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Observación Al Microscopio
Observación Al Microscopio
MICROORGANISMOS A TRAVS
DEL MICROSCOPIO
El Microscopio
El microscopio (de micro-, pequeo, y scopio,
observar) es un instrumento que permite observar
objetos que son demasiado pequeos para ser vistos
a simple vista.
El tipo ms comn y el primero que se invent es el
microscopio ptico.
UNIDAD
TIPOS DE MICROSCOPIOS
1 Clasificacin:
MICROSCOPIO ELECTRNICO
Microscopios
Estereoscpicos
o lupas
M. ptico,
corriente
Tipos de microscopios,
segn el nmero de lentes
Compuestos
M. contraste
de fases
M. de
fluorescencia
M. Electrnico
M. E. de
transmisin
M. E. de barrido
Microscopio estereoscpico
Este microscopio hace posible la visin
tridimensional de los objetos.
Ofrece ventajas para observaciones
que requieren pequeos aumentos.
El ptimo de visin estereoscpica se
encuentra entre 2 y 40X.
UNIDAD
1
.
Partes
Partes
Fuente. Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno
sobrevoltada
Lente Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la
imagen formada en los objetivos. Los oculