UNIVERSIDAD DE CHILE - FACULTAD DE MEDICINA LABORATORIO BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION fono (2)9786305 - 9786450------------------------------------------------------

AYUDA PRCTICA PARA EL ANLISIS DEL SEMINOGRAMA Profesor asistente Luis Sarabia Villar Enero 2005

En la dcada del 50 aparecen las importantes contribuciones de Mac Leod donde comparaba los resultados obtenidos del anlisis seminal de personas frtiles con los obtenidos de pacientes con problemas para concebir un hijo. Se comprob una fuerte correlacin entre la movilidad y fertilidad potencial y que la probabilidad de la concepcin dependa del porcentaje de clulas activas y de la calidad de la movilidad, Mac Leod y Gold encontraron que por encima de 20 millones por ml. no haba aumento de la fertilidad potencial. De sus trabajos surgen las condiciones mnimas que debe reunir un esperma para ser considerado con capacidad fecundante. Sin embargo en base a estos valores lmites, debe tenerse en cuenta que si algn resultado es inferior al valor mnimo correspondiente, debe compensarse con un aumento correlativo de otro y que siempre se habla en trmino de probabilidad para que un apareja conciba un hijo. El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones que provienen del testculo y epiddimo, las que se combinan al momento de la eyaculacin con las secreciones de la prstata, vesculas seminales y glndulas bulbo uretrales. El anlisis del semen provee informacin sobre la condicin clnica del individuo. RECOLECCION DE LA MUESTRA Y ENTREGA Las indicaciones se deben entregar al paciente en forma escrita u oral, de una forma clara, en lo referente a la recoleccin y transporte del semen. El manejo de la muestra debe ser muy cuidadoso en el laboratorio, ya que toda muestra biolgica puede ser potencialmente peligrosa por la presencia de virus y bacterias patgenas. a. La muestra debe ser recolectada despus de un mnimo de 2 das de abstinencia sexual, pero no mas all de los 7 das de abstinencia. Se debe procurar que el tiempo de abstinencia sea registrado en das para estandarizar los protocolos de trabajo. La abstinencia debe ser valorada de acuerdo a la frecuencia de las relaciones sexuales en la pareja. Con un menor perodo de abstinencia a la media sexual, se puede producir una disminucin en la densidad espermtica o del volumen seminal. Con una abstinencia mayor a los 7 das, se puede ver incrementado el nmero de espermatozoides inmviles y morfolgicamente alterados. Episodios febriles, intervenciones quirrgicas o tratamientos farmacolgicos recientes deberan aplazar el espermiograma hasta despus de 70 das (ciclo espermatognico). b. Dos muestras son necesarias para una evaluacin inicial. El intervalo entre cada toma de muestra no debe ser menor a 7 das ni mayor a 3 semanas. Si los resultados entre ambas muestras son marcadamente diferentes, muestras adicionales deben ser evaluadas.

c. Idealmente, la muestra debe ser recolectada en un ambiente privado cerca al laboratorio. Si no es posible, la muestra debe ser entregada al laboratorio dentro de la primera hora despus de ser emitida. La movilidad espermtica declina con el tiempo y las variaciones de temperatura. d. La muestra se obtiene por masturbacin. El eyaculado se recoge en un frasco limpio, estril, de boca ancha. Se debe mantener la temperatura entre los 18 y 22C a temperaturas inferiores a 5 C los espermatozoides experimentan el Schock termico que se caracteriza por la disminucin de la movilidad de manera irreversible por lo tanto en poca de intenso fro se le recomienda al paciente que tempere el frasco previamente y lo mantenga entre 18 y 37C (si la muestra se obtiene fuera del laboratorio). Si se va a realizar un anlisis microbiolgico de la muestra, el paciente debe orinar primero, luego debe lavarse y secarse las manos y el pene para posteriormente eyacular. e. Cuando la muestra no se puede recolectar por masturbacin se debe utilizar un condn especial para recoleccin de semen. Ningn otro tipo de condn es recomendable. El coitus interruptus no es un medio adecuado para recolectar la muestra. f. La recoleccin de la muestra debe ser completa. Es importante sealar que la primera porcin del eyaculado emitido es la que contiene la mayor concentracin de espermatozoides 75 % aproximadamente, y por esta razn es importante que no se pierda, de lo contrario se pide una nueva muestra para realizar el anlisis con el mismo rango de abstinencia antes sealada, las ltimas porciones eyaculadas se caracterizan porque predominan los espermatozoides inmviles y de mala morfologa. g. El frasco de recoleccin debe ser adecuadamente rotulado con los datos del paciente, con la fecha y la hora de recoleccin de la muestra y en presencia del paciente para evitar posteriores errores de rotulacin.

