BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA

DE PUEBLA
 
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

 QUIMICOFARMACOBIOLOGO
JOSÉ MANUEL RODRÍGUEZ LUNA
 
  LABORATORIO DE HEMATOLOGIA II

Q.F.B CASTILLO OLIVARES YESSICA

Q.F.B FLORES ROMERO MARCO ANTONIO
Q.F.B PORTILLO GUERRERO JAFET
 Definicion
 La fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP, por sus siglas en inglés) es un
examen efectuado en las células sanguíneas o en la médula ósea (biopsia)
para confirmar un diagnóstico de leucemia de células pilosas o
tricoleucemia. Asimismo, este examen se puede realizar en el plasma
sanguíneo para buscar signos de descomposición ósea, por ejemplo, para
medir la destrucción del hueso causada por cáncer.

 Casi todas las células sanguíneas contienen siete isoenzimas no eritroides

de la fosfatasa acida 1,2,3,3b,4,5. las células pilosas producen abundantes
cantidades de isoenzima 5. esto provoca que la tinción de fosfatasa acida se
transforme en una herramienta de diagnostico útil para la detección de
leucemias de células pilosas
 Fundamento

 La fosfatasa acida hidroliza el sustrato acido fosfórico naftol AS-BI. Una

ves hidrolizado este sustrato se acopla con una coloración, como GBC
garnet rápido, y produce un precipitado rojo en el sitio de la actividad
enzimatica. Cuando se agrega acido tartárico L(+), todas las isoenzimas,
excepto la 5, se inhiben. La isoenzima 5 es resistente tartrato. Para
describir este fenómeno se utiliza el termino tinción de TRAP (acido
fosfatasa resistente-tartrato)
 Preparación de reactivos
 Solución Fijadora: disolver en 100ml de agua destilada 0,48 g de ácido
cítrico (4,5 mM); 0,34 g de citrato trisódico dihidratado (2,3 mM) y 0,09 g
de cloruro sódico (3,1 mM). Añadir 262,9 g de acetona (9,02 M) y 16,54 g
de formaldehído (1,09 M). Disolver bien, ajustar el pH a 6,0 y aforar a 500
ml con agua destilada. Almacenar a 4 °C. 

Tampón Acetato: disolver 25,4 g de acetato sódico (1,86 M) en 50 ml de
agua destilada. Añadir 3,6 ml de ácido acético glacial (0,64 M). Aforar a 100
ml con agua destilada. Filtrar con filtro de acetato de celulosa estéril de 0,45
mm y comprobar que el pH=5,5. Almacenar a 4°C hasta su uso. 

Tampón Tartrato: disolver 14,4 g de acetato sódico (2,11 M) en 50 ml de
agua destilada. Añadir 1,05 ml de ácido acético glacial (0,18 M) y 3 g de
ácido L(+) tartárico (0,4 M). Disolver completamente, filtrar con filtro estéril
de 0,45 mm y comprobar que pH=4,9. Guardar a 4°C hasta su uso. 
• Procedimiento
• La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte
interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con
un desinfectante (antiséptico). El médico envuelve una banda elástica
alrededor de la parte superior del brazo con el fin de aplicar presión en el
área y hacer que la vena se llene de sangre.

• Luego, el médico introduce suavemente una aguja en la vena y recoge la

sangre en un frasco hermético o en un tubo pegado a la aguja. La banda
elástica se retira del brazo.

• Una vez que se ha recogido la muestra de sangre, se retira la aguja y se

cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado.

• Este examen también se puede realizar en una biopsia de médula ósea.

