MODULO

I Año
2010
Biología
Molecular de la
Piel
Carrera de Especialización en
Dermatología
Autor: Dr. Ramiro E. Lorente
Directora: Prof. Dra. Ana María Lorenz

Admin
Carrera de Especialización en Dermatología
MODULO I Año 2010
FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
 “…the minute you let her under
your skin
then you begin to make it
better…”
Paul McCartney

Ilustración de tapa: Microfotografía electrónica de una Célula de Langerhans

en migración.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 2

 MODELOS DE ANIMALES TRANSGÉNICOS.....36
RATONES TRANSGÉNICOS...................37

CONTENIDO CONCLUSIONES.......................39

“…THE MINUTE YOU LET HER AGRADECIMIENTOS.................40

UNDER YOUR SKIN....................2
BIBLIOGRAFÍA.........................41
THEN YOU BEGIN TO MAKE IT
BETTER…”................................2 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

PAUL MCCARTNEY.....................2

CONTENIDO..............................3

INTRODUCCION.........................4

HISTORIA DE LA BIOLOGIA
MOLECULAR.............................5

LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR. 9

EPIDERMIS....................................9
LA MEMBRANA BASAL.......................16
UNIONES INTERCELULARES..................18
CÉLULAS NO KERATINOCÍTICAS DE LA
EPIDERMIS...................................20

DERMIS.....................................23
PROTEÍNAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR...23
COMPONENTES CELULARES DE LA DERMIS. .25
HIPODERMIS.................................26

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR UTILIZADAS EN
DERMATOLOGÍA......................28

PROCESAMIENTO DEL TEJIDO................28

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. 29
SECUENCIAMIENTO DE ADN................30
TRANSCRIPCIÓN - REVERSA PCR (RT-PCR)
..............................................31
WESTERN BLOT.............................32
MICROARRAY................................33
PROTEÓMICA CON ESPECTROMETRÍA DE MASA
..............................................35

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 3

 comenzó a llamarse a sí mismo
biólogo molecular:
INTRODUCCION “…me vi forzado a mi mismo a
El término Biología Molecular fue llamarme biólogo molecular porque
introducido por Warren Weaver que se cuando un clérigo inquisidor me
desempeñaba como Director de la preguntó acerca de lo que había
Sección de Ciencias Naturales de la hecho, me cansé de explicarle que era
Fundación Rockefeller en un reporte una mezcla de cristalógrafo, biofísico,
de 1938: bioquímico y genetista, una explicación
que en cada caso encontraba muy
“...y gradualmente está llegando una
difícil de entender…”3.
nueva rama de la ciencia – Biología
Molecular – que está comenzando a El Human Genome Project da la
dejar al descubierto muchos secretos siguiente definición de biología
concernientes a la unidad fundamental molecular: “Es el estudio de la
de la célula viviente….donde técnicas estructura, función y composición de
modernas están siendo usadas para moléculas biológicamente
investigar cada vez mas detalles 4
importantes” .
minúsculos de ciertos procesos
vivientes”1; Este trabajo se ocupará primero del
desarrollo de la biología molecular, y
También podemos citar la opinión luego en describir la estructura de la
que W. Astbury tiene sobre biología piel haciendo énfasis en los
molecular: componentes moleculares de
importancia.
"...no tanto una técnica como un
enfoque, un enfoque desde el punto de
vista de las llamadas ciencias básica
con la idea principal de la búsqueda
por debajo de las manifestaciones a
gran escala de la biología clásica para
el plan molecular correspondiente. Le
preocupan particularmente las formas
de las moléculas biológicas y es
predominantemente tridimensional y
estructural - lo que no significa, sin
embargo, que no es más que un
refinamiento de la morfología - debe
indagar al mismo tiempo en la génesis
y función”2;

Una mejor explicación acerca del

origen del término, viene de lo que
dice Francis Crick sobre porque

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 4

 is life?” (¿Qué es la vida?)9,
proponiendo de una manera entusiasta
como la física cuántica podría explicar
HISTORIA DE LA BIOLOGIA la estabilidad, incluso la mutabilidad de
MOLECULAR los genes10, reducía los genes a la
física especulando con cristales
aperiódicos involucrados en la
Al principio del siglo XX el campo de codificación de la herencia. Muchos
la genética estaba regulado por las científicos jóvenes físicos y biólogos se
leyes Mendelianas de Segregación y vieron fuertemente influenciados por
de Segregación Independiente5, pero este libro, llevándolos a considerar
los procesos de reproducción génica, nuevas direcciones en la investigación,
mutación y expresión eran lo que años más tarde tendría gran
desconocidos. Thomas H. Morgan influencia en la Biología Molecular.
crea un equipo de investigación que
toma a la mosca de la fruta
(Drosophila) como modelo para
estudiar la relación entre los genes y
los cromosomas en el proceso
hereditario6,7. Un estudiante de
Morgan, Hermann J. Müller, reconoce
en los genes las bases para la vida, y
direcciona su trabajo para investigar su
estructura, descubre que los rayos x
tenían efectos mutagénicos en la
mosca Drosophila y utiliza este
fenómeno para estudiar el tamaño y
naturaleza de los genes. A pesar de
los grandes avances de Müller, este
reconoce que no puede extender su
investigación al nivel de explicar las
propiedades fundamentales de los
genes y sus acciones. En un ensayo
publicado 1936 dice: “El genetista por
sí mismo es inútil para analizar nuevas
propiedades (en los genes). Aquí los
físicos, así como los químicos deben
dar un paso adentro. ¿Quién será
voluntario para hacerlo?.8.

En la siguiente década mucho

físicos famosos mostraron atención
por la biología, más específicamente
por la herencia biológica, en 1944 el
físico Erwin Schrödinger publico “What
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 5
 Otro físico famoso interesado por la
biología era Max Delbrueck discípulo
del físico cuántico Neil Börh, quien
como su maestro buscaban en
contraparte con Schödinger no
buscaban explicar los procesos
biológicos reduciéndolos a fenómenos
físicos sino entendiendo como cada
disciplina podía complementar a la
otra.
Figura 1 – Max Delbrueck y Salvador
Luria
Delbrueck visitó el laboratorio de
moscas de Müller, pero considero que
la Drosophila era demasiado compleja
para descifrar los mecanismos de auto
reproducción (característica única de
los seres vivos) y prefirió utilizar a los
bacteriófagos (bacteriophages) como
objeto de investigación, creando al
inicio de la década de 1940 junto con
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
Salvador Luria “The Phage Group”
marcando un punto muy importante en
el desarrollo de la biología molecular.
En un famoso experimento llevado a
cabo por Hershey, A.D. y Marta Chase
prueban que los genes no estaban
compuestos por proteínas sino por
ácido desoxirribonucleico11.
Delbrueck facilitaba la colaboración
entre biólogos y físicos pero era
esquivo a los detalles químicos que
tendían puentes entre las dos
disciplinas. Fue Linus Pauling un
colega de Delbrueck del Cal Tech
quien al contrario de este utilizó sus
conocimientos en química estructural
para estudiar la estructura de las
macromoléculas. Su trabajo en la
teórica de los enlaces químico facilitó
el entendimiento sobre la estabilidad
de grandes macromoléculas. Este
concepto abarca tanto a las proteínas
como a los ácidos nucleicos y era un
requisito para poder estudiar su
estructura. Pauling utilizo cristalografía
por rayos x y sumado a la construcción
de modelos a escala, descubre la
estructura alfa helicoidal de las
proteínas y eventualmente propone un
modelo para la estructura del ADN12.
James Watson era un estudiante de
Luria del “Phage Group” que reconoció
la necesidad de utilizar cristalografía
para poder llegar a la estructura del
ADN, y Francis Crick un físico que
inspirado por Erwin Schrödinger se
volvo hacia la biología y contribuyo en
la teoría de la cristalografía por rayos
x. Estos dos científicos coincidieron en
el Laboratorio Cavendish de la
Universidad de Cambridge y trabajaron
en conjunto utilizando datos de
cristalografía de rayos x de ADN
6
aportados por Maurice Wilkins y
Rosalind Franklin del King's College de
Londres para crear un modelo de la
estructura helicoidal doble del ADN
que fue finalmente publicada en
195313, lo que trajo aparejado el
comienzo del periodo clásico de la
Biología Molecular.
Figura 2 – James Watson y Francis
Crick
Ya con la estructura del ADN en la
mano, los biólogos moleculares
centraron su atención en dilucidar los
mecanismos de la función y programa
reproducción genética. Se puso
énfasis en tratar de secuenciar el
código genético. Los primeros pasos
fueron secuenciando proteínas la
primera fue la de Insulina a final de los
años ’50, y durante las dos décadas
siguientes se fueron desarrollando y
mejorando técnicas de secuenciación.
Además de las técnicas de
secuenciación, hubo aportes
importantísimos desde la inmunología
con el desarrollo de anticuerpos
monoclonales, (trabajo que le valió el
premio Nobel a César Milstein en
1984), de inestimable valor para el
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
desarrollo de nuevas técnicas de
biología molecular.
Figura 3 - César Milstein
Con el desarrollo de la técnica de la
PCR (reacción en cadena de la
polimerasa en Inglés) hacia 1985 por
Kary Mullis14, se dio impulso a un
desarrollado por el
Departamento de Energía y el Instituto
Nacional de Salud de los EEUU para
secuenciar el genoma humano y
estudiar el impacto de la radiación de
las bombas de Hiroshima y Nagasaki
sobre el genoma humano. De éste
proyecto derivo el más conocido como
“El Proyecto Genoma Humano”, que
se vio envuelto en muchas
controversias entre el consorcio
internacional de centros de
secuenciación y las compañías
privadas avocadas a la misma tarea en
una especie de carrera genética. La
secuencia del genoma en bruto fue
7
publicada hacia 200115, marcando un
antes y un después en la biología
molecular.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 8

LA PIEL: BIOLOGÍA
MOLECULAR
La piel humana está dividida en dos
capas primarias, la epidermis o capa
externa y la dermis o capa interna.
Estas dos capas están separadas por
una estructura llamada membrana
basal. Debajo de la dermis hay una
capa de tejido conectivo laxo, llamada
hipodermis o tejido celular subcutáneo,
que se continúa en profundidad con la
capa de tejido graso. La piel de un
adulto promedio cubre
aproximadamente un área de 2 m2.
Desde el nacimiento a la madurez,
el área de la piel se extenderá siete
veces. Puede llegar a pesar hasta el
15% del peso total del cuerpo adulto16,
es el órgano más grande, y recibe
hasta un tercio de la volemia. La piel
constituye una barrera contra el medio
ambiente al mismo tiempo contribuye a
mantener la homeostasis del medio
interno. Es un órgano capaz de
autoregenerarse, y puede soportar
agresiones mecánicas y químicas,
hasta un cierto límite. Su espesor
puede variar desde 0,5 mm en la
membrana timpánica a 0,6 mm en la
planta de los pies.
Epidermis
La epidermis es la capa mas
externa de la piel, es avascular y
deriva del ectodermo embrionario.
Es una capa relativamente uniforme
en espesor y tiene entre 75 y 150µm,
excepto en palmas y plantas donde
tiene entre 0,4 y 0,6 mm. La capa
epidérmica se encuentra en constante
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
renovación en un ciclo que dura entre
26 y 45 días, se produce una
renovación total de la epidermis cada
aproximadamente 2 meses. La
↑ Figura 4 - Corte Histológico de piel
humana de la zona interescapular
↓ Figura 5- Corte Histológico de piel
humana de la Palma de la mano, (se
observa capa córnea más gruesa y compactada)
epidermis constituye un epitelio
escamoso estratificado compuesto por
keratinocitos y la dividimos en 5 capas:
estrato córneo, lúcido, granuloso,
espinoso y capa basal o stratum
germinatuvm.
El estrato córneo
El estrato córneo, es la capa
superficial y está compuesta de células
muertas keratinizadas llamadas
corneocitos. Está compuesto por
células muertas dispuestas en capas
finas apiladas y están llenas en un
80% de keratina de ahí el nombre de
keratinocitos, rodeadas de una matriz
extracelular lipídica, y tienen la función
9
de barrera de la epidermis. La
regulación de la permeabilidad,
descamación, actividad antimicrobial,
exclusión de toxinas y absorción
selectiva, están a cargo de la matriz
extracelular. La resistencia mecánica,
hidratación, promotores de inflamación
mediados por citokinas, y protección
del daño por radiación UV, son
provistas por los corneocitos.
En condiciones normales el estrato
córneo está compuesto de
keratinocitos completamente
diferenciados. Las células más
superficiales son descamadas por los
traumas mecánicos y químicos de la
vida diaria y en parte debido a la
degradación proteolítica de los
desmosomas.
La keratina es una fibra dura,
insoluble, resistente a cambios de pH y
a la digestión enzimática de tripsina y
pepsina.
Se han identificado 54 genes
funcionales de keratina, que codifican
para 34 tipos de keratina epiteliales y
17 pilosas. Mutaciones a nivel de estos
genes se traducen en múltiples
enfermedades.
Tabla 1 - Expresión de genes de keratina y enfermedades asociadas
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
El estrato lúcido
El estrato lúcido se encuentra
directamente por debajo del estrato
córneo. Esta capa puede encontrarse
en áreas donde la piel es gruesa como
en palmas y plantas, y puede estar
ausente en piel fina como la de los
párpados. Puede tener entre una y
cinco células de espesor, los límites
celulares son difíciles de distinguir en
el microscopio de luz. Es una capa
transicional donde hay enzimas
lisosomales activas que degradan el
núcleo y las organellas antes de que
las células pasen al estrato córneo.
El estrato granuloso
El estrato granuloso se encuentra por
debajo del estrato córneo o del estrato
lúcido cuando este está presente. Las
células en ésta capa tienen núcleo
activo. El nombre deriva de los
gránulos de keratohialina contenidos
en las células de esta capa
compuestos principalmente de
profilaggrina, filamentos intermedios
de keratina, y loricrina. En ésta capa
comienza a formarse la envoltura de
las células cornificadas. La
10
profilaggrina polimérica se convierte en
filaggrina en un proceso dependiente
de Ca. Los monómeros de filaggrina
agregan keratina para formar
macrofilamentos, la filaggrina luego es
degradada, quedando macrofilamentos
de keratina. La loricrina es una
proteína rica en cisteína que constituye
el principal componente de la envoltura
cornificada que se une a estructuras
desmosomales. Esta proteína junto
con involucrina, cystatina A, proteínas
pequeñas ricas en prolina (SRP1,
SRP2, y cornifina), elafina,
envoplakina son subsecuentemente
cruzadas en la membrana plasmática
por las transglutaminasas tisulares
(TGM1 y TGM3 principalmente)
formando la envoltura de los
corneocitos.
↓ Figura 6 - Ictiosis Laminar
Mutaciones en los genes que codifican
para las diferentes proteínas
mencionadas producen trastornos en
la normal queratinización por ejemplo:
mutaciones en el gen que codifica
TGM1 están involucradas en casos de
Ictiosis Laminar; mutaciones en el gen
que codifica filaggrina están
involucradas en casos de Ictiosis
Vulgar; mutaciones en el gen que
codifica loricrina están involucradas en
casos de Síndrome de Vohwinkel con
Ictiosis y pseudoainhum.
↓ Figura 7 - Pseudoainhum

También hay situaciones donde la

alteración no está en la formación sino
en la producción de autoanticuerpos
por ejemplo en la dermatitis
herpetiforme existen anticuerpos
contra la TGM3. ( ↓Figura 8)
.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 11

