Preparacin de medios de cultivo. Bacteriologa II.

OBJETIVO El objetivo de la presente prctica es aprender a preparar correctamente los principales de medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de Bacteriologa, como instrumentes de suma importancia en la dignosticacin de bacterias patgenas dentro de los individuos. Asimismo, conocer los diferentes tipos de cultivo, su calcificacin y su importancia en la diagnosticacin. INTRODUCCIN Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas

bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: as, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables macroscpicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. Los requerimientos necesarios para un cultivo de bacterias son: Medio de carbono. Presencia o ausencia de oxigeno. Atmsfera adecuada. Agar-agar. Para un cultivo adecuado de bacterias y microorganismos, se utiliza el agar, un gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso
comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del gnero Gelidium. Se utiliza como agente solidificante en la preparacin de dulces, cremas y lociones, as como en las conservas de pescado y carne; para texturizar y emulsionar los helados y postres congelados; para clarificar, durante el proceso de fabricacin del vino y la elaboracin de la cerveza; y tambin para dar apresto (almidonar) las telas. Adems, es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la accin de la mayora de los microorganismos.

El agar se extrae de las algas marinas hacindolas hervir. Posteriormente, el producto resultante se deja enfriar y secar, y al final se solidifica en pastillas o en escamas. En un principio se llam agar-agar, un trmino que se utiliza en Malasia para denominar a un alga local.

Pero existen diferentes tipos de agar de acuerdo a las especificidades que cada uno tenga, sin embargo cada tipo de agar debe de cumplir con los requerimientos: Fuente de energa.- Las bacterias pueden ser fottrofas o quimiottrofas. Las fotottrofas absorben energa del sol y las quimiottrofas de compuestos orgnicos. Fuente de carbono. Fuente de nitrgeno.- Las bacterias pueden obtener el nitrgeno atmosfrico a travs de las protenas o por la degradacin de aminocidos o pptidos. Azufre y fosfatos.- La obtienen como elemento(S), y como fosfatos en sales (P). Vitaminas. Agua.- Medio de transporte que permite una mejor absorcin de los nutrimentos. Tambin requiere de los requerimientos nutricionales ptimos para su desarrollo: Protenas.Se suministran generalmente peptonas, que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestin parcial de carne con enzimas peptdicas; consisten en polipptidos, dipptidos y aminocidos. Carbohidratos.- Sumistran carbono para la sntesis, y adems su fermentacin libera energa utilizable en el metabolismo. Factores accesorios de crecimiento.Son tambin requerimientos por algunas bacterias. Entre ellos estn las vitaminas del complejo B; estas suministran enzimas necesarias para que las bacterias que son incapaces de sintetizar otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de los nutrimentos ms complejos. Sales minerales.- Elementos como K, Ca, Na, etc.; tambin son requeridas por algunas bacterias en su desarrollo. Atmsfera.- Algunos microorganismos precisan oxgeno para su desarrollo, otros son incapaces de reproducirse en presencia de este elemento, en cambio otros organismos pueden crecer en una atmsfera con oxgeno, logran sobrevivir y crecer sin el, se les llama anaerobios facultativos. Presin osmtica.Las clulas pueden encogerse y ser destruidas en soluciones hipertnicas; inversamente se rompen por entrada de agua, en las soluciones hipotnicas. Temperatura.- La temperatura para la cual los organismos microbianos crecen mejor, es considerada como temperatura ptima.

Luz.- La mayora de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de luz. La luz ultravioleta puede ser letal. Reaccin.- La mayora de las bacterias crece en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2 a 7.6). Los hongos crecen con facilidad en los medios cidos (pH 5). Actualmente existen diferentes formas y mtodos de cultivar en el mercado, ya que pueden cultivarse en placas, tubos etc. Mtodo de placas.El propsito de usar medios slidos pulverizados en cajas petris, consiste en inocular cantidades sucesivas menores de material en el medio, de manera que en algn tiempo sean colocados en una capa tan delgada que les permita el crecimiento de colonias individuales aisladas. Medios inclinados.Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas aisladas, sea para identificacin interior o para base cultivo. Cultivos por agitacin.- Este medio de cultivo es empleado particularmente en el aislamiento de anaerobios esporulado. Se calienta un tubo o botella a 50C y luego se deja enfriar. Cultivos por picadura.- En este mtodo el material de laboratorio es colocado en un alambre recto e introducido al medio. El mtodo puede ser tambin empleado para conservar los cultivos patrn. Cultivos lquidos.- Al inocular en un medio lquido como el agua con peptona o el caldo con tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo. De acuerdo a las especifidades de cada medio pueden clasificarse en: Medios bsicos.- Son los medios ms simples, contienen extracto de carne, peptona, sal y agua. El extracto o infusin de carne proporciona aminocidos, vitaminas, sales y pequeas cantidades de elementos como C, N y otros elementos. Ejem: Agar de infusin, Agar cerebro-corazn. Medios enriquecidos.- Son aquellos medios bsicos que han sido complementados con lquidos corporales, vitaminas especficas, aminocidos, protenas y otros nutrientes. Ejem: Agar sangre y agar chocolate. Medios selectivos.- Son medios de agar bsico, enriquecidos agregndole ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayora de las bacterias y permitiendo el desarrollo de unas cuantas. Ejem: Agar con sangre y bilis al 40%, Agar sal y manitol.

Medios diferenciales.- Son medios a los que se les han agregado ciertos que reaccionan con un tipo especfico de bacterias. Ejem: Agar de McConckey, Agar EMB, Agar XLD. Medios de enriquecimiento.- Son los medios que contienen alguna sustancia inhibidora por lo que se crea un medio favorable para lmites mas estrechos de bacterias. Ejem: Agar S.S., Agar de Lowensten-Jensen. Medios especiales.- Son los medios para comprobar una o ms caracterziticas bioqumicas. Ejem: Agar TSI, Agar CIT, Agar LIA, Agar MIO. PREPARACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS. TSI o KIA. Agar hierro triple azcar. Medio inclinado de color inicial rojo. Estado slido. pH 7.3 + 0.2 Peptona de casina 10 g Peptonas de carne 10 g NaCl 5g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Dextrosa 1g Sulfato de hierro y amonio 0.2g Tiosulfato de sodio 0.2g Rojo de fenol 0.25g Agar 13 g

CIT Utilizacin del citrato. Medio inclinado de color verde. Estado slido. pH 6.9 + 0.2 Fosfato dihidrogenado de amonio Fosfato dipotsico. NaCl Citrato de sodio MgSO4 Agar Azul de bromofenol 1.00 g 1.00 g 5.00 g 2.00 g 0.20 g 15.00 g 0.08 g

LIA Lisina y arginina. Medio inclinado de color violeta. Estado slido. pH 6.7 + 0.2 Peptona de gelatina Extracto de levadura Dextrosa L-Lisina Citrato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromofenol Agar SIM Sulfato, indol y movilidad. Medio plano de color amarillo. Estado semislido. pH 7.3 + 0.2 Peptona de caseina Peptona de carne Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar MIO Movilidad, indol, ortinina. Medio plano de color prpura. Estado semislido. pH 6.5 + 0.2 Extracto de levadura Peptona de gelatina Peptona de caseina L-Ortinina Dextrosa Agar Prpura de bromocresol MATERIAL Y REACTIVOS. 3.0 g 10.0 g 10.0 g 5.0 g 1 g 2 g 0.02g 20 g 6.1g 0.2g 0.2g 3.5g 5g 3g 1g 10 g 0.5g 0.04g 0.02g 13.5g

Matraces de 500 ml. Cajas petri. Soporte universal. Medio nutritivo de agar: Sangre, S 110. EMB Agua destilada. Autoclave. Mechero de Fisher. C O N C L U S I N.

En esta prctica se aprendi la importancia de preparar medios de cultivo, de que materiales pueden ser hechos, los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio, as como su clasificacin, sus caractersticas principales, los distintos tipos que pueden servir para identificar diferentes bacterias, as como las condiciones que estos deben de reunir.

BIBLIOGRAFA

Diagnstico y tratamiento clnicos dados por el laboratorio. John Bernard Henry. Ed. Salvat Pgs. 789 790. Mtodos de laboratorio. Lynch, Raphaell, Mellor, Spare, Inwood. Ed. Interamericana. Pgs. 146 147.