Los pasos bsicos en el anlisis del semen son los siguientes: 1.- A los 0-5 minutos despus de emitida la muestra, se registran correctamente los datos del paciente y se coloca en una incubadora a 37C. hasta que lice 2.- A los 20-25 minutos, se evala la licuefaccin, la apariencia visual y el olor. 3.- A los 30-60 minutos, se evala la viscosidad, la movilidad espermtica , la agregacin/aglutinacin espermtica, otros tipos celulares y el debris. Se realizan los test para anticuerpos. Se evala la vitalidad espermtica. Se hacen las diluciones para determinar la concentracin espermtica. Se separan 100 l de semen para evaluar clulas inflamatorias. Se tien las lminas para evaluar la morfologa espermtica. Se recupera y centrifuga el semen para el anlisis bioqumico posterior si corresponde. 4.- Mas tarde, se hace el recuento de espermatozoides en una cmara Neubauer. Si hay un nmero > a 1 x 106 clulas redondas/ml en el semen, se hace una evaluacin de clulas inflamatorias. Se realiza el anlisis bioqumico de las secreciones de la prstata (zinc), vescula seminal (fructuosa) y epiddimo (-glucosidasa). Se tien los frotis para evaluacin de la morfologa. Se evala la morfologa.

MANIPULACION DE LA MUESTRA Las muestras de semen pueden tener agentes infecciosos peligrosos (VIH, hepatitis, herpes, gonorrea, sfilis, etc.). La utilizacin de vestimenta adecuada, guantes, as como evitar cualquier contacto directo con la muestra por parte del personal debe ser de estricto cumplimiento.

EXAMEN MACROSCOPICO Rango de Valores Normales Segn O.M.S,1999 Entre parntesis se indica el rango de valores ms frecuentes. VOLUMEN: 2.0 ml (2.0-6.0 ml.) Se determina una vez finalizado el examen en un tubo graduado con una aproximacin de 0.1 ml. Cuando el volumen es muy pequeo se informa sin medirlo, como menor de 0.5 ml. Es frecuente el hallazgo de volmenes aumentados. En nuestro laboratorio hemos encontrado pacientes con volmenes entre 9 y 13 ml. Y dos casos de pacientes con 18 y 19 ml de eyaculado. pH: 7.2 (rango 7.2-8.0, el pH puede ser m.s alcalino y no necesariamente significa anormalidad). A medida que transcurre el tiempo la muestra se va alcalinizando por prdida de anhdrido carbnico. LICUEFACCIN: Tiempo normal entre 15-60 minutos a 37 C. Hacia los 30 minutos la muestra debera estar licuada. El semen normal puede contener cuerpos gelatinosos que no se licuan. La presencia de moco puede interferir en el anlisis. Una vez licuada la muestra, se debe mezclar suavemente el semen con un movimiento rotatorio para reducir el error en la determinacin de la concentracin espermtica.

APARIENCIA, COLOR, OLOR: Deben ser evaluados a temperatura ambiente, dentro de la primera hora despus de emitida la muestra. Una muestra normal tiene una apariencia homognea, un color blanco opalescente a gris amarillento y un olor caracterstico. (Se informa como normal). Aspecto: Un aspecto translucido se relaciona con una baja concentracin espermtica y no hay clulas de la espermatognesis, leucocitos hemates o grmenes y un aspecto heterogneo se observa cuando queda material sin licuar. Color: Amarillo intenso en los casos que hay leucocitos (piospermia), herrumbre indica presencia de sangre hemolizada (vesiculitis o prostatitis), rojo indica presencia de sangre ( hemospermia por traumatismo o neoplasia de las vas seminales). Casi siempre se debe a una afeccin banal denominada hemosperma cronica y un color verdoso se correlaciona con infeccin de pseudomonas. Olor: Un olor fecal indica la presencia de E.coli.

CONSISTENCIA: La viscosidad, est en relacin a cmo fluye la muestra desde una pipeta. La muestra debe caer en forma de pequeas gotas. Si se forma un hilo al caer la muestra desde la pipeta se dice que hay una viscosidad anormal (filancia). Cuando el hilo que se forma es > de 2 cm, se dice que hay una viscosidad elevada.