 Tabla 2 - Enfermedades resultantes de la alteración de los desmosomas
↓Figur
a 8 -
Dermatitis Herpetiforme
Las células de esta capa también
contienen gránulos pequeños llamados
cuerpos de Odland. En realidad ya son
numerosos en las células de la parte
superior del estrado espinoso, y se
ubican en la periferia celular a medida
que pasan el estrato granuloso.
Vierten su contenido lipídico en el
medio extracelular, contribuyendo a la
función de barrera y cohesión celular
en la capa córnea.
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
El estrato espinoso
El estrato espinoso es la capa
debajo del estrato granuloso. El
nombre deriva por la configuración en
espículas que tiene las estructuras
citoplasmáticas de las células de esta
capa que constituyen los desmosomas
característica sobresaliente de esta
capa. Los desmosomas (↓ Figura 9↓
Figura 10,↓ Figura 11) estás
constituidos por una parte intracelular
denominada placa y una parte
extracelular denominada core. La
placa contiene los polipéptidos
plakoglobina, desmoplakina 1 y 2,
keratocalmina, desmoyokina, y
plakofilina y el core contienen
glicoproteínas transmembrana que son
desmogleína 1 y 3, y desmocolinas 1 y
2 que son parte de la familia de
cadherinas que se encargan de la
adhesión en la porción extracelular, y
son dependientes de Ca. La
importancia del calcio como mediador
12
de la adhesión queda demostrada en nuevo ARNm para éstas keratinas,
dos condiciones que exhiben excepto en alteraciones
discohesión epidérmica característica, hiperproliferativas.
la enfermedad de Darier (↓ Figura 14) ↓ Figura 10 - Proteínas
o keratosis folicular y Hailey-Hailey (↓ desmosomales

Figura 12) o pénfigo crónico benigno

familiar. Ambas enfermedades son
producidas por mutaciones en lo
genes que regulan el transporte de
calcio, el SERCA2 (sarco-
++
endoplasmatic reticulum Ca ATPasa
type 2 isoform) en la enfermedad de
Darier17 y el ATP2C1 (ATPasa, Ca++
transporting type 2C, member 1)
regulador de la concentración
citoplasmática de calcio en la
enfermedad de Hailey-Hailey.
↓ Figura 9 - Desmosoma en
esquema

↓ Figura 11 - Microfotografía
electrónica. Desmosoma

Las células en esta capa comienzan

a sintetizar grandes cantidades de
keratina K1/K10 que se agrega a la
K5/K14 que todavía está presente de
la capa basal, pero no se sintetiza

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 13

 En estados hiperproliferativos como
psoriasis, keratosis actínicas, y
reparación de heridas la síntesis de
keratina K1/K10 así como el ARNm
para éstas sufren downregulation, y se
favorece la síntesis y traducción del
ARNm para keratina K6/K16. El ARNm
para K6/K16 está normalmente
presente en la epidermis pero solo es
traducido cuando hay una estimulación
de la proliferación. La alteración de las
proteínas que componen los
↓ Figura 12 - Hailey-Hailey
desmosomas se traducen en varias
↓ Figura 13 - Keratodermia
estriada
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
enfermedades como se expone en la
tabla 2.
El estrato basal
El estrato basal es la capa interna
de la epidermis. Está compuesta de
una capa simple de células
mitóticamente activas. Estas células
responden a varios factores como la
matriz extracelular, factores de
crecimiento, hormonas, y vitaminas. El
metabolismo de la piel está mediado
por glucosa, y la utilización de esta por
parte de la piel es comparable a la del
músculo. Una vez q la célula deja la
capa basal esta comienza una
migración hacia arriba que dura entre
2 y 3 semanas, le toma
aproximadamente 14 días en moverse
desde la capa basal al estrato córneo y
otros 14 días pasar a la parte superior
del estrato córneo y descamar.
↓ Figura 14 - Enfermedad de Darier
14
 Las células pluripotenciales ↓ Figura 15 - Psoriasis
(stemlike cells) epidérmicas
comprenden aproximadamente un
10% del total de células basales. Estas
células tienen un ciclo celular muy
lento y cuando se dividen las células
hijas que se diferenciarán a medida
que se mueven hacia la capa córnea
son llamadas “células amplificadoras
transitorias” (↓ Figura 16), éstas
constituyen el 50% de la población de
keratinocitos basales.
Una parte de la población de células
madre puede ser encontrada en las
criptas epidérmicas de las crestas de
la dermis y en el bulbo de los folículos
pilosos.
Las células en división pasan por el
ciclo celular y la fase G1 es acortada
en estados como la reparación de
heridas.
El ciclo celular normal de un
keratinocito es de alrededor de 300 Las stem cell y las células
horas pero puede ser tan corto como amplificadoras transitorias, tienen
36 horas en ciertos estados ambas capacidad para división celular
patológicos como la psoriasis limitada o continúa, y son las que
tienen más probabilidad de residir el
tiempo suficiente en la piel para sufrir
modificaciones genéticas que lleven a
desarrollar cáncer de piel.
El uso de células madres
provenientes de la capa basal de la
piel es un área de creciente
investigación y desarrollo18.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 15

↓ Figura 16 - Esquema. Células La membrana basal
Amplificadoras
La zona de membrana basal o unión
dermo-epidérmica, constituye la
interface entre dermis y epidermis.
Está dividida en dos zonas llamadas
lámina lúcida y lámina densa, según
su densidad en la microscopía
electrónica. La principal función reside
en servir de anclaje entre la dermis y la

↑ Figura 17 - Esquema de la matriz de la membrana

basal

epidermis y proveer resistencia ante

fuerzas cizalladoras externas. Sirve
como soporte de la epidermis,
determina la polaridad de crecimiento,
dirige la organización del citoesqueleto
en las células basales, provee señales
de desarrollo, y actúa como barrera
semipermeable.
La membrana basal está formada
por las interacciones específicas entre
las proteínas, laminina, colágeno tipo
IV, nidogen, y perlecam. También

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 16

encontramos fibronectina, y
glicosaminoglicanos.
Encontramos una menor cantidad
de colágeno tipo VII, pero éste juega
un papel importante en el anclaje de
células a la lámina densa.
Puede ser dividida en tres redes
supramoleculares: el complejo
hemidesmosoma-filamento de anclaje,
la membrana basal propiamente dicha,
y la fibrillas de anclaje. El rol crítico de
ésta región de mantener la integridad
estructural de la piel, se pone de
manifiesto con el gran número de
mutaciones en los componentes de la
unión dermoepidérmica que causan
enfermedades ampollosas como por
ejemplo el colágeno tipo VII. Estas son
agrupadas de acuerdo al grado de
escisión dentro de la unión
dermoepidérmica, por ejemplo la más
superficial es la “epidermólisis bullosa
simple” donde hay escisión de los
keratinocitos basales; “epidermólisis
bullosa de la unión” escisión entre la
lámina lúcida y la lámina densa y la
“epidermólisis bullosa distróficas” que
es la más profunda donde existe
escisión entre la sublámina densa y los
filamentos de anclaje.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 17

 célula adyacente. El anclaje principal a
citoesqueleto de actina es mediante α-
Uniones Intercelulares catenina además de otros
Además de los desmosomas ya componentes como p120ctn, β-
descriptos, hay otros tipos de uniones catenina, plakoglobina, α-actinina,
intercelulares, que no tan solo vinculina, VASP (vasodilatador
contribuyen a la interacción mecánica, stimulated phosphoprotein).
sino que son responsables de la No se han identificado dermatosis
interacción bioquímica y de señales asociadas a anormalidades primarias
entre células. Estas uniones incluyen en la estructura de los componentes
Uniones ocluyentes (tight), uniones de las uniones adherentes, aunque la
adherentes (adherens), y uniones plakoglobina, asociada a una mutación
GAP. en la enfermedad de Naxos, también
es componente de los desmosomas.
Uniones adherentes ↓ Figura 18 - Microfotografía
Las uniones electrónica. Uniones gap
← Figura 19 - E-
cadherinas. Unión
Ca dependiente
adherentes están
constituidas por
estructuras
transmembrana, que
se asocian con el
esqueleto de actina,
parte de la red de
filamentos de los
keratinocitos. Los
componentes
transmembrana están
Uniones gap
constituídos por E-
Las uniones gap comprenden
cadherina, que formas interacciones
grupos de canales intercelulares,
adhesivas hemofílicas calcio
conocidos como conexones, que
dependiente con la E-cadherina de la
directamente forman conexiones entre
↓ Figura 20 - Esquema. Uniones gap

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 18

el citoplasma de keratinocitos occludina, molécula de unión
adyacentes (también presentes en adhesiva, y caludinas. Además del
otras células). Hay descriptas cerca de control de la permeabilidad, las
trece conexinas diferentes en el uniones ocluyentes, contribuyen al
humano. Los conexones se originan mantenimiento de la polaridad celular.
mediante el ensamblaje de seis Las claudinas tendrían la capacidad
conexinas dentro del complejo de para regular la permeabilidad
Golgi que son transportadas a la epidérmica ya sea con la formación de
membrana plasmática, donde se uniones oclusivas o mediante la unión
asocian con otros conexones para directa a ciertos factores de
formar la unión gap. transcripción. La asociación con otros
Las uniones gap pueden ser factores de transcripción como Kruppel
homotípicas o heterotípicas like factor 4 (Klf4), o enzimas como
dependiendo del tipo de conexinas. La Transglutaminasa 1, que son
formación y estabilidad de las uniones conocidos reguladores de la
gap están reguladas por la quinasa de permeabilidad al producir los enlaces
proteína C, Src quinasa, concentración cruzados en las proteínas de la
de Ca, calmodulin, AMPc, y el pH envoltura de los corneocitos, no está
local. Mediante las uniones gap, del todo establecida, pero en ratones
células vecinas comparten metabolitos donde se produce la ablación genética
de bajo peso molecular (<1000 Da) e de claudina 1, o Klf4 o
intercambian iones, esto permite la transglutaminasa 1, muestra patrones
coordinación intercelular y uniformidad. similares en la alteración de la barrera
Alteración en genes que codifican epidérmica. Esto sugiere que para un
para conexinas, están implicados en correcto control de la permeabilidad de
varias formas de queratodermias y la piel, además de las uniones
pérdida de la audición. Hay ↓ Figura 21 - Esquema. Unión
genodermatosis específicamente ocluyente

asociadas a conexinas, como el

síndrome de Vohwinkel, formas
autosómicas dominantes y recesivas
de eritrokeratodermias, síndrome de
Clouston, y síndrome KID (queratitis,
ictiosis, deafness [sordera]).

Uniones ocluyentes
Las uniones ocluyentes
intercelulares constituyen los mayores
reguladores de la permeabilidad en el
epitelio simple y están presentes en la
piel con un rol clave manteniendo la
función de barrera de la piel. Están
constituidas por proteínas
transmembrana e intracelulares como
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 19
ocluyentes en la capa granulosa se pesar del color de piel, un melanocito
necesita una correcta organización de cada 36 células basales
la envoltura de los corneocitos en la aproximadamente.
capa córnea.

↓Figura 22 - Esquema. Proteínas de

unión ocluyente

No se han asociado dermatosis con

anormalidades primarias en las
proteínas de las uniones oclusivas, sin
embargo, se ha notado expresión
anormal de algunos componentes ↑ Figura 23 – Melanocito. Tinción para
como la ocludina en dermatosis tirosinasa

inflamatorias como la psoriasis. (↓ Las dendritas de los melanocitos

Figura 15) son las responsables de distribuir el
pigmento a un gran número de
keratinocitos. La principal diferencia
Células no keratinocíticas
entre la piel clara y oscura es la
de la epidermis.
cantidad y distribución de los
melanosomas y la actividad de los
Los melanocitos son células
melanocitos.
dendríticas derivadas de la cresta
La función de los melanocitos se
neural sintetizadoras pigmentos que
pone de manifiesto en patologías
residen principalmente en la capa
como el vitíligo, donde se produce una
basal. Bajo el microscopio de luz, son
depleción de melanocitos por acción
reconocidas por su citoplasma pálido,
autoinmune.
núcleo ovoide, y el color de
melanosomas llenos de pigmento, que
son la organella distintiva de estas
células. Los melanocitos ya pueden
ser detectados el piel a los 50 días de
gestación y bajo condiciones normales
no se dividen. En la piel normal, el
número de melanocitos es el mismo a

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 20

↓ Figura 24 - Vitiligo
Otros desórdenes de
pigmentación son causados por
defectos en la melanogénesis, que
puede estar en la síntesis de melanina,
producción de melanosomas, y
transporte de melanosomas
transferencia a los keratinocitos. La
interacción entre melanocitos y
keratinocitos es crítica para la
homeostasis y diferenciación del
melanocito, influyendo en
proliferación, dendricidad
melanización. El estudio de los
melanocitos ha crecido notablemente
sobre todo como parte del estudio de
los melanomas, donde se han
descubierto nuevos mecanismos de
supervivencia tumoral, con
prometedoras implicancias
19
terapéuticas.
Las células de Merkel, son
mecanoreceptores de adaptación lenta
tipo 1, localizados en sitios de alta
sensibilidad táctil. Están presentes
entre los keratinocitos basales en
regiones particulares del cuerpo,
incluyendo piel cubierta de pelos y en
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
piel sin pelos de los dedos, labios,
cavidad oral, y la hoja externa de los
folículos pilosos. Al igual que otras
células no keratinocíticas las células
de Merkel tienen un citoplasma pálido
en las tinciones.
↑Figura 25 - Carcinoma de células
la de Merkel. Marcado
hinmunohistoquímico mostrando patrón
punteado perinuclear característico.
y
la
y
↑Figura 26 - Carcinoma de células
de Merkel. Muestra rápido crecimiento.
Nódulo violáceo en dedo del pie.
Los marcadores
inmunohistoquímicos incluyen K8,
K18, K19, y K20 péptidos de keratina.
K20 está restringido a las células de
Merkel en la piel así que se considera
el marcador más confiable.
Ultraestructuralmente son fácilmente
reconocibles por los gránulos densos,
limitados por membrana, que se
coleccionan en oposición al aparato de
21
Golgi y próximos a una neurita la epidermis. A raíz de su función
amielinizada. Estos gránulos son estas células están implicadas en
similares a los encontrados en mecanismos patológicos como
neuronas y contienen sustancias dermatitis de contacto, leishmaniasis
similares a neurotransmisores y cutánea, e infección por HIV.
marcadores de células Las células de Langerhans están
neuroendocrinas, incluyendo reducidas en la epidermis de pacientes
metaencefalina, péptido vasoactivo con ciertas condiciones patológicas
intestinal, enolasa neurona-específica, como psoriasis, sarcoidosis, y
y sinaptofisina. Las células de Merkel dermatitis de contacto. Su
pueden sufrir transformación funcionalidad se ve afectada por la
originando neoplasias (carcinoma radiación UV, especialmente la UVB.
neuroendocrino primario) que son Por su efectividad como
particularmente agresivos y difíciles de presentadora de antígenos y
tratar. estimulación de linfocitos, estás
células están siendo estudiadas como
vehículos para el tratamiento de
tumores y el desarrollo de vacunas
anti-tumorales.20,21

Figura 27 - Célula de Langerhans en

epidermis.

Las Células de Langerhans

son células dendríticas procesadoras y
presentadoras de antígenos de la
epidermis. Aunque no son exclusivas
de la epidermis representan del 2% al
8% del total de células epidérmicas.
Se encuentras comúnmente en
posición supra basal, pero pueden
estar distribuidas por la capa basal,
espisona, o granulosa. Se tiñen
pálidamente en los preparados
histológicos, y tienen un núcleo ↑ Figura 28 - Microfotografía
complejo. El citoplasma contiene electrónica de una Célula de
estructuras características llamadas Langerhans en epidermis. Flechas
indican Gránulos de Birbeck. En recuadro se puede
gránulos de Birbeck. Su función apreciar la forma en “raqueta”, las flechas curvas
principal es tomar muestras y indican la fusión tipo “cierre” de la parte vesicular.
N indica el núcleo
presentar antígenos a las células T de
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 22

Dermis
La dermis está constituida por
elementos tejido conectivo fibroso,
filamentoso, y difuso, que soporta
redes vasculares y nerviosas,
apéndices epidérmicos y muchos tipos
de células incluyendo fibroblastos,
macrófagos, mastocitos, y células
transitorias del sistema inmune. La
dermis forma la mayoría de la piel y la
provee de flexibilidad, elasticidad, y
resistencia a la tensión. Protege el
cuerpo de traumatismos mecánicos,
retiene agua, colabora en
termorregulación e incluye receptores
para estímulos sensoriales.
La dermis interactúa con la
epidermis en el mantenimiento de
ambas capas, colaborando durante el
desarrollo y la morfogénesis de la
unión dermoepidérmica, y los
apéndices epidérmicos, e interactúan
en la remodelación de la piel luego de
una injuria.
La dermis puede ser dividida en dos
regiones principales, la dermis papilar
superior, y la dermis reticular inferior.
Estas regiones pueden ser
identificadas en los cortes histológicos
ya que difieren en la organización del
tejido, la densidad celular y la
distribución de vasos y nervios.
La dermis papilar colinda con la
epidermis, moldea su contorno, y tiene
usualmente el doble del espesor de la
dermis. La dermis reticular forma el
grueso de la dermis. Está compuesta
principalmente por fibras colágenas
gruesas, organizadas in grandes
haces de fibras entretejidas, con
ramas de fibras elásticas rodeando los
haces. En la piel normas, las fibras
elásticas y los haces colágenos
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
aumentan de tamaño progresivamente
hacia la hipodermis. El plexo
subpapilar, es un plano horizontal de
vasos, marcando el límite entre la
dermis papilar y la dermis reticular. El
límite inferior de la dermis reticular
está definido por la transición de tejido
conectivo fibroso a tejido conectivo
adiposo en la hipodermis.
← Figura 29 -
Estructura
helicoidal triple
del colágeno.
la
Proteínas de la matriz
extracelular
Colágeno
El colágeno es la principal proteína
estructural encontrada en la dermis y
es secretada por fibroblastos dérmicos
como procolágeno, que se transforma
en colágeno en el medio extracelular
por acción de las enzimas ADAMTS-2,
3, y 4 (a desintegrin and a
metalloproteinase with thrombospondin
repeats)22 actuando como
procolageno-N-proteinasa y por
BMP1/Tolloid-like family (bone
morphogenetic protein 1; Tolloid
identifica originalmente la misma
enzima en la Drosophila) actuando en
el lado C terminal (↓ Figura 32). Una
23
actividad defectuosa en las los encontramos asociados a los
procolageno-N-proteinasas, se costados de los formadores de fibras
encuentran en el síndrome de Ehlers- principales como monómeros,
Danlos VIIc (↓ Figura 30), con una extendiéndose en la matriz circundante
fragilidad extrema de la piel. asociándose con los proteoglicanos,
ayudando a relacionar las fibras
↓ Figura 30 - Síndrome de Ehlers- colágenas con los demás
Danlos componentes de la matriz extracelular.
↓ Figura 32 - Ensamblaje de las
fibras de colágeno

El principal tipo de colágeno que

encontramos en la piel es el colágeno
tipo I, uno de los tipos de colágeno
formadores de fibras, representa
alrededor del 77% al 85% del colágeno
presente. El colágeno tipo III, también
formador de fibras representa casi
todo el colágeno restante. Los
colágenos tipo V y VI, también pueden
estar presente en pequeña cantidad.
Los colágenos tipo IX y XII, no son
formadores de fibras por sí mismos, y
↓ Figura 31 - Comparación entre la fibra de colágeno y la elastina.
El colágeno proporciona a la piel su
fuerza, para darse una idea, el
colágeno es el que le proporciona al
cuero de vaca su fuerza y durabilidad.
Los aminoácidos que forman al
colágeno son prolina, glicina,
hidroxiprolina, e hidroxiglicina.
Elastina

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 24

 La elastina es la proteína que le
proporciona a la piel su elasticidad.
Esta previene a la piel de ser
permanentemente remodelada.
La elastina al igual que el colágeno
(↓ Figura 31), es una proteína
formadora de fibras y tiene una gran
cantidad de glicina y prolina en su
composición pero carece de grandes
cantidades de hidroxiprolina. Las fibras
de elastina forman estructuras
similares a un resorte que permite ser
estirada y luego retornar a su forma
original. La cantidad de elastina en la
piel representa menos del 2% de su
peso seco.
Alteraciones en los genes que
codifica para elastina da lugar a
fenotipos de cutis laxa.
Proteoglicanos y
glicosaminoglicanos
Los Proteoglicanos y la matriz proteica y de algunos factores
glicosaminoglicanos (PGs y GAGs),
constituyen la sustancia basal, que se
encuentra entre las fibras colágenas y
elastina. Dentro de estas categoría
están incluido el condrotitín sulfato y
dermatán sulfato (versican, decorin,
biglycan), condrotitín sulfato y la reparación de heridas y cicatrización
dermatán sulfato proteoglicanos
(syndecan, perlecan), y condroitín-6-
sulfato proteoglicanos. Aunque estas
proteínas solo representan cerca del
0,2% del peso seco de la dermis, estas
moléculas son muy importantes ya que
son capaces de retener 1000 veces su
volumen en agua, y tienen un rol muy
importante en la hidratación de la piel
determinando su volumen y
compresibilidad.
También encontramos en la dermis
acido hialurónico que es mucho más
abundante en la piel fetal donde facilita
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
la migración celular. Este material
puede asociar factores de crecimiento
y facilita la conexión celular con otros
materiales de la matriz extracelular.
Componentes celulares de
la dermis
Los componentes celulares de la
dermis son fibroblastos, macrófagos, y
mastocitos. Son encontrados más
frecuentemente alrededor de la región
papilar y rodeando los vasos del plexo
subpapilar. También podemos
encontrarlos en la dermis reticular
entre las fibras colágenas.
Los fibroblastos son células
mesenquimáticas que migran a través
del tejido y son responsables de la
síntesis y degradación de los
componentes fibrosos y no fibrosos de
solubles. Los fibroblastos proveen de
un marco estructural a la matriz
extracelular a la vez que promocionan
la interacción dermo-epidérmica
mediante la síntesis de mediadores
solubles. Juegan un rol importante en
donde aumentan su proliferación y
actividad sintética.
↓ Figura 33 - Fibroblastos
25
 Los macrófagos, monocitos y
células dendríticas dérmicas,
constituyen el sistema de células
fagocíticas mononucleares en la piel.
Figura 34 - Macrófago fagocitando
bacterias (en amarillo)
de activación pueden volverse
hiperproliferativos e hiperplasicos
(mastocitosis). Los mastocitos son
responsables de la reacción de
hipersensibilidad inmediata en la piel y
en el mantenimiento de estados
inflamatorios subagudos y crónicos.
↓ Figura 35 - Urticaria

Los macrófagos derivan de

precursores en la médula ósea, se
diferencian en monocitos circulantes
en el torrente sanguíneo, luego migran
a la piel para diferenciarse en
macrófagos. Estas células son
fagocíticas, procesan y presentan Sintetizan y secretan gránulos
antígenos, son microbicidas, cargados de histamina, heparina,
tumoricidas, secretan factores de triptasa, quimasa, carboxipeptidasa,
crecimiento, citoquinas y otras factor quimiotático neutrofilico, y factor
moléculas inmunomoduladoras, y quimiotáctico eosinofílico anafiláctico.
están involucradas en la reparación de
Hipodermis
heridas y remodelación de tejidos.
Los mastocitos son células
El tejido de la hipodermis aísla al
secretoras especializadas que en la
cuerpo, sirve como reserva energética,
piel están presentes en gran densidad
amortigua y protege la piel y facilita su
en la dermis papilar, cerca de la unión
movilidad sobre las estructuras
dermoepidérmica, y alrededor de
subyacentes. Tiene efecto cosmético
vasos sanguíneos y nervios del plexo
moldeando el contorno corporal. El
subpailar. También son comunes en la
límite entre la dermis reticular y la
grasa subcutánea. Los mastocitos son
hipodermis, es una transición abrupta
identificados histológicamente por un
del tejido conectivo fibroso de la
núcleo oval y redondeado y por
dermis al tejido adiposo de la
abundantes gránulos oscuros
hipodermis. A pesar de la separación
citoplasmáticos. La superficie de los
“anatómica”, las dos regiones están
mastocitos está cubierta con
estructuralmente y funcionalmente
fibronectina que probablemente
conectadas por una red de vasos y
asegura a la célula a la matriz de tejido
nervios y la continuidad de apéndices
conectivo. En determinados estados
epidérmicos. Folículos pilosos en
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 26
crecimiento activo pasan la dermis y subcutánea está ausente en áreas de
se extienden en la grasa subcutánea, y lesión óseas, o con esclerodermia,
las glándulas sudoríparas apócrinas y donde la grasa subcutánea es
écrinas, están normalmente reemplazada por tejido conectivo
confinadas a esta profundidad de la fibroso. Estas regiones tienden a
piel. desarrollar úlceras crónicas. La piel de
Los adipocitos de la hipodermis pacientes con esclerodermia es tensa
están organizados en lóbulos definidos y dolorosa.
por septos de tejido conectivo, que
contienen los vasos, nervios y
linfáticos.
↓ Figura 36 - Adipositos
Subcutáneos

