PROTOCOLO CLULAS COMPETENTES.

1) Crecer clulas en un tubo con 3 ml de medio de cultivo LB en agitacin constante durante toda la noche a 37 C. 2) Transferir los 3 ml de cultivo celular a 50 ml de medio LB y crecer nuevamente hasta alcanzar una OD de 0.5. 3) Enfriar el cultivo en hielo durante 10 minutos. 4) Transferir a tubos estriles 12 ml del cultivo celular. 5) Centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos. Eliminar sobrenadante. 6) Resuspender las clulas en CaCl2 100mM, adicionando 5 ml de CaCl2 a cada tubo. (se recomienda usar CaCl2 frio). 7) Una vez resuspendidas las clulas adicionar 7 ml de CaCl2 100mM (4 C) a cada tubo. (12 ml volumen final en cada tubo). 8) Incubar en hielo durante 30 minutos. Posteriormente centrifugar a 4.000 rpm por 5 minutos. Eliminar sobrenadante. 9) Resuspender el total de clulas recolectadas en 5 ml de CaCl2 100mM (4 C). Esto es agregando al primer tubo 5 ml de CaCl2, luego recuperar estos 5 ml y adicionarlos al siguiente tubo y as sucesivamente, hasta recolectar el total de clulas en solo 5 ml de CaCl2. 10) Finalmente almacenar las clulas a 80 C en glicerol. (30 l de glicerol + 170 l de cultivo celular). Nota: Se recomienda trabajar en hielo, utilizar CaCl2 frio, todo el material a utilizar debe estar previamente esterilizado y utilizar tubos de fondo ovalado para una fcil resuspensin de las clulas.