mL

Solucin A:

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Despus de media hora se agrega la Solucin B

Protena BSA:

25

50

75

100

mL

Solucin A:
Solucin B:
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Se mide la ABSORBANCIA a cada tubo en un espectrofotmetro

Luz incidente de 750 nm

Luz monocromtica

La luz absorbida es proporcional a la cantidad de protena presente

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TABLA DE RESULTADOS DE LA CURVA DE CALIBRACIN

Est BSA mL mg prot.

0.66 mg/mL A (750nm)

0
25

0
16,5

0
0,243

50
75 100

33
49,5 66

0,406
0,613 0,761

Muestra

0,675
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Curva de Calibracin de [Protenas]

0,9 0,8 0,7

0,6

A 750

0,5 0,4 0,3 0,2

0,1
0 0 10 20 30 40 50 60 70

mg de BSA

57 mg protena

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Por ejemplo si se requiere medir la actividad de una deshidrogenasa, se puede seguir la aparicin de producto en el tiempo (NADH)

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A 340 nm tiene una mayor absorcin de luz la forma reducida NADH

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[P]

Enz Tiempo

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Reaccin que ocurre en el citosol de las clulas animales

COO O C CH3
Piruvato

Lactato deshidrogenasa

COOH C OH CH3
Lactato NAD+
Cofactor oxidado

NADH + H+
Cofactor reducido

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Ensayo de Lactato Deshidrogenasa: Se puede seguir la formacin de producto formado en tiempo mediante espectrofotometra. De todas las molculas del ensayo slo absorbe el NADH (fig. 1).

Marco A. nkat: nano catal, es una unidad de medida de la cantidad Galleguillos C. de enzima Unidad-2

U=

mmoles de producto minuto

katal =

Moles de producto

segundo

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Cuantificacin enzimtica de la [glucosa] de una muestra biolgica: Se utilizan dos enzimas que transforman la glucosa a un producto medible en el espectrofotmetro a 440 nm

Se espera el tiempo suficiente para que toda la glucosa se haya Marco A. Galleguillos C. al transformado Unidad-2 producto medible