Estructuras del embrión

De pollo y sus vías de

inoculación
INTEGRANTES:
CONTRERAS NAVA MARLEN
LIRA LÓPEZ ANAY LORENA
VARGAS RAMIREZ MIGDALIA
Microbiología
ZAPEDA SOTO EDGAR ADAN General II
 Objetivos:
Adiestrar al alumno al manejo de las técnica de
la inoculación del embrión de pollo por las vías
más utilizadas

El alumno conocerá las diversas partes del

embrión de pollo de 9 días de incubación
MEDIOS DE CULTIVO DE VIRUS

Cultivo celular:

conjunto de técnicas que permiten mantener las

células in vitro conservando sus propiedades
fisiológicas bioquímicas y genéticas
CLASIFICACIÓN Órganos

Primarios. Tejidos
Células, tejidos u
órganos tomados
directamente de un
Embriones
animal
Cultivo
celular
Líneas celulares:
células se mantienen en
Secundarios. subcultivos
Se realizan a partir
de los primarios
Cultivos continuos: las
células han logrado
sobrevivir a varios
cultivos
 Cultivo celular
El cultivo de células se fundamenta en que las células de cualquier órgano se pueden
cultivar "in vitro".
Luego se colocan en un
Se corta en pequeños medio de cultivo que
Para ello se toma
fragmentos y se trata contiene sales minerales,
asépticamente el con enzimas (por
órgano extraído del aminoácidos, fuentes de
ejemplo, tripsina) que energía, vitaminas,
animal desintegran la antibióticos y suero
unión entre las
células.

Durante la incubación, las células Esta suspensión de células se

sedimentan, se adhieren a la
superficie y comienzan a
dividirse hasta que se obtiene un
crecimiento confluente que cubre
toda la superficie del
fondo de la placa (monocapa).
coloca en placas de vidrio o
de material plástico, y se
incuban bajo condiciones
apropiadas.
Luego de obtenida la
monocapa, las células no
continúan
dividiéndose por un fenómeno
CULTIVO
que se conoce como
PRIMARIO
"inhibición por contacto".
Se trata de nuevo con
tripsina, que rompen la
unión entre las células
desprendiéndolas del
fondo de la placa.
Es relativamente económico ya
que se sustituye el uso de los
animales y huevos.
Se añade el virus y se
incuba bajo
condiciones
apropiadas.
REPLICACION
VIRAL
Luego se mezclan con el
medio de cultivo a una
concentración adecuada
CULTIVO
y se colocan en placas y
SECUNDARIO
se incuban bajo las
mismas condiciones
Donde de nuevo las
células se dividen hasta
obtener una capa
confluente.
 Métodos de inoculación de virus
Método Utilidad Ventajas Desventajas Se usa en

Animal oncogénesis menor difícil conejos,

viral costo que obtener un roedores,
patología de cultivo in estándar chimpancés
padecimiento Vitro imposible
s virales técnica cultivar
aislamiento desarrollada virus
primario amplia recombinant
gama de es
virus
 Métodos de inoculación de virus
Se usa
Método Utilidad Ventajas Desventajas
en

Fácil
Titulación de manipulación
Huevo virus No es Inestabilida
Pollo,
embrio- Identificación necesario el d
pato
nado Preparación de espacio y dar calidad
vacunas cuidado a los
animales
 Métodos de inoculación de virus

Metodo Utilidad Ventajas Desventajas Se usa en

•Como •No se
•Debe haber riñón,
hosped utiliza todo
Tejidos un selectividad prepucio,
ador de
y celulas organismo. •Exactitud en embriones
organos in vitro •Económico el tipo de de pollo o
tejido. ratón
VÍAS DE INOCULACIÓN DE VIRUS
Las vías de inoculación mas utilizadas son de la cavidad amniótica,
cavidad alantoidea, membrana corioalantoidea y saco vitelino.

También puede inocularse por :

•Vía intravenosa: para virus que ocasionan cambios

hematológicos como el virus de la leucemia, se emplean
embriones de 10-15 días con un inoculo de 0.02-0.05ml.

• Intracerebral : Se emplean embriones de 8-14 días,

específicamente para virus que producen alteraciones cerebrales:
la rabia, herpes. Con un inoculo de 0.01-0.02ml.

•Intraperitonial: Una vez que se duplica el virus dentro del

embrión puede liberarse a los líquidos vecinos lo cual constituye
una fuente de virus.
1) Vía intravenosa

2) Vía intracerebral

3) Vía intraperitoneal
 EFECTO CITOPÀTICO (CPE),
 Los virus invaden las células causando normalmente algún
tipo de cambio visible en el crecimiento de las células .
 Ejemplo efecto citopàtico (CPE), es un deterioro de las
células del cultivo de tejidos causado por el virus.
 La CPE puede tener diferentes apariencias dependiendo de
un virus particular y del tipo de células en el cultivo.
 Cambios morfológicos visibles en células
infestadas con virus.
 Incluye la paralización del ARN celular y de la
síntesis de proteínas, fusión celular, liberación de
enzimas lisosomales, cambios en la permeabilidad
de las membranas celulares, cambios difusos de
las estructuras intracelulares, presencia de cuerpos
de inclusión virales, y aberraciones cromosómicas
 EFECTOS CITOPATOGÉNICOS
 Los efectos citopatogénicos virales aportan un
valioso método para la identificación y
clasificación de los virus que producen la
infección.
 EFECTOS CITOPATOGENICOS
 Efectos:
 Lítico: el virus rompe la célula por la gran masa de virus que
se produce.
 Ejemplo: polio, herpes.
 Hiperplasia: la célula se transforma y multiplica
aceleradamente. Ej: verruga.
 Mixto (lítico e hiperplasia): Ej: viruela. Induce una
transformación y luego se rompe.
 Formación de sincicios (herpes): son células multinucleadas
porque las membranas celulares se funden (unión).
 Oncogénicos: transformación en células malignas.
TIPOS DE VIRUS
• QUE SE PUEDEN INOCULAR EN EL EMBRIÓN DE POLLO:

*MIXOVIRUS:
-Influenza
• (causa el resfrío común, las paperas y el sarampión en los seres humanos )

*POXVIRUS
-Viruela

*HERPESVIRUS
-Herpes simplex
 CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADO

 UTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo

conveniente y fácil de manipular que se utiliza en la
propagación, titulación e identificación de virus, así
como en la preparación de algunas vacunas virales.
Membrana
Corioalantoidea
Se utilizan embriones de 10-12
días.

La cantidad de inoculo es de 0.1-

0.5 ml

Especialmente para el aislamiento

y cultivo de virus variolico, Virus de
laringotraqueitis aviar, Enfermedad
de Beyer (Pseudorrabia), mixovirus.

Los cuales provocan focos o

pústulas fácilmente visibles ( lesión
tisular local).
Cavidad
amniótica

Se emplean embriones de 7-15

días

Cantidad de inoculo es de 0.1-

0.2ml.

Se utiliza para aislar de forma

primaria al virus de la influenza
(desarrollo de hemaglutininas).
 Cavidad
alantoidea

•Se emplean embriones de 9-12 días.

•Cantidad de inoculo de 0.1-0.2 ml

•Los virus que se desarrollan son

peste, New Castle, virus de bronquitis
infecciosa, encefalitis equina
occidental (provoca muerte del
embrion), parotiditis, permite la
duplicación fácil del virus de la
influenza.

•Ventaja: simplicidad de la inoculación

y toma de muestra.
 Saco
vitelino
Se emplean embriones de 5-8 dias.

Cantidad de inoculo es de 0.2 – 1 ml.

Sumamente adecuada para el

aislamiento y cultivo de virus de
enfermedades venéreas, neumonía y
rickettsias y clamidias.

El vitelo se emplea para la

preparación de vacunas y como
antígeno para reacciones serológicas
de los virus ya mencionados
METODOLOGÍA

Los huevos utilizados para estudios

virológicos deben ser obtenidos de aves
vigorosas, sanas, libres de infecciones
bacterianas o virales

Se pueden adquirir con facilidad

Son baratos

Tamaño adecuado

No se forman anticuerpos contra el virus

inyectado porque carecen de respuesta
inmune
 Antes de ser inoculados, los huevos
deben ser incubados durante el tiempo
óptimo para que el embrión, las cavidades
extraembrionarias y sus membranas
posean el tamaño necesario según la vía
de inoculación a emplear

La vía de inoculación a seleccionar

dependerá de la afinidad del virus por el
tipo de célula constituyente del embrión y
sus membranas
Las vías utilizadas para la inoculación son:

- Cavidad amniótica (7-15 días)

- Cavidad alantoidea (9-12 días)

- Membrana corioalantoidea (10-12 días)
- Saco vitelino (5-8 días)
Los huevos que se utilizan:

- Cascara blanca para facilitar la observación

- Incubación a 37°C

- Humedad de 40 – 60% en una estufa

- Concentración de oxigeno normal del aire (2%)

ESTRUCTURA NORMAL
Iluminar el embrión de pollo con el
ovoscopio (foco)

Identificar y marcar la cámara de

aire y la mancha ocular

Cortar el cascaron a la altura de la

cámara de aire

Depositar el contenido del embrión

en una caja de petri

Identificar las estructuras del

embrión de 9 días
MEMBRANA CORIOALANTOIDEA
Se perfora sobre la cámara de
aire y el punto de inoculación

Se succiona aire lo que da lugar

a que el aire penetre en la
membrana corioalantoidea y se
forme una cámara de 1 cm de
diámetro

Se inocula en la membrana con

una aguja del 27 corta en posición
vertical y depositar 0.1 ml del
colorante

Se sella

Se incuba
SACO VITELINO

Colocar el embrión en plano

horizontal

Localizar el saco vitelino

Pinchar la membrana por

encima de la cámara aérea

Introducir una aguja del 22

larga a través de la cámara de
aire y depositar 0.1 ml del
colorante
CAVIDAD AMNIÓTICA

Marcar un punto en la
cima de la cámara de aire

Marcar un punto de
inoculación exactamente
donde se ve el embrión

Inocular con aguja del

22 0.1 ml del colorante
CAVIDAD ALATOINDEA

Marcar la cámara de aire y

marcar un punto en la cima

Aprox. 5 mm por debajo de

la cámara de are localice una
zona libre de vasos (lado
opuesto al embrión)

Inocular 0.1 ml del

colorante con un aguja del 27
corta
TIPOS DE VIRUS QUE SE PUEDEN INOCULAR
 Una vez lograda la replicación del virus, se
recogen tejidos (necropsia) pertenecientes a las
zonas correspondientes del organismo, se
selecciona u homogeniza y se almacena
(generalmente a baja temperatura para
emplearlas des pues como fuente de virus.
 La naturaleza del órgano o tejido que se va a colectar y
examinar dependerá de la enfermedad en particular a los
síntomas que exhibe el animal.
 CUIDADOS: Cada instrumento para la necropsia debe de ser
esterilizado. El animal debe ser incinerado después de la
necropsia.