Determinación de proteínas - Procedimiento Lowry

Introducción

El principio detrás del método de Lowry para determinar las concentraciones de la proteína
se encuentra en la reactividad del nitrógeno péptido [s] con el cobre II] iones [bajo
condiciones alcalinas y la consiguiente disminución de la Ciocalteay
phosphomolybdicphosphotungstic ácido-Folin a heteropolymolybdenum azul por el cobre-
catalizada la oxidación de los ácidos aromáticos [Dunn, 13]. El método de Lowry es
sensible a los cambios de pH y por lo tanto el pH de la solución de ensayo debe mantenerse
a 10 - 10.5.

El método de Lowry es sensible a las bajas concentraciones de la proteína. Dunn [1992]

sugiere que concentraciones entre 0,10 a 2 mg de proteína por ml mientras que el precio
[1996] sugiere que las concentraciones de 0,005 a 0,10 mg de proteína por ml. La principal
desventaja del método de Lowry es el pH de rango estrecho en el que se precisa. Sin
embargo, vamos a utilizar pequeños volúmenes de muestra que se tiene o no poco efecto
sobre el pH de la mezcla de reacción.
Una variedad de compuestos que interfieren con el procedimiento de Lowry. Estos
incluyen algunos derivados de aminoácidos, tampones ciertos medicamentos, lípidos,
azúcares, sales, ácidos nucleicos y los reactivos sulfhidrilo [Dunn, 1992]. Precio [1996]
señala que los iones de amonio, tampones bipolares, tampones no iónicos y compuestos tiol
también puede interferir con la reacción de Lowry. Estas sustancias deben ser removidos o
diluidos antes de ejecutar los ensayos de Lowry.

 Lowry, OH, Rosebrough NJ, Farr y Randall AL RJ, 1951. Proteína de medición
con el reactivo Folin-fenol. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
 Dunn, MJ, 1992. Determinación de la proteína de la concentración de proteína
total. Harris, ELV, Angal, S., [eds], los métodos de purificación de proteínas,
Oxford: Prensa IRL.
 Precio, Carolina del Norte, 1996:. Proteínas, Labfax, Oxford Academic Press.

Reactivos

Una. 2% de Na2CO3 en 0,1 N NaOH

B. NaK un tartrato% en H 2 O
C. 0,5% CuSO4.5 H 2 O en H 2 O
D. 48 ml de A, 1 mL de B, C 1 ml
. E reactivo fenol - 1 parte de Folin-fenol [2 N]: 1 parte de agua

[Reactivos A, B y C se puede almacenar indefinidamente]

Norma BSA - 1 mg / ml
Albúmina de suero bovino: 5 mg en 5 ml de agua [1 mg / l].
Congelar alícuotas de 1 ml.

Procedimiento

[Ejecutar triplicado la determinación de todas las muestras.]

1. Establecer once grupos de tres de 16 x 150 mm de los tubos de ensayo en el bastidor.

2. Añadir BSA [0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 l] a estos tubos.
3. Añadir 2 ml de solución D a cada tubo de ensayo.
4. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Añadir 0,2 ml de solución diluida de Folin-fenol en cada tubo.
6. Vortex cada tubo inmediatamente.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
10. Determinar la absorbancia de cada muestra a 600 nm.
11. absorbancia vs Parcela mg de proteína para obtener la curva estándar.
12. Establecer triplicado ensayos para todos los "desconocidos".

Figura 6. Concentraciones de la proteína de un homogeneizado de crudo y un 45-65% de

pellets.