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Universidad Nacional de La Plata Licenciatura en Química Química Analítica III

TP 10

Eficiencia en Cromatografía de Gases

Objetivo del trabajo

Determinar el comportamiento de la altura equivalente de plato teórico (H) en función de la velocidad de la fase móvil (u), ajustar la forma matemática de la ecuación de van Deemter a los datos experimentales, calcular la velocidad óptima e interpretar los resultados

Fundamento

El ancho del pico cromatográfico depende de la dispersión longitudinal de la banda cromatográfica en el interior del sistema durante el análisis. La altura equivalente de plato teórico (H) se interpreta como la longitud de columna necesaria para que se establezca un equilibrio entre la fase estacionaria y la móvil, mientras que el número total de platos teóricos (N) se interpreta como el número total de equilibrios que el analito establece entre las fases luego de recorrer todo el sistema. Tanto H como N se utilizan como medida de la eficiencia cromatográfica y son valores que se determinan experimentalmente:

N=

Z 2

Z

Si el analito eluye a Z (Z puede ser tiempo t r , volumen de fase móvil V r, , longitud de papel, etc., etc.) y suponemos que el pico obtenido es gaussiano entonces es la desviación estándar. Desde el punto de vista matemático o estadístico caracteriza al ancho del pico gaussiano que es, concretamente, de 2 veces cuando se mide a la altura de los puntos de inflexión en las mismas unidades que Z. Desde el punto de vista cromatográfico nos sirve para caracterizar la dispersión longitudinal real que sufre el analito en la banda cromatográfica durante su viaje entre el inyector y el detector. La distribución de gauss (y también el pico cromatográfico) no toma el valor cero sino que tiende a cero cuando Z →±. Sin embargo, para fines prácticos debemos considerar un límite concreto, que sirva para caracterizar el ancho total del pico cromatográfico medido sobre la línea de base. Por convención se toma como ancho de pico en la base, o ancho de base, el valor de 4 . El área debajo de la campana de gauss integrada entre -2y +2respecto del centro del pico es el 98% del área total del pico, que podría obtenerse integrando entre - y + . Una de las formas de determinarlo es trazar dos rectas que pasen por los puntos de inflexión haciendo que se crucen a una altura de dos veces la altura de los puntos de inflexión, h i . Por trigonometría básica puede razonar que si a 2h i se encuentra el vértice del triángulo y a h i el ancho es 2 y entonces en la base el ancho será de 4 . N puede calcularse utilizando el que se obtiene del ancho de base, w b . Sustituyendo en la ecuación anterior se obtiene una expresión conocida en cromatografía:

N= 16

b Z

Z

w

2 = 16

b t

t

'

r

w

2

Sin embargo, la triangulación necesaria para obtener w b también requiere utilizar los puntos de inflexión, no es muy preciso e introduce importantes errores cuando el pico presenta asimetría. Una alternativa sería tener en consideración que los puntos de inflexión de una gaussiana se encuentran a 60.65% de la altura total del pico, medido entre la base y el máximo. Pero esta es una proporción incómoda de utilizar. Por otra parte existe una proporcionalidad matemática directa entre el

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ancho de pico medido en el punto de inflexión (w i ) y el ancho de pico que se mide a cualquier otra

altura. Algunos autores proponen medir el ancho al 5% de la altura del pico, otros al 10%, considerando en cada caso proporcionalidad correspondiente respecto de w i . Lo mas sencillo es medir

el ancho a la mitad de la altura entre el máximo del pico y la línea de base (w h ). La proporción entre

estos anchos de pico es:

w h =

2 · ln 2

w i = 1.177w i =

8 · ln 2

Medir el ancho de pico a a mitad de la altura resulta mas fácil y N puede calcularse como:

N= 8 · ln 2

t 2 = 5.54

'

t r

w

h

h t

t

'

r

w

2

Para comprender el sentido físico de N hagamos la siguiente suposición: una sustancia eluye a tiempo t r obteniéndose un pico cuyo ancho en el punto de inflexión es del 2% del tiempo de retención, por lo tanto el ancho de base es del 4%. Si en un cromatograma el el N y el ancho de pico se mantiene constante (esto nunca es así) en un tiempo máximo, t r ,se podrían acomodar t r /4picos iguales separados por un ancho de base constante de 4. En otras palabras, entrarían 25 picos. Si. w i = 2t r /100

y = t r /100 entonces N=(100) 2 =10000. Resumiendo, con un N=10000 podría obtener como máximo

25 picos idénticos con sus máximos separados por 4y solapando un 2% de su área con los picos contiguos. Si el ancho de pico fuese de 0.1% , o sea t r /1000 entonces N=1.000.000 y entrarían 250 picos idénticos separados con sus máximos separados por 4. Esto es un razonamiento rudimentario dado que el ancho de los picos cromatográficos que eluyen a distintos tiempos varía y aquí cabe realizar una aclaración importante:

EL ANCHO DE PICO NO DEPENDE DEL ÁREA TOTAL DEL PICO NI DE LA CANTIDAD DE ANALITO INYECTADO

Con un mismo tipo de fase estacionaria se pueden construir columnas cromatográficas de distinta longitud. La eficiencia de las columnas también se caracteriza mediante la altura equivalente de plato teórico, H o HETP, que esta dado como:

H = L

N

Para una longitud de columna determinada mayor eficiencia implica mayor N y menor H. Sabiendo el

H para un tipo de columna determinado y el N requerido para una separación se puede calcular la

longitud de columna necesaria. Evidentemente, a mayor L mayor N. Desde el punto de vista físicoquímico H esta dado por la ecuación de van Deemter:

B

H = A U C.U

donde U es la velocidad lineal de la fase móvil que está dado por la longitud de columna (L) en cm y

el tiempo que tarda en eluir una sustancia no retenida (tiempo muerto) en minutos (t 0 ) según:

U = L

t 0

Cuando la columna es rellena, dependiendo del diámetro y forma de las partículas, de la homogeneidad en el tamaño y la calidad del empaque, se pueden establecer diferentes recorridos a lo largo de la columna haciendo que algunas moléculas eluyan antes y otras después. Esto es una contribución a la dispersión longitudinal de la banda cromatográfica que aumenta el ancho de los picos, y que no depende del tipo ni del caudal de la fase móvil sino que es constante. Esta dispersión por diferencia de recorridos se encuentra caracterizada por el parámetro A de la ecuación de van

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Deemter y suele llamarse “difusión Eddy”. Esta dispersión es simétrica. Cuando las columnas son

capilares de tubo abierto y el flujo es laminar el termino A=0 ya que no habrá diferentes caminos para recorrer. Cuando un soluto se inyecta en forma de “pulso” las moléculas tenderán naturalmente a difundir desde la zona central de mayor concentración hacia las zonas de menor concentración siguiendo la ley de fick. Esto implica una dispersión simétrica que no depende de que la banda cromatográfica se mueva o no, pero que aumenta en el tiempo. En otras palabras, cuanto antes eluya el pico cromatográfico mejor

y por ello la contribución a la dispersión es inversamente proporcional a la velocidad de la fase móvil. Esta contribución queda caracterizada por el parámetro B y B/U suele llamarse “término de difusión

longitudinal”

Finalmente, si el flujo de la fase móvil es menor el soluto podrá establecer un mayor número de equilibrios entre ambas fases. O sea que cada equilibrio se establecerá en una distancia menor si el caudal es mas bajo, con lo cual estamos diciendo que la contribución a H es proporcional a U. El parámetro C de la ecuación de van Deemter es la constante de proporcionalidad y puede desglosarse en dos contribuciones o dos términos:

C.U =  C m C st . U

C m que caracteriza la transferencia del analito entre el seno de la fase móvil y la superficie de la fase

estacionaria, y C st que caracteriza la transferencia del analito entre la superficie y el seno de la fase estacionaria. A este término se lo llama resistencia a la transferencia de masa Ahora podemos ver que, en sentido estricto, N= L/H no es el número de equilibrios que se establecen

a lo largo de toda la columna sino que el número de equilibrios sería L/(C.U), pero dado que la bondad de la separación esta dada por TODOS los términos de la ecuación de van Deemter el N calculado como N=L/H es la mejor forma de caracterizar la eficiencia de la columna. La forma gráfica de la ecuación de van Deemter y sus términos individuales se muestran en la siguiente figura:

La forma gráfica de la ecuación de van Deemter y sus términos individuales se muestran en

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La curva de van Deemter tiene un mínimo que puede hallarse igualando a cero la derivada respecto a

U de la expresión:

H

U

= 0 =− B

U

2

opt

C

entonces

U opt =

C

B

Evaluando la expresión completa para U=U opt se obtiene el H mínimo posible para el sistema en particular. Sin embargo, en la práctica los caudales para U opt resultan demasiado bajos y alargan los demasiado los tiempos de análisis y suelen utilizarse velocidades 2 o 3 veces U opt . Por esa razón los fabricantes de columnas cromatograficas orientaron los desarrollos para reducir la pendiente de la rama ascendente (C.U), es decir, disminuir la resistencia a la transferencia de masa. Para reducir la resistencia en fase móvil se utilizan columnas rellenas con partículas de diámetro menor, a expensas de tener caídas de presión mayores a lo largo de la columna o diámetros de tubo menores en el caso de tubos capilares. En ambos casos la consecuencia es que la caída de presión a lo largo de la columna se debe aumentar para mantener el mismo caudal. Para cromatografía de gases esto no es problema dado que la presión de los tubos es suficiente, pero en cromatografía de líquidos se requiere de bombas con mayor tecnología. En 2003 Waters presentó su equipo de cromatografía de ultra alta resolución (UPLC) que utiliza columnas con partículas submicroscópicas (>1m ) y aplica presiones superiores

a las 1000 atmósferas y logrando N>80000. Otra opción es disminuir la viscosidad mediante la

temperatura. En el caso de los líquidos la viscosidad disminuye al aumentar la temperatura, y por ello existen varios grupos de investigación trabajando en HPLC a altas temperaturas. En el caso de los

gases la viscosidad disminuye al enfriar (por eso los aviones viajan a 10.000m de altura donde T=-30ºC), pero en este caso también disminuyen los coeficientes de difusión lográndose un efecto contraproducente. En CG capilar disminuir el diámetro de los tubos implica reducir sensiblemente la cantidad de analito inyectado, lo cual exige detectores mucho mas sensibles. Para reducir la transferencia de masa en la fase estacionaria se utilizan recubrimientos de fase estacionaria de menor espesor. Esto también limita la capacidad de carga y exige detectores con límites de detección mas bajo.

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Trabajo Experimental

Se utilizará un equipo de cromatografía gaseosa compuesto por una columna rellena de L=1.2m y 6 mm de diámetro, que contiene un relleno consistente en un soporte de sílice tipo y Chromosorb P (mesh 80-100) en donde se depositó la fase estacionaria de metil-silicona (DC200) obteniéndose un relleno con 20% p/p de la misma. El detector es de conductividad y se utilizará hidrógeno como gas portador.

PRECAUCIÓN: El detector puede encenderse solo cuando circula gas portador, de lo contrario el filamento acumula calor, se pone al rojo y se funde.

Luego de regular el caudal y medirlo se realizaran inyecciones de 2 L de n-heptano y 3 L de aire o metano como marcador de t 0 . Se realizaran análisis a caudales de aproximadamente: 10, 15, 20, 30, y

40 ml / min.

Obtenidos los cromatogramas, se procede de la siguiente manera:

a) Se determinan los anchos de pico a media altura ( w 1/2 ).

b) Se determinan los tiempos muertos (t 0 ) y de retención (t r ).

c) Con los datos de t r y w 1/2 se calculan los N y con L se determina H.

d) Con t 0 y L se determina U

e) Se representa gráficamente H vs U y de ser posible se ajusta la ecuación de van Deemter

para obtener los parámetros. Obtenidos los mismos se calcula U opt , H min y N max .