 Los frotis de las muestras a estudio, tras su secado al aire durante al menos
10 minutos, deben ser fijados en la solución fijadora fría (4°C) durante
exactamente 30 segundos. Tras esta corta fijación, las muestras deben ser
lavadas con abundante agua bidestilada a presión dejando escurrir el
exceso de agua. 
La solución de incubación debe ser preparada "in situ" tal y como sigue: 44
ml de agua bidestilada, 3 ml de tampón acetato, 3 ml de sustrato Naftol
ASBI fosfato (Naphtol AsBi Phosphoric Acid Solution, Sigma
Diagnostics, St Louis, USA) conteniendo 12,5 mg/ml de C18H15BrNO6P y
24 mg de la sal diazotada estable 2-metil-4-(2-metilfenil)-
azobencenodiazosulfato (Fast Garnet GBC Sulfate Salt, Sigma Chemical
Co, St Louis, USA). Disolver mediante agitación durante al menos 5
minutos y filtrar la disolución dos veces consecutivas a través de papel de
filtro dispuesto en pliegues. La solución rojiza traslúcida de pH 5,2, debe
ser introducida entonces en un vaso de Coplin junto a los frotis y a un
pequeño imán, de tal forma que la solución cubra totalmente las
extensiones y que el imán pueda girar libremente, preferiblemente en la
zona central del vaso
 Las muestras deben ser incubadas en oscuridad durante 2 horas a
temperatura ambiente, situando el vaso de Coplin sobre un agitador
magnético que se someterá a agitación máxima. Es importante que la
reacción de incubación se desarrolle en un lugar alejado de corrientes de
aire, cambios bruscos de temperatura y de vapores o disolventes volátiles. 
Tras el periodo de incubación, los portaobjetos deben ser lavados en agua
corriente. Una forma eficaz de realizar el lavado consiste en depositar los
portaobjetos en los extremos de un vaso de Coplin, situando el mismo bajo
la corriente de agua de un grifo. De esta forma y con la regulación
adecuada del flujo de agua, se consigue que el chorro de agua impacte en
el fondo del vaso de Coplin generando multitud de burbujas de aire que
arrastran hacia arriba cualquier depósito indeseado. Tras 10 minutos de
dicho lavado, las muestras deben ser pasadas por agua destilada a presión,
dejándolas escurrir suficientemente. 
 Aunque el almacenaje de las muestras en frío ayude a la preservación de la
actividad enzimática, coincidimos con aquellos autores que observan en él
más inconvenientes que ventajas10. En cuanto a la solución de fijación, se
ha optado por la combinación de tres reactivos (acetona, formol, citrato) en
concentraciones tales que permiten preservar con eficacia la actividad
enzimática y la morfología celular. 

El sustrato (un éster fosfato del Naftol ASBI), permite una tinción
altamente cromogénica sin apenas fondo ni difusión. A pesar de su baja
solubilidad acuosa y su lenta actividad hidrolítica, los largos periodos de
incubación necesarios favorecen una reacción de captura más eficaz7. Las
concentraciones del sustrato que utilizamos, algo superiores a las descritas
como óptimas10, aseguran que no haya limitación de sustrato en nuestra
habitual incubación simultánea de cuatro extensiones. El uso de un menor
número de extensiones permite reducir proporcionalmente el volumen de
sustrato descrito. 
• En cuanto al agente copulador, está descrito que el derivado diazotado de
la pararosanilina, útil en la detección histoquímica de la actividad FA, es
menos eficaz en su demostración citoquímica7,9. Por el contrario, la sal
diazo estable conocida como Fast Garnet GBC, destaca por su facilidad de
manejo y sus peculiaridades químicas, que permiten obtener como
resultado final un precipitado rojo muy visible. Añadir más cantidad de
Fast Garnet GBC, no sólo no mejora la tinción, sino que ayuda a la
precipitación inespecífica durante la incubación. 
Las soluciones madre de los tampones permiten su conservación a 4°C
durante meses y aseguran, al añadirlas en los volúmenes descritos, una
capacidad tamponante suficiente para que la actividad FA se desarrolle
eficazmente. Aunque está descrito que el pH óptimo de actuación1 de la
FA oscila entre 4,7 y 5,5, los mejores resultados se han conseguido
manteniendo el pH de incubación a 5,2 o a 5,0 (tartrato-sensibilidad). De
esta manera, minimizamos la degradación de la sal diazo y la inhibición de
la actividad enzimática debida al Fast Garnet GBC, descrita por algunos
autores7. 
 Aunque el tiempo de incubación podría reducirse bastante mediante incubación
a 37°C, su desarrollo a temperatura ambiente (24-25°C) durante 2 horas,
utilizando una agitación mágnetica, consigue minimizar la descomposición de
la sal diazo, logrando con ello menor turbidez y, por tanto, un mínimo
background. 
El procedimiento de lavado con agua corriente descrito es un paso fundamental
cuya realización correcta asegura la eliminación de residuos y precipitados
inespecíficos, que alteran y dificultan el análisis microscópico. Se consigue,
asimismo, eliminar el efecto conocido como "salting out", consistente en la
aparición de precipitado abundante en células que sólo deben presentar débil
positividad (neutrófilos). 

 Dada la importancia del reconocimiento celular en la evaluación de la FA,

utilizamos dos tipos de contrastante de tal forma que, los núcleos celulares
pueden ser apreciados suficientemente bien junto al precipitado rojo específico.
Las extensiones pueden ser montadas tanto en medios acuosos como
orgánicos. 
 Aunque el precipitado rojo obtenido es relativamente lábil y debe ser
observado dentro de las 24 horas de realizada la tinción, las muestras
montadas pueden ser conservadas semanas a -20°C. 
Durante la adaptación de la técnica descrita hemos podido observar, al
igual que otros estudios10,11, actividad de FA en precursores eritroides, cuya
positividad es considerada por algunos autores como expresión de
patología
Tricoleucemia
Linfocito maduro y neutrófilo en sangre
periférica mostrando positividad para
fosfotasa ácida de localización centrosómica y
citoplasmática difusa  respectivamente (x
1000)
Células plasmáticas de médula ósea en un
paciente con Mieloma Múltiple presentando
positividad
granular para fosfatasa ácida (x 1000)
 Interpretación
 La mayoría de las células hematopoyéticas presentan actividad de fosfatsa
acida. Los granulocitos, linfocitos y monocitos son positivos en cierto punto,
hasta el agregado del acido tartárico L(+). La actividad se inhibe a la falta de
isoenzima 5. las células pilosas, que contienen esta isoenzima, siguen positivos
en presencia de acido tartárico L(+), en la que por lo menos dos o mas células
contienen 40 gránulos rojos o mas
 Controles y corrección
 Un frotis sanguíneo normal con neutrofilos, linfocitos y monocitos es
suficiente como muestra control. La presencia de escasa células
hematopoyéticas en la muestra obtenida por punción o impronta de la medula
ósea puede considerarse como control interno para la coloración. Para la
leucemia de células pilosas puede utilizarse un frotis normal para demostrar la
inhibición por el acido tartárico L(+), pero es mas difícil obtener un control
para demostrar la resistencia. Solo podría emplearse el frotis de un paciente con
leucemia de células pilosas confirmada.
 Cuando los extendidos utilizados como control no presentan el patron de
tinción adecuado, por ejemplo, no muestran actividad cuando deberían ser
positivos o tienen un color erróneo ene el precipitado, deben analizarse
algunos aspectos del estudio. Es probable que se haya añadido un reactivo
incorrecto, uno vencido o que no se haya agregado reactivo alguno al
sistema de pruebas. Puede ser que el reactivo este contaminado, si este es
el caso, el examinador debe preparar o abrir un lote nievo de reactivos. Si
el inconveniente no involucra al reactivo, el examinador debe repetir el
procedimiento para asegurarse de que se cumplieron todos los pasos en
forma correcta. Otro aspecto a considera es la antigüedad del frotis y las
condiciones en las que se almaceno. Algunas enzimas disminuyen su
actividad con el transcurso del tiempo. Los frotis frescos son los ideales.
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