La síntesis y acumulación de grasa

es continua ya sea mediante la
acumulación de lípidos dentro de los
adipocitos, proliferación de adipositos
existentes, o mediante la recluta de
nuevas células del mesénquima
indiferenciado.
La hormona leptina, secretada por los
adipocitos, provee una señal de
retroalimentación de larga duración
regulando la masa grasa. Los niveles
de leptina son más elevados en los
adipositos subcutáneos que en los
mesentéricos, sugiriendo un rol del a
leptina en el control de la distribución
de los adipositos.
La importancia de la grasa
subcutánea se pone de manifiesto en
los pacientes con síndrome de Werner
(defecto molecular en la enzima RecQ
DNA helicasa), donde la grasa
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 27

Técnicas de biología
molecular utilizadas en
dermatología
Los avances en biología molecular
están cambiando rápidamente nuestro
conocimiento sobre la biología de la
piel y sus enfermedades.
El aumento de información se
traslada en nuevos diagnósticos
moleculares que están transformando
la práctica clínica de la dermatología.
Pero hay que usarlos de una manera
prudente.
↓ Figura 37 - Procesamiento de una
muestra de tejido
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
En este capítulo, se profundizara
sobre las técnicas de biología
molecular útiles en dermatología.
Como enfermedad modelo
utilizaremos el melanoma. Se discutirá
el rango de técnicas disponibles por el
dermatólogo para elucidar las bases
moleculares del melanoma, para luego
realizar un tratamiento efectivo. Se
estudiara las técnicas de biología
molecular que permiten analizar ADN,
ARN y proteínas de las células del
melanoma. Luego, se analizaran las
posibles terapias genéticas. Todo esto
contribuirá con importante información
para el pronóstico, consejo terapéutico
y screening a futuro del melanoma.
Procesamiento del tejido
Para determinar los cambios
moleculares producidos que llevaron a
la formación de un melanoma, primero
hay que terminar como se procesara la
muestra elegida la obtención de ADN,
ARN o proteínas.
El melanoma extraído puede
ser procesado de cuatro formas
diferentes. (↓ Figura 37)
1. El tejido en fresco puede ser
colocado en un medio de cultivo y
las células del melanoma pueden
ser cultivadas en una incubadora.
Estas células permiten obtener
más células que las de la muestra
original y exponerlas a distintas
condiciones.
2. Procesar el tejido fresco con
búferes y reactivos para extraer
ADN, ARN y proteínas de toda la
masa tumoral y en calidad
elevada.
28
 gen del total del ADN, podemos utilizar
la técnica de biología molecular
Reacción en cadena de la Polimerasa
(PCR) que nos permitirá aislar el gen
buscado y amplificar la cantidad del
mismo para hacerlo medible. El ADN
amplificado por PCR que contiene el
gen, puede ser clonado en plásmidos
bacteriales para una fácil manipulación
y luego ser secuenciado usando
técnicas de secuenciación por
fluorescencia automatizada (Fig. 4.4).
3. El tejido puede ser fijado en En base a los resultados de la
formol (para microscopia óptica) o secuenciación, sobremos si la
en glutaraldehido (para mutación se encuentra presente en el
microscopia electrónica) y luego gen toomuchsun en el tumor bajo
ser analizado histológicamente en estudio.
distintas formas, incluyendo
tinciones de rutina, Reacción en Cadena de la
inmunohistoquímica o hibridación Polimerasa
in situ. Objetivo de la técnica: amplificar
una porción específica de ADN
4. La muestra puede ser
congelada para una extracción
diferida del ADN, ARN o proteínas.
También nos permite obtener
cortes para el estudio histológico.

Otra opción es usar micro

disección por captura laser (LCM)
para aislar células individuales del
melanoma para su posterior
análisis a partir de un preparado
histológico visualizado en el
microscopio. (↑ Figura 38)

Luego de la extracción del ADN,

ARN o proteínas del melanoma,
queremos detectar las posibles
mutaciones en proto-oncogenes o en
genes supresores de tumores
responsables de la neoplasia. Por
ejemplo, suponiendo que es conocido
en el melanoma la mutación del gen
“toomuchsun”, para obtener solo este
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 29
 Requerimientos: se necesita
conocer la secuencia especifica del
ADN problema (al menos las porciones
finales)
Conceptos sobresalientes
↑ Figura 38 - Captura por La
Microdisección Láser doble
cadena de ADN puede ser separada
en cadenas únicas aumentando la
temperatura (desnaturalización); (↓
Figura 40) aumentando la temperatura
nuevamente, la cadena única pude
unirse (hibridar) a secuencias de
nucleótidos ↓ Figura 39 - Secuenciamiento
complementarias
formando una por
doble fluorescencia
cadena
nuevamente (re naturalización).
Durante el proceso de hibridación,
los nucleótidos A de una cadena, se
unen con los nucleótidos T de la
cadena complementaria, mientras que
los nucleótidos C se unen a los
nucleótidos G y viceversa
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
Cadenas cortas de ADN llamadas
oligonucleótidos, son diseñadas para
hibridarse con una secuencia
especifica de ADN.
Método
Los cebadores (primers) son
oligonucleótidos diseñados para
hibridarse en secuencias específicas
situadas en los extremos del ADN de
interés. Estos cebadores son
agregados a una mezcla, junto con los
desoxinucleótidos trifosfato (dATP (A),
dTTP (T), dGTP (G) and dCTP (C) )
de ADN ADN polimerasa
, el ADN problema,
automático
↓ Figura 40 - Esquema de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR)
termoestable y buffer.
La mezcla se coloca en tubos de
PCR en un termociclador, que
controla la temperatura de la reacción
durante varios ciclos
Durante cada ciclo se realizan los
siguientes pasos: 1. Desnaturalización
2. Hibridación del cebador 3.
Elongación de la cadena de ADN a
partir del primer 4. Repetición del ciclo
completo 30 a 40 veces- (↓ Figura 40)
Secuenciamiento de ADN
Objetivo de la técnica: Determinar la
secuencia u orden de los nucleótidos
(AGCT).
Requerimientos: El ADN a
secuenciar puede ser el producto de
una PCR o ADN clonado presente en
plásmidos.
Conceptos sobresalientes
El método de “terminación de la
cadena” o Sanger es el preferido
30
 La incorporación de un
didesoxinucleótido en la cadena
naciente de ADN termina su extensión,
lo que produce varios fragmentos de
ADN de longitud variable.
Mediante electroforesis, se separan
los diferentes fragmentos de ADN
según su tamaño.
Método
Un cebador se hibrida al ADN a
secuenciar y la ADN polimerasa
sintetiza una segunda cadena
complementaria.
La síntesis de la segunda cadena es
interrumpida al azar por la
incorporación de nucleótidos análogos
marcados con fluorescencia
(didesoxinucleótido ddATP, ddGTP,
ddCTP, ddTTP). Los fragmentos de
ADN que presentan este nucleótido
análogo en su extremo pueden ser
identificados ya que cada uno de los 4
didesoxinucleótido está marcado con
un fluorocromo distinto.
Los distintos fragmentos de ADN
son separados mediante electroforesis
en un gel de poliacrilamida
El fluorocromo presente en cada
fragmento de ADN es leído a través
de un detector de fluorescencia e
indica el orden de la secuencia de
ADN.
Una vez determinada la existencia
de la mutación en el gen bajo estudio,
se puede determinar si esta influye en
el nivel de mRNA y de proteínas
dentro de la célula. Para el analizar
ARN, primero se lo debe convertir en
ADN usando la técnica de
Transcripción Reversa (RT). Luego, el
ADN complementario (cADN) puede
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
ser amplificado mediante PCR.
Además esta técnica permite
monitorear la cantidad de producto
formado en cada ciclo de
amplificación, y es conocida también
como PCR cuantitativa en tiempo real.
Transcripción - reversa PCR
(RT-PCR)
Objetivo de la técnica: Amplificar
ARN mensajero (mARN) por PCR. El
ARNm es convertido primero en ADN
complementario y luego se amplifica
por PCR la región especifica a niveles
detectables.
Requerimientos: El material puede
ser ARN celular total (incluyendo ARN
ribosomal, ARN de transferencia y
ARN mensajero) o ARN purificado.
Conceptos sobresalientes
Para facilitar el estudio del ARN,
primero se debe convertir el ARN en
ADN complementario por medio de
una enzima llamada transcriptasa
reversa (es una enzima ADN
polimerasa dependiente de ARN).
Método
La transcripción reversa puede
convertir mARN en cADN a través de
tres métodos diferentes, dependiendo
de los cebadores utilizados para el
paso inicial. (← Figura 41)
1. Cebadores hexamericos al azar,
que contienen 6 nucleótidos (6-mer)
que contienen todas las posibles
combinaciones de dA, dG, dC y dT.
Estos cebadores se hibridaran a la
secuencia complementaria
correspondiente en el ARN molde.
31
 2. Cebadores de oligonucleótidos
que contienen solo dT e hibridan en la
cadena complementaria de dA
nucleótidos presentes en el extremo
de las moléculas de ARNm (cola poli
A)
3. Cebador que solo hibrida en una
secuencia especifica de mARN
Luego que obtenemos cADN, se
agregan los cebadores que se
hibridaran a una secuencia específica
que permitirá la amplificación por PCR.
Para medir las proteínas producto
del gen mutado, se utiliza la técnica de
Western Blot (Fig. 4.6), también
conocida como Imunoblot, ya que
utiliza anticuerpos para detectar la
proteína de interés. Además esta
técnica nos permite medir el tamaño
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL:
de la proteína y revelar si se presenta
en distintas formas.
Western Blot
Objetivo de la técnica: medir el
tamaño y la cantidad de proteínas
presentes en la muestra
Requerimientos: anticuerpos
específicos para la proteína de interés
Conceptos sobresalientes
Anticuerpos policlonales que
reaccionan a varios epitopes de una
proteína antigénica son obtenidos
inyectando la proteína en un animal y
aislando los anticuerpos de la fracción
de las inmunoglobulinas del suero.
Anticuerpos monoclonales que
reaccionan a un solo epitope de una
proteína antigénica son obtenidos
inmunizando a un ratón con el
antígeno, luego se unen los
linfocitos reactivos del ratón
en una línea celular de un
mieloma para crear células
que producirán anticuerpos
indefinidamente.
U ← Figura 41 – Transcriptasa
n Inversa
A- Una transcriptasa inversa puede
convertir a cDNA del mRNA de tres
maneras diferentes, dependiendo del
primer utilizado para la etapa inicial RT:
(1) cebadores aleatorios hexamericos,
(2) oligo dT primers, y (3) primers
específicos del gen. Después de que el
ARNm se ha convertido a cDNA, los
primers que se pueden hibridar con
secuencias específicas son añadidos y
amplificación por PCR se lleva a cabo.
B- PCR en tiempo real es capaz de
medir con precisión la cantidad de
producto de PCR de forma continua (eje
y) después de cada ciclo (eje x). Cada
trazado línea representa la cantidad de
presente del producto de PCR en una
muestra diferente. En las muestras que
inicialmente contienen transcripciones
BIOLOGÍAde
MOLECULAR
ARNm de genes 32más, PCR en tiempo
real demostrará un aumento
exponencial de producto de la PCR
tempranamente después de unos pocos
ciclos de PCR.
anticuerpo secundario es utilizado para
detectar el anticuerpo primario unido a
la proteína de interés. Los anticuerpos
pueden ser visualizados al agregarles
fluorescencia o una enzima que
produzca luz o color a través de una
reacción enzimática.
↑ Figura 42 - Western Blot
Método
Una mezcla de proteínas
solubilizadas es separada en un gel de
poliacrilamida y transferida
electroforéticamente a una membrana.
Esta se coloca en un buffer que
contiene el anticuerpo. Los anticuerpos
que se unieron son luego detectados a
través de técnicas cromogenicas o por
quimioluminiscencia. (↑ Figura 42)
Para investigar los cambios en la
expresión génica de todos los genes
de células tumorales como el
melanoma, se utiliza la técnica de
Micromatriz o Microarray. Con ella se
puede conocer cuales genes se
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
expresan en forma incorrecta
(disminuida o aumentada)
comparándolas a células normales (←
Figura 43)
Esta poderosa técnica, utiliza
secuencias de oligonucleótidos
representando miles de genes que son
desarrollados en un chip; luego, el
mARN de los melanomas y los de los
melanocitos normales es separado y
convertido en sondas marcadas que
son hibridadas en los chips. El nivel de
hibridación de los oligonucleótidos de
un gen dado indica cuanto mARN de
ese gen está presente. La ventaja de
esto es la posibilidad de analizar en
forma cuantitativa el nivel de expresión
de miles de genes de una sola vez.
Microarray
Objetivos: Analizar la expresión
de mARN de miles de genes en un
solo experimento
Requerimientos: ARN total o
mARN
Conceptos sobresalientes
Hibridación a ADN. Se utiliza el
mismo principio de hibridación
que el aplicado en PCR, excepto
que muchos genes diferentes son
evaluados simultáneamente. El
ADN es químicamente sintetizado
en la superficie de miles de
puntos específicos. (← Figura 43).
Si las células están expresando
ARNm del gen correspondiente, el
ARNc se hibridara en el lugar y
generara una señal cuya
intensidad será en relación al
nivel de expresión.
33
Método son comparados, normal vs
ARN es convertido en cADN tumor, tratado vs no tratado.
mediante transcripción reversa. Alternativamente, los
La transcripción in vitro del cADN oligonucleótidos del microarray
se realiza con nucleótidos pueden utilizarse. (← Figura 43).
marcados con biotina dando como Usando esta posibilidad, el ARN es
resultado cARN marcado (← directamente marcado con
Figura 43). Las moléculas de cARN fluoresceína o con nucleótidos
marcado son hibridadas a radioactivos y son hibridados a los
pequeños fragmentos de ADN oligonucleótidos en un
presentes en un chip. El chip es portaobjetos o en una membrana.
teñido con estreptavidina Cuando se usan sondas
ficoeritrina; la estreptavidina se radioactivas, las muestras son
une a la biotina del cARN y la hibridadas en microarrays
ficoeritrina genera una señal separados. Si las muestras de
fluoresecente. mARN a comparar son marcadas
Generalmente, los patrones de con fluorocromos distintos, las 2
expresión génica de dos muestras muestras pueden ser hibridadas
en el mismo array en
forma simultánea.

Un scanner mide la
intensidad de la señal de
cada punto y un software
determina cuales genes
están sobre o
subexpresados en una
muestra comparada con
la otra.

Para realizar el análisis

comparativo de miles de
genes diferentes, se
utiliza un poderoso
software. Este software
puede comparar
resultados de múltiples
experimentos o grupos de
resultados de acuerdo a la
expresión génica.

Agregado al uso de
micromatrices para

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 34

analizar todo el ARNm producido
por una célula, se puede estudiar
todas las proteínas producidas en
ellas. El termino Proteómica
representa a todas las proteínas
producidas dentro de una células
en un momento dado.
La espectrometría de masa es
una técnica que nos permite el
estudio de la Proteómica, que
provee de mediciones con gran
precisión de la masa de proteínas
← Figura 43 - Arrays de
Ácidos Nucleicos.
mediante la ionización de las
mismas y la medición de la
aceleración de las partículas a
través de un tubo hacia un
detector en el lado opuesto.
↑ Figura 44 - Proteómica con
espectrometría de masa
También se puede utilizar
matrices de proteínas, donde
anticuerpos específicos son
inmovilizados en un portaobjetos
o membrana. Este array puede
analizar mezclas complejas de
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
proteínas mediante la captura y la
detección especifica de proteínas.
Proteómica con
Espectrometría de Masa
Objetivo de la técnica: La
Proteómica representa a todas las
proteínas celulares que son
expresadas en condiciones
particulares.
Requerimientos: mezcla de
proteínas celulares o péptidos
derivados de esas proteínas, son
purificados de una población
celular definida.
Conceptos sobresalientes
La espectrometría de masa
puede medir con gran precisión el
tamaño o la masa de proteínas,
péptidos o fragmentos de
péptidos mediante la ionización
de los mismos con carga positiva
y luego ser medir el tiempo que
necesitan los iones para moverse
a través de un tubo hacia el
detector. (TOF – tiempo de vuelo)
(↑ Figura 44)
La masa de los péptidos
ionizadas se correlaciona con
precisión con el tiempo de vuelo,
péptidos pequeños se mueven
más rápido (menor TOF) que los
péptidos mayores (mayor TOF)
Método
El primer paso es disminuir la
complejidad de la mezcla de
proteínas o péptidos celulares,
previamente a la espectrometría
de masa. Los 2 métodos
principales para separar
proteína/péptidos son mediante
35
electroforesis bidimensional y la
cromatografía liquida.
En la electroforesis
bidimensional, las proteínas son
primero separadas según su
punto isoeléctrico (primera
dimensión); luego se las separa
aun más según su tamaño en un
gel de poliacrilamida (segunda
dimensión), donde las proteínas
más pequeñas corren más rápido
en el gel que las mayores. Las
proteínas presentaran un lugar
único en el gel que puede ser
físicamente removido y ser
analizado mediante
espectrometría de masa.
La cromatografía liquida puede
usarse también para separar
proteínas mientras transcurren a
través de columnas que contienen
distintos tipos de resinas. Las
proteínas son separadas en función
de su hidrofobicidad (cromatografía de
fase reversa), carga eléctrica
(cromatografía de intercambio
catiónico/aniónico) y tamaño
(cromatografía de exclusión
molecular).
Luego de separar las proteínas,
se realiza la espectrometría de
masa. Primero se ionizan las
proteínas con carga positiva
usando láseres o ionización por
electrospray y nanospray.
Basados en el tiempo de vuelo del
ion cargado, la espectrometría de
masa puede medir la relación
masa/carga de cada péptido.
Con la ayuda de poderosas
computadoras y software de
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
bioinformática, se puede medir la
relación masa/carga, que permite
la identificación de la secuencia
de un péptido y a la proteína que
contiene a este péptido.
Modelos de animales
transgénicos
Luego de haber identificado
diferentes genes que se asocian
por ejemplo al desarrollo de
melanoma, se podrán utilizar
modelos animales para probar si
causan cáncer. Estos estudios
nos permitirán investigar los
mecanismos de la carcinogénesis
y demostrar que ese gen mutado
es capaz de producir una
neoplasia.
Los modelos animales más
usados para el estudio del cáncer
son los ratones transgénicos y los
ratones “knock-out”.
Los ratones transgénicos son
normales excepto que cada célula
contiene el nuevo gen que nos
interesa. El gen a ser estudiado,
en micro inyectado en un ovulo de
ratón fecundado, que se integrara
en forma aleatoria en el genoma
del ratón y que estará presente
en todas las células del mismo. (↑
Figura 45) Aunque el gen se
encuentra presente en cada
célula, su expresión puede ser
limitada a tejidos específicos
usando promotores/
estimuladores que solo se
expresen en determinados
tejidos. Los promotores/
estimuladores son la porción del
36
gen (que usualmente se
encuentra en el extremo 5´ o
upstream de la región codificante)
que inicia o regula el nivel de
expresión del ARNm. Los
promotores/ estimuladores que
aseguraran qué genes son expresados
sólo en melanocitos incluiría los
promotores del gen relacionadas a la
síntesis de melanina, como la
tirosinasa.
Ratones Transgénicos
Objetivo: modelos de ratones
transgénicos permiten a los
investigadores estudiar los
efectos de un transgen (gen de
interés) en una célula, en un
tejido o en todo el animal. El
transgen puede ser expresado en
forma selectiva en tipo particular
de célula o tejido usando un
promotor/estimulador que regula
la expresión génica en ese tipo
específico de células.
Requerimientos: Un transgen o
gen de interés, cuya función
biológica se quiera caracterizar en
un modelo animal (ej. El gen
toomuchsun);
Una región reguladora
(promotor/estimulador) que
expresara en forma selectiva el
transgen en un tejido específico
(ej. Melanocitos)
Tecnología apropiada para
crear un ratón transgénico.
Conceptos sobresalientes
Luego de la inyección de un
gen en un ovulo fecundado de
ratón o en una célula embrionaria,
Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR
↑ Figura 45 - Ratones transgénicos
el transgen se integra en el
genoma al azar. (↑ Figura 45). A
medida que las células
embrionarias se dividen y dan
lugar al desarrollo de un ratón, el
transgen integrado estará
presente en todos los tipos de
células, tejido y órganos del ratón.
La expresión de este transgen
solo ocurrirá donde la región
promotor/estimulador es activa.
Cualquier fenotipo que
desarrolle el ratón, ayudara a
entender los efectos biológicos
del gen bajo estudio.
Método
Se construye un transgen,
definido como el gen más la
región reguladora
(promotor/enhancer) que es
preparado para la inyección.
El transgen en micro inyectado
en óvulos fertilizados y se integra
en el genoma, generalmente en
un sitio único.
Estos óvulos fecundados son
luego implantados en una madre
receptora, quien luego parirá a
37
ratones “precursores”
heterogéneos.
Se habla de ratón
“heterogéneo” porque el gen se
encuentra solo en uno de los dos
cromosomas pares
Los ratones precursores son
criados ratones normales no
transgénicos. La progenie será
tanto transgénicos y no
transgénicos heterocigotos según
las leyes mendelianas.
Para obtener solo ratones
homocigotos que contengan el
transgen en ambos pares de
cromosomas, dos ratones
heterocigotos son cruzados.
Ratones transgénicos
homocigotas tendrán el doble de
la dosis de transgen que llevara a
fenotipos diferentes y a efectos
biológicos distintos que a los
ratones heterocigotos.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 38

 Tal vez el estudio de la biología
molecular pueda ser “opcional” en
otras ramas de la medicina pero para
Conclusiones el dermatólogo, debe considerarse
como la membrana basal desde donde
El campo de la biología molecular
crece y se diferencia su formación
crece a pasos agigantados.
como especialista.
En la actualidad no hay
prácticamente ninguna disciplina
biológica que no se haya visto
beneficiada con los nuevos
conocimientos que va aportando, a la
vez que nos obligan a cambiar nuestro
enfoque y llevar nuestro razonamiento
hacia el nivel molecular.

Es imprescindible que el
dermatólogo de hoy tenga
incorporados conocimientos básicos
de biología molecular, ya que de lo
contrario no podrá estar a la altura no
tan sólo de las nuevas técnicas
diagnósticas y de investigación sino de
los nuevos tratamientos que se van
imponiendo a medida que la biología
molecular descubre los mecanismos
moleculares de las enfermedades que
vemos día a día.

En la práctica médica diaria y más

aún en la dermatología, donde la
observación constituye la base del
proceso diagnóstico, cuando
estudiamos una lesión macroscópica
en un paciente, pensando en las
posibles causas, sin darnos cuenta
nos trasladamos al nivel molecular
teorizando que interacciones
moleculares estarán implicadas en lo
que observamos y decidimos que
técnicas de biología molecular
podríamos aplicar para establecer un
diagnóstico, implementar un
tratamiento, y mejorar el pronóstico.

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 39

Agradecimientos
A Piwi (por aguantarme el mal
humor, por darme amor)

A Augusto, a Francisco, a Nacho (por

darme tres razones para seguir)

A mi Madre (sobran razones)

A la Prof. Dra. Constanza E. Lorente

(por su valioso asesoramiento)

A mi Familia (porque es la única que

tengo)

A la Prof. Dra. Ana María Lórenz (por

darme la oportunidad de formarme
en dermatología, por siempre tratar
de inspirar a sus alumnos)

A la Dra. María Elena Ricaud (por la

paciencia)

A los Sres. Docentes de la carrera

(por la falta de mezquindad al
compartir sus conocimientos)

Al Sr. José Luis Carrazana, Secretario

de la Cátedra de Dermatología (por
su siempre buena disposición)

Biología Molecular de la Piel | LA PIEL: BIOLOGÍA MOLECULAR 40


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General Medicine, Seventh
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