EXAMEN MICROSCPICO ( 30 a 60 minutos post eyaculacin) CONCENTRACION DE ESPERMATOZOIDES: 20 x 106 espermatozoides/ml.; 40 x 106 espermatozoides por eyaculado o ms (OMS, 1999). MOVILIDAD: > 25% con movilidad progresiva (tipo A); 50% de mviles (tipos A ms B) (OMS, 1999). Se evala la movilidad 60 minutos despus de eyaculada la muestra, se cuentan al menos 200 espermatozoides. VITALIDAD: 50% de espermatozoides vivos (no coloreados) (OMS, 1999). Se evala inmediatamente despus de teir con Eosina. Recuento de 200 espermatozoides. CELULAS REDONDAS: 5x 106 clulas/ml. LEUCOCITOS: 1 x 106 leucocitos/ml CELULAS GERMINALES INMADURAS: 1-3% con respecto a 100 espermatozoides. MORFOLOGA: 15 % de formas normales (la tendencia es hacia la disminucin de este porcentaje). Este valor est sujeto a estudios multicntricos que realiza la OMS. Sin embargo, se sugiere que cada laboratorio estandarice sus propios valores de referencia.

PREPARACION DE LA MUESTRA PARA EL ANLISIS DEL SEMEN EXAMEN DENTRO DE LA HORA La muestra debe ser colocada inmediatamente a una temperatura de 37 C hasta la licuefaccin de esta. Un volumen de 10 l. de semen es adecuado para ser colocado en una lmina portaobjeto y cubierto con una lmina cubreobjeto de 22 mm x 22 mm de esta manera el cubreobjeto queda perfectamente adherido al porta. Se determina la concentracin de espermatozoides, la calidad de movimiento, la presencia de clulas redondas, aglutinacin y el debris (que corresponde generalmente a desechos de fragmento celulares). Esto nos dar una idea de cmo proceder con respecto a las diluciones para los anlisis, que incluye recuento en cmara, viabilidad espermtica, con qu volumen hacer el frotis etc. Si la temperatura ambiente es inferior a 22 C debe colocarse previamente los portaobjetos y cubreobjeto a 37 C durante 15 minutos. Si en el primer anlisis no se observan espermatozoides ni clulas de la espermatognesis, se centrfuga el semen y con el sedimento se hacen preparados para teir e identificar la

presencia de espermatozoides o clulas de la espermatognesis. Idealmente se centrfuga a 1500g durante 15 minutos y si an as no se encuentran estas clulas se informa de la siguiente manera: En el sedimento de la muestra centrifugada a 1500g durante 15 minutos, no se observaron espermatozoides o clulas de la espermatognesis.

ANLISIS DE LA VITALIDAD: La vitalidad espermtica est en relacin a la proporcin de espermatozoides que estn vivos y se determina por la observacin de aquellos espermatozoides que no se colorean con eosina o que se hinchan en el test hipoosmtico. Esta prueba debe ser utilizada si el porcentaje de espermatozoides inmviles excede el 50%. La proporcin de espermatozoides vivos puede ser determinada utilizando tcnicas de tincin las que se basan en el principio de que las clulas muertas con una membrana plasmtica daada toman ciertos colorantes. Para esta evaluacin se utiliza una solucin de eosina 0.5% en PBS pH 7.1. Se mezcla una gota de eosina con una gota de muestra de semen y se evala inmediatamente al microscopio. Se deben contar 200 espermatozoides diferenciando los espermatozoides vivos (no teidos) de los espermatozoides muertos (teidos). ANLISIS DE LA MOVILIDAD: Se pueden trabajar con volmenes entre los 8-10 l. Se debe evitar que haya demasiado volumen entre las lminas para que el desplazamiento de los espermatozoides sea homogneo y en lo posible en una monocapa. La temperatura de evaluacin ideal es de 37 C, pero se puede trabajar a temperatura ambiente, entre 20 y 24 C. Es importante estandarizar las condiciones de temperatura para el trabajo. Se deben contar no menos de 200 espermatozoides. Los tipos de movilidad a evaluar son los siguientes: Tipo A: Progresivo rpido Tipo B: Progresivo lento Tipo C: No progresivo Tipo D: Inmvil Los espermatozoides tipo A y B son los que se cuentan primero, los del tipo C y D se cuentan despus en el mismo campo los valores se informan en porcentajes. El contaje de las formas mviles debe hacerse rpidamente, de lo contrario hay tendencia de contar ms mviles, debido a que se cuenta los mviles ms los que van entrando en el campo. En muy pocas oportunidades hemos observado hipercinesis, que se caracteriza por movimientos sumamente enrgicos y desordenados de los espermatozoides.

ANALISIS DE LA CONCENTRACION ESPERMTICA: La concentracin se mide utilizando un hemocitmetro de Neubauer, mejor an con cmara Makler que no requiere dilucin y se puede determinar la calidad de la movilidad a la vez. Las diluciones pueden ser 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 (para un volumen final de 100 l). El diluyente es preparado adicionando al agua destilada 50 g de bicarbonato de sodio, 10 ml 35% (v/v) de formalina y 0.25 g de azul tripn o 5 ml de una solucin saturada de violeta de genciana, para un volumen final de 1 litro. Otra solucin de dilucin es formalina al 1% con 5 gr. de bicarbonato de sodio para un volumen final de 100 ml. Se deben transferir aproximadamente 15 l. de la dilucin hacia la cmara de recuento, pero lo ms importante es que la cmara quede completamente llena pero no en exceso para evitar que la lmina que la cubre se mueva por accin de la dilucin transferida. La muestra se debe dejar sedimentar (2 a 3 minuto), y debe ser conservada en una cmara hmeda para prevenir la evaporacin, hasta el momento de realizar el recuento. El recuento debe ser de espermatozoides completos (cabeza y cola). Las cabezas sueltas deben ser contadas por separado.

El hemocitmetro de Neubauer contiene 25 cuadrculas grandes que se denomina en conjunto retculo de Thomas, cada cuadrcula grande contiene 16 cuadrculas ms pequeas. Si un espermatozoide se ubica sobre la lnea que divide dos cuadrculas adyacentes, debe ser contado solamente si est en la lnea inferior o hacia la lnea del lado izquierdo de la cuadrcula a ser evaluada, si las retculas tienen lneas triples la misma regla se conserva pero para la lnea central . Recuentos por duplicado de 200 espermatozoides se deberan realizar para tener un error de conteo bajo. A fin de determinar la concentracin de los espermatozoides en la muestra original de semen en millones/mL, el nmero promedio de espermatozoides es multiplicado por el factor de conversin apropiado. Si la dilucin es 1/5, y se han contado las 25 cuadrculas, entonces se multiplica el nmero de espermatozoides en las 25 cuadrculas, por 5 y por 10.000 (50.000). Si la dilucin es 1/5, y se han contado solo 5 cuadrculas, entonces se multiplica el nmero de espermatozoides registrados en las 5 cuadrculas por 5 ( representa los 25 cuadrantes), por 5 ( dilucin) y por 10.000 ( cmara).

Recuento en cmara Makler La cmara Makler presenta la ventaja de trabajar con muestra sin diluir lo que evita este factor de error y adems se puede determinar los distintos grados de movilidad a la vez, lo que ahorra tiempo al personal del laboratorio. Para determinar la concentracin se cuenta las 100 cuadrculas y se multiplica el resultado por 100.000, para expresar la concentracin espermtica en millones/mL.

Conteo de otras clulas diferentes a los espermatozoides: La concentracin de estas clulas (leucocitos, clulas germinales inmaduras, otros tipos celulares) se puede estimar de la siguiente manera. Se cuentan las clulas en los cuadrados que estn ubicados en las esquinas del retculo de Thomas. Cada cuadrado tiene un volumen de 0.1ml3 pero representan un valor de 1 ml. El conteo que resulta en los 4 cuadrados se divide entre 4 y se multiplica por el factor de dilucin para obtener el nmero de clulas por ml de muestra. De otra forma, si N es el nmero de un tipo celular dado en el mismo campo como 100 espermatozoides y S es la concentracin de espermatozoides en millones/ml, entonces la concentracin C de un tipo celular dado en millones/ml puede ser calculada con la siguiente frmula: C=(NxS)/100 As, si el nmero de clulas germinales inmaduras o leucocitos contados es 10 por 100 espermatozoides y el recuento de espermatozoides es 120 x 106/ml, la concentracin de dichas clulas es 10 x 120x106 / 100 = 12 millones /ml.

Determinacin ptima de Leucocitos y clulas redondas Para la determinacin de leucocitos peroxidasa positivos se utiliza una solucin de agua oxigenada 10-30% (100 l) mezclada con una solucin de ortotoluidina 0.15% (900 l), en una relacin 1:10. De esta mezcla, se toman 900 l. a los que se agregan 100 l de muestra de semen (relacin 1:10). La solucin final se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Los leucocitos peroxidasa positivos dan una coloracin marrn, y se registran como positivos para la reaccin. Este recuento es til para diferenciar los leucocitos peroxidasa positiva (Macrfagos y Neutrfilos) de otros tipos de clulas redondas y se cuentan en cmara de Neubauer o Makler.

EVALUACION DE LA MORFOLOGA ESPERMTICA Al menos dos extendidos deben ser preparados de la muestra de semen. Las lminas deben ser limpiadas adecuadamente, lavadas en etanol al 100% y secadas al aire, antes de que una pequea gota de semen (5-20 l.) sea colocada sobre su superficie. Hay que considerar que la viscosidad del semen puede estar aumentada dificultando as el extendido de la muestra sobre la lmina. El extendido debe bien delgado para que se seque rpidamente, no debe emplearse calor para el secado ya que produce el enroscamiento de las colas y alteraciones de cabeza. Adems, el semen tiene mucus que al exponerse al calor enturbia toda la muestra haciendo difcil observar los espermatozoides, por ende se deja secar al aire y se sigue el siguiente protocolo:

TINCIN DE PAPANICOLAOU MODIFICADO Etanol 50% por 10 segundos

Agua destilada por 10 inmersiones Hematoxilina de Harris por 10 segundos Agua corriente por 5 minutos Etanol cido (0.25% HCl in 70% de etanol) por dos inmersiones Agua corriente por 5 minutos Agua destilada por 1 inmersin Etanol 50% por 10 inmersiones Etanol 70% por 10 inmersiones Etanol 80% por 10 inmersiones Etanol al 95% por 10 inmersiones Eosina por 2 minutos Etanol 95% por 10 inmersiones Etanol 95% por 10 inmersiones EA-50 por 5 minutos Etanol 95% por 5 inmersiones Etanol 95% por 5 inmersiones Etanol 95% por 5 inmersiones Etanol 98-99.5% (etanol absoluto) por 2 minutos Montaje de la lmina El protocolo tradicional de fijacin y tincin de espermatozoides es de la siguiente manera: Etanol al 70 - 80 % por 1 minuto Se fija la muestra para evitar que la exposicin de los espermatozoides al ambiente (temperatura, humedad, etc.) provoque una deformacin que altere la lectura correcta de la morfologa. 10 segundos en Hematoxilina 5 - 10 minutos en agua corriente 1 minuto en agua destilada 2 minutos en Eosina Un enjuague con agua destilada 1 minuto aprox. Secar, poner cubre objeto, observar al microscopio con aceite de inmersin.

COLORACION DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA MAY-GRUNWALD : AZUR II- EOSINA GIEMSA : AZUL DE METILENO-EOSINA

1.-PROCEDIMIENTO PARA ESPERMATOZOIDE Colocar una capa fina de MAY-GRUNWALD sobre un frotis durante 4 minutos Enjuagar con agua destilada Colocar un acapa de Giemsa diluido 1:10 en agua destilada durante 15 minutos Enjuagar con agua destilada Secar y montar 2.-PROCEDIMIENTO PARA CELULAS GERMINALES IDEM SOLO CAMBIAR LA DILUCION DEL GIEMSA A 1:20

NUCLEO : AZUL-VIOLACEO CITOPLASMA : ROSA Se cuentan 200 espermatozoides clasificndolos como normales o anormales. Las clulas de la espermatognesis halladas al contar los espermatozoides se informan aparte.

Nomenclatura para algunas variables seminales

Normozoospermia:

Eyaculado normal definido por los valores de referencia.

Oligozoospermia: Concentracin espermtica menor a los valores de referencia. Astenozoospermia: Movilidad menor al valor de referencia. Teratozoospermia Morfologa menor al valor de referencia. Oligoastenoterato Significa alteraciones en tres variables zoospermia: (Combinacin de 2 prefijos tambinse usar) Azoospermia: Ausencia de espermatozoides en el Eyaculado Aspermia Ausencia de eyaculado

Bibliografa WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction Fourth edition 1999