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Biotecnologia Vegetal
Biotecnologia Vegetal
Biotecnologa Vegetal
Ma. Mercedes Rivero
Programa de Biotecnologa para Amrica Latina y el Caribe Universidad de las Naciones Unidas
http://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm
Biotecnologa Vegetal
Cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos micropropagacin mejoramiento de plantas produccin de compuestos de inters comercial produccin de metabolitos secundarios produccin de protenas produccin de polmeros biodegradables establecimiento de plantas transgnicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metablicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composicin de protenas, aceites, etc. fitorremediacin remocin de xenobiticos remocin de metales pesados
Sumario
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales Micropropagacin vegetal Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis Sistemas de micropropagacin vegetal Alcances de la propagacin clonal masiva de plantas Referencias
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciacin / Rediferenciacin
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
La teora de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la rediferenciacin de las clulas previamente desdiferenciadas. Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Micropropagacin vegetal
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperodo.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
La micropropagacin vegetal requiere disponer de una infraestructura mnima especializada y de condiciones controladas de cultivo
Laboratorio
- Area de preparacin de medios. - Area de lavado y esterilizacin. - Cuarto estril. - Cmara de cultivo. - Area de rusticacin.
Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). - Explantes (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc.).
Condiciones de cultivo
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina
Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semislidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite pH 5,6 5,8 Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 minutos en autoclave
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Lquido
El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido).
En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).
El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las siguientes vas:
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Cultivo de tejidos vegetales
Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con una pelcula de polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de gases. La organognesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La induccin de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno. - La acumulacin de etileno puede inhibir la regeneracin de brotes.
pH:
- Constituye un factor crtico. - Se ajusta en el rango 5,5 5,8. - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos vegetales
Auxinas: estos compuestos se emplean bsicamente como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis
OH
Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero qumico responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleptilo de gramneas. - Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventicias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno
Se sintetizan en las yemas, las hojas jvenes, los frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mgKg-1.
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Cultivo de tejidos vegetales
- Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas:
- Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citocininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citocininas endgenas:
- Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) Citocininas sintticas:
Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 gKg-1. Su transporte es no polar.
Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo
Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormancia - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Iniciacin
- Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre - Eleccin del explante inicial y de la formulacin del medio de cultivo - Desinfeccin superficial de los explantes - Establecimiento del cultivo in vitro
Multiplicacin
- Multiplicacin del material stock
Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro
Rusticacin
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Existen dos posibles vas morfogenticas implicadas en la diferenciacin de novo de brotes y/o plantas completas
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Cultivo de tejidos vegetales
Formacin de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernadero
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
ETAPA 3
ETAPA 4
Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
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Cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos vegetales
Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro
Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja, meristemo, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Los meristemos son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos
Constituyen el explante ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.
Meristemos apicales
- Estn localizados en la porcin terminal o distal del vstago y de la raz. - Sus divisiones dan lugar a las clulas de los tejidos pimarios del tallo y la raz. - Son organognicos. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races.
Meristemos secundarios
- Determinan el crecimiento radial de los rganos vegetales. - Dan lugar a los tejidos de conduccin.
Meristemos florales
- Derivan de la transformacin de meristemos apicales. - Se limitan a la produccin de rganos florales. Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
Meristemos intercalares
- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races
El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas
Cultivo de meristemas
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos vegetales
- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin).
- El nmero de partculas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.
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Cultivo de tejidos vegetales
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
Equipamiento
- Elementos generales para cultivo in vitro. - Lupa estereoscpica. - Instrumental de diseccin.
- Regeneracin de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtencin de plantas completas. - Propagacin del material (a partir de estacas uninodales, etc.) - Rusticacin.
La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtencin de plantas sanas depender del tamao del explante. Existe una situacin de compromiso entre el tamao mnimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. Ejemplos prcticos:
- Frutilla (Fragaria sp) / patgeno?: Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas.
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor.
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Cultivo de tejidos vegetales
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no ms de 2 pares de primordios foliares.
Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin
Conservacin de germoplasma
Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal