I.

Aminocidos y Protenas
Tema 2: Aminocidos y Pptidos.

Aminocidos
1.-Bifuncionales: Grupos amino y carboxilo. 2.-Proteinognicos, especiales y no proteinognicos. 3.-Nombre trivial por caractersticas u origen. 4.-Primero: Asparagina (1806); ltimo: Treonina (1938) Frmula general (excepto prolina; R: 20 cadenas laterales distintas).
tomo de Carbono en Grupo amino Grupo carboxilo Cadena lateral o residuo

aa: los grupos amino y carboxilo son sustituyentes del carbono en (carbono asimtrico o quiral); 4 sustituyentes distintos, salvo la glicina.

Aminocidos
Enantimeros D y L en aa monoquirales

Ismeros

Proteinognicos

No proteinognicos

Idnticas propiedades fisioqumicas, salvo:

1.-Giro distinto del plano de la luz polarizada. D(+): 14 derecha. L(-): 14 izquierda. 2.-Diferente velocidad de reaccin por especificidad enzimtica.

Clasificacin de los Aminocidos Proteinognicos

Por grupos funcionales de la cadena lateral: Alifticos (cadena lateral hidrofbica): Gly, Ala, Val, Leu, Ile. Aromticos (cadena lateral con grupo fenilo): Phe, Tyr, Trp. Hidroxiaminocidos (cadena lateral con OH): Ser, Thr. Azufrados (cadena lateral con grupo SH): Cys, Met. cidos (cadena lateral con grupo COOH): Asp, Glu. Amidados (amidas de los cidos con cadena lateral con grupo CO NH2): Asn, Gln. Bsicos (cadena lateral con grupo NH2): Lys, Arg, His.
Iminocidos (ciclados): Pro.

Grupos laterales no polares alifticos

Grupos laterales no polares aromticos

Alanina

Valina

Aminocidos componentes de las protenas (por interaccin con el agua a pH fisiolgico)

Fenilalanina

Triptofano

Grupos laterales con carga (+) a pH 7.0

Metionina

Leucina

Isoleucina

Prolina

Grupos laterales polares no cargados

Lisina Serina Treonina Cistena

Arginina

Histidina

Grupos laterales con carga (-) a pH 7.0

Glicina

Tirosina

Asparagina

Glutamina

Aspartato

Glutamato

Aminocidos componentes de las protenas

Aminocidos especiales (modificaciones de los proteinognicos)

N- y O-Glicosilacin de extremos OH Hidroxilaciones, metilaciones, carboxilaciones, etc.

epsilon-N,N,N-trimetillisina 5-hidroxilisina omega-N-metilarginina N,N,N-trimetilalanina

3-metilhistidina epsilon-N-acetillisina N-acetilserina N-formilmetionina

Aminocidos no proteinognicos
, , y aas Precursores metablicos de proteinognicos y especiales. Neurotransmisores (GABA, Serotonina, Dopamina, Acetilcolina, Noradrenalina, Endorfinas, Encefalinas,etc)

Propiedades acido-bsicas de los aminocidos

Sustancia anftera capaz de actuar como cido y como base, segn pH

Zwitterion: Forma dipolar elctricamente neutra (sin desplazamiento en un campo elctrico); posibilidad de cristalizacin.

Propiedades acido-bsicas de los aminocidos

Curva de Titulacin de la Alanina (aa monoamnico monocarboxlico)
A-

+A-=ApKa2= 9.69

pKa1= 2.34 +A=+A-

+A

Carga +1 Zwitterion Carga -1 (Ambos grupos protonados: +A) (Carga cero +A-) (Ambos grupos desprotonados: A-)

Punto Isoelctrico (pI)

Curva de Titulacin de un aa monoamnico monocarboxlico

pKa2

pI

pKa1

Equivalentes de base (OH-)

Para un aa monoamnico monocarboxlico, pI= (pK1+pK2)/2

Curvas de titulacin de aas monoamnicomonocarboxlicos vs aas con cadenas laterales cargadas

Punto Isoelctrico (pI)

Curva de Titulacin de un aa con cadena lateral cargada

El punto isoelctrico pI = (pKa1 + pKa2)/2 es el pH al cual el aminocido monoamnico-monocarboxlico se encuentra en forma de zwitterion. En los aminocidos con un grupo lateral ionizable (R), el pI se define como la media entre pKR y el pKa del extremo carboxlico o del amnico con el valor ms prximo a pKR.

Curvas de titulacin del aminocido Histidina: Capacidad Tampn a pH fisiolgico

Anlisis de aminocidos
Espectros de absorcin (UV 220-280)

Ningn aminocido absorbe en el rango de luz visible y todos absorben en el rango de UV lejano (< 220 nm)

Anlisis de aminocidos: Separacin Cuantitativa y Valoracin

1.- Hidrlisis de protena en HCl a 100 C (salvo Trp; hidrlisis alcalina)
% aminocidos liberados

Tiempo (h)

2.- Separacin de los aas por cromatografa intercambio catinico y reaccin del grupo amino

Reaccin coloreada: Prpura para aminos libres (440 nm). Amarillo para Pro (570 nm)

Anlisis de aminocidos: Separacin Cuantitativa y Valoracin

3.- Cuantificacin e identificacin en analizador de aas (cromatgrafo)

Anlisis de aminocidos: resultado

En este tipo de anlisis se identifican y cuantifican los aminocidos componentes de una protena, pero no su secuencia

Anlisis de aminocidos: Modificaciones de grupos amino libres

Marcaje por extremo amino (aa libre peptido) Seguimiento cromatogrfico

Fluorescamina

Aminoderivado fluorescente

Marcaje por extremo amino (aa libre peptido)

Cloruro de Dansilo

Cloruro de Dabsilo

Anlisis de aminocidos: Modificaciones de grupos laterales SH y OH

1A. Puentes disulfuro. Oxidacin en presencia de O2 y sales de Fe2+ u otros oxidantes suaves. Mercptidos con metales pesados. 1B. Reaccin con reactivo de Ellman: medicin por colorimetra.

2. Fosforilacin.

Cromatografa en papel de aminocidos

Monodimensional

Fases Inerte (papel), Estacionaria (agua) y Mvil (disolvente apolar, p.ej. hexano)

Cromatografa en papel de aminocidos

Monodimensional
Cabina de cromatografa Clculo del RF (coeficiente de reparto): cuantifica la hidrofobicidad lipofilia del aminocido

Pulverizacin con ninhidrina para revelar la cromatografa

Cromatografa en papel de aminocidos

Bidimensional

Separacin de aminocidos
Cromatografa en capa fina
Aade retencin en fase inerte (gel de slice)

Cromatografa gas-lquido
Derivado del aa en forma voltil

Separaciones ms eficaces por precisar menor cantidad de muestra inicial

Separacin de aminocidos

(Ejemplo: intercambio aninico)

Pasos a seguir: Lavar, equilibrar, pasar la muestra, lavar, eluir con tampn, regenerar

Separacin de aminocidos
(Ejemplo: intercambio catinico)

Aas cargados positivamente se unen a la matriz cargada negativamente

Pasar aas a pH 3.0 tras equilibrar con Na+

Aas cargados negativamente son eludos de la columna

Pasos a seguir: Lavar, equilibrar, pasar la muestra, lavar, eluir con tampn, regenerar

Separacin de aminocidos
Electroforesis en papel

El NODO es el polo hacia el que se dirigen los ANIONES: El nodo es el polo positivo, por que los aniones tienen carga negativa.

El CTODO es el polo hacia el que se dirigen los CATIONES: El ctodo es el polo negativo, por que los cationes tienen carga positiva.

pI < pH

pI > pH

pI < pH: aa con carga pI > pH: aa con carga +

El enlace peptdico

Linus Carl Pauling (en 1931)

Conciencia Ecolgica en la dcada de los 50 del siglo XX

Prototipo de coche elctrico

Henney Kilowatt (Fabricante: Eureka Williams)

Linus Carl Pauling (en 1954)

Enlace peptdico: doble enlace parcial con momento dipolar.

Aminocidos

Dipptido

Enlace peptdico: doble enlace parcial con momento dipolar.

Pptidos: Polimerizacin

Reacciones de condensacin (prdida de una molcula de H2O)

Sntesis de un polipptido

Nomenclatura de los pptidos

Protenas: ms de 50 aminocidos. Pptido: hasta 50 aminocidos. Oligopptido: pptido pequeo. Polipptido: pptido grande.

Enlace peptdico: caractersticas y resonancia.

Enlace peptdico Enlace peptdico

R R

Resonancia

60%

40%
Ms largo que el peptdico Ms corto que el peptdico

Frmula del pptido ms sencillo: glicil-glicina

Los anlisis de difraccin de sus cristales permitieron determinar: -La longitud del enlace peptdico -Que los cuatro tomos implicados (C, N, O y H) estn dispuestos en un mismo plano: plano de la amida.

Dos glicinas

Glicil-glicina y agua

Enlace peptdico

Difraccin de Rayos X

Caracterizacin del enlace peptdico (cristales de glicil-glicina)

Enlace peptdico: plano ptico.

Configuracin Cis o Trans?

O C C R2 N

R3 C C O N C R4

N C O

Planos peptdicos con enlaces configurados en trans

Enlace peptdico: Configuracin trans da mxima estabilidad.

Enlace peptdico

Rotacin reducida de la cadena polipeptdica

Hay rotacin alrededor de los enlaces C-CO y C-N: ngulos didricos Phi y Psi (valores tericos entre -180 y +180 desde el C hacia el ngulo). Determinan la geometra peptdica. Existen restricciones al giro (Ramachandran) Estructura covalente de la cadena polipeptdica como serie de tetraedros planos unidos por los vrtices (C)

ngulo Psi

ngulo Phi

Enlace peptdico: Diagramas de Ramachandran.

El enlace peptdico posee plasticidad

Variacin de ngulo de enlace hasta 5 y variaciones de longitud hasta 0,05 A, en respuesta a variaciones estructurales debidas a los aas componentes de la cadena polipeptdica:

1.-Glicina: incrementa flexibilidad (por su estructura). 2.-Prolina: provoca cambios bruscos en la direccin de la cadena (por su estructura). 3.-Aas con ramificaciones en carbonos , y aas aromticos: restringen grados de libertad de la cadena por que no pueden formar puentes de hidrgeno (hidrofbicos; orientados posteriormente hacia el interior de la protena). 4.-Aas que forman puentes de hidrgeno y Cys (forma puente disulfuro): relajan tensiones del plegamiento proteico. 5.-Aas con carga neta: Implicados en solubilidad proteica, y en centros activos y/o de reconocimiento.

Secuencia lineal

Niveles de organizacin de las protenas

Disposicin local del esqueleto polipeptdico ( y )

Estructuras tridimensionales funcionales

Pptidos naturales
Antibitico Agente reductor

Neuropptidos analgsicos

Hormonas

Sntesis de pptidos en fase slida.

1.-Unin del aa carboxilo terminal a la matriz. 2.- Proteccin de los grupos reaccionantes, excepto los del enlace peptdico (activados). 3.- Reaccin de condensacin. 4.- Lavado y progreso con el siguiente aa. 5.- Separacin del pptido final de la fase slida

Protenas

Modelo de la Hemoglobina dibujado a mano por Max Ferdinand Perutz (1953)

Clasificacin de las protenas

1.- Por composicin: simples (holoprotenas, slo aas) y conjugadas (heteroprotenas: grupo proteico y grupo prosttico). 2.- Por estructura tridimensional (conformacin): fibrosas (ricas en estructuras secundarias; con funciones estructurales) y globulares (tridimensionales, solubles). 3.- Atendiendo a su funcionalidad: Enzimas, Transporte y almacenamiento, Movimiento, Defensa, Generacin y transmisin de informacin, Crecimiento y diferenciacin y estructurales.

Colgeno (fibrilar)

Protenas
Mioglobina (Globular monomrica)

Receptor humano de IGF-1 (Transmembrana)

Piruvato quinasa (Globular homotetramrica)

Hemoglobina (Globular heterotetramrica)

Tcnicas de purificacin: Solubilidad (Salting-In y Salting-Out)

I=

(Ci x Zi2)

I = Fuerza inica de la sal. Ci = Concentracin de in. Zi = Carga del in.

Purificacin por carga elctrica

Intercambio inico
Intercambio Catinico Intercambio Aninico

Intercambio Aninico: Animacin

Separacin por carga elctrica

Electroforesis

Log10kDa

Distancia (cm)

Purificacin por tamao molecular

Ultrafiltracin (5-500 kDa) Dilisis

Purificacin por tamao molecular

Exclusin molecular

Cromatografa por Filtracin en Gel

Animacin

Purificacin por otros mtodos

Cromatografa de afinidad

Cromatografa de Afinidad: Animacin

Purificacin por otros mtodos

Cromatografa en fase reversa

Cromatografa de Fase Reversa Animacin

Cuantificacin: Espectrofotometra

Secuenciacin de pptidos

1er paso: purificar y cuantificar la protena. 2do paso: Rotura de los puentes disulfuro con cido frmico (Sanger) y anlisis de los aminocidos de la protena.

3er paso: determinar los extremos amino y carboxilo de la protena

Determinacin del extremo carboxilo por hidrazinolisis (hidrazina y 100 C)

El extremo carboxilo es el nico no derivado Determinacin del extremo amino por marcaje e hidrlisis posterior

1-Fluoro, 2-4 dinitrobenceno

Cloruro de Dansilo

(Reaccin de Sanger)

+
Cloruro de Dabsilo

4 paso: Rotura especfica en pptidos. 5 paso: separacin cromatogrfica de cada pptido y anlisis cuantitativo de cada pptido.

Secuenciacin de pptidos: Reaccin de Edman (sin hidrlisis del pptido).

Degradacin Edman: Animacin

Secuenciacin de pptidos: Resumen.

Estudios comparativos de las secuencias peptdicas

Actin, structural protein involved in cell polarization, endocytosis, and other cytoskeletal functions; Act1p [Saccharomyces cerevisiae]. 375 aa.
mdsevaalvi iehgivtnwd slyssgrttg dikeklcyva simkcdvdvr tfqqmwiskq dngsgmckag dmekiwhhtf ivldsgdgvt ldfeqemqta kelygnivms eydesgpsiv fagddaprav ynelrvapee hvvpiyagfs aqsssieksy ggttmfpgia hhkcf fpsivgrprh hpvllteapm lphailridl elpdgqviti ermqkeital qgimvgmgqk npksnrekmt agrdltdylm gnerfrapea apssmkvkii dsyvgdeaqs qimfetfnvp kilsergysf lfhpsvlgle apperkysvw krgiltlryp afyvsiqavl sttaereivr sagidqttyn iggsilaslt

Comparacin con actinas de mamferos: MUY ALTA CONSERVACIN EVOLUTIVA

Comparacin de -actina de S. cerevisiae con -actina de Homo sapiens

Identities = 333/375 (88%), Positives = 360/375 (96%) Query: Sbjct: Query: Sbjct: 1 MDSEVAALVIDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGIMVGMGQKDSYVGDEAQS 60 MD ++AALV+DNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQG+MVGMGQKDSYVGDEAQS 1 MDDDIAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQS 60 61 KRGILTLRYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPMNPKSNREKMT 120 KRGILTL+YPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAP+NPK+NREKMT 61 KRGILTLKYPIEHGIVTNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLNPKANREKMT 120

Query: 121 QIMFETFNVPAFYVSIQAVLSLYSSGRTTGIVLDSGDGVTHVVPIYAGFSLPHAILRIDL 180 QIMFETFN PA YV+IQAVLSLY+SGRTTGIV+DSGDGVTH VPIY G++LPHAILR+DL Sbjct: 121 QIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAILRLDL 180 Query: 181 AGRDLTDYLMKILSERGYSFSTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMQTAAQSSSIEKSY 240 AGRDLTDYLMKIL+ERGYSF+TTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEM TAA SSS+EKSY Sbjct: 181 AGRDLTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMATAASSSSLEKSY 240 Query: 241 ELPDGQVITIGNERFRAPEALFHPSVLGLESAGIDQTTYNSIMKCDVDVRKELYGNIVMS 300 ELPDGQVITIGNERFR PEALF PS LG+ES GI +TT+NSIMKCDVD+RK+LY N V+S Sbjct: 241 ELPDGQVITIGNERFRCPEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMKCDVDIRKDLYANTVLS 300 Query: 301 GGTTMFPGIAERMQKEITALAPSSMKVKIIAPPERKYSVWIGGSILASLTTFQQMWISKQ 360 GGTTM+PGIA+RMQKEITALAPS+MK+KIIAPPERKYSVWIGGSILASL+TFQQMWISKQ Sbjct: 301 GGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQ 360 Query: 361 EYDESGPSIVHHKCF 375 EYDESGPSIVH KCF Sbjct: 361 EYDESGPSIVHRKCF 375

Comparacin con actinas de mamferos: La mayora de los aas son idnticos

Gastric inhibitory polypeptide precursor (GIP) (Glucose-dependent insulinotropic polypeptide). Rattus norvegicus. 144 aa.
mvalktcsll lvllflavgl gekeevefrs hakfagprpr gpryaegtfi sdysiamdki rqqdfvnwll aqkgkkndwk hnltqreara lelagqsqrn eekeaqgssl pkslsdedvl rdlliqella wmadqaelcr lrsq

Comparacin con Gip de vertebrados

Comparacin de Gip de Rata con protena similar al polipptido gstrico inhibitorio [Gallus gallus]
Identities = 43/123 (34%), Positives = 62/123 (50%), Gaps = 19/123 (15%) Query: 36 GPRPRGPRYAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNLTQREARALELAG 95 G RP RY+E T SDYS MD + +++FV WLLA++ KK+D +REA A Sbjct: 32 GARPMHRRYSEATLASDYSRTMDNMLKKNFVEWLLARREKKSDNVIEPYKREAEPQLSAV 91 Query: 96 QSQ----RNEE-----------KEAQGSSLPKSLSDEDVLRDLLIQELLAWMADQAELCR 140 Q R+ E KE Q S+ SL + ++D++ QE L + +LCR Sbjct: 92 SDQSLDPRSHEAKDFLAWLLKAKENQSSA---SLEGSEDVKDVVNQEFLTLLM-STDLCR 147 Query: 141 LRS 143 R+ Sbjct: 148 PRA 150

Alejamiento evolutivo, pero con conservacin de funcin: aas identicos y aas conservados

Mioglobina vs Hemoglobina
Hemoglobina (Globular heterotetramrica)

Mioglobina (Globular monomrica)

Comparacin de mioglobina con hemoglobina (H. sapiens)

Identities = 39/148 (26%), Positives = 59/148 (39%), Gaps = 6/148 (4%) Mioglobin (query): 153 aa; -Hemoglobin type 1 (Subject): 142 aa

Query: 1 MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 60 M LS + V WGKV A +G E L R+F P T F F D S Sbjct: 1 MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF------DLSHGSA 54 Query: 61 DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH 120 +K HG V AL + + L+ HA K ++ + +S C++ L + Sbjct: 55 QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL 114 Query: 121 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYK 148 P +F +++K L + S Y+ Sbjct: 115 PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR 142

Misma funcin, pero conservacin slo de los aas clave en formar el bolsillo hidrofbico y de las histidinas proximal y distal.

Taxonoma Molecular
Query: 1 MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 60 M LS + V WGKV A +G E L R+F P T F F D S Sbjct: 1 MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF------DLSHGSA 54 Query: 61 DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH 120 +K HG V AL + + L+ HA K ++ + +S C++ L + Sbjct: 55 QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL 114 Query: 121 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYK 148 P +F +++K L + S Y+ Sbjct: 115 PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR 142

Evolucin segn la secuencia de los citocromos C

Comparacin de secuencias de los citocromos C (transportador electrnico mitocondrial entre los complejos respiratorios III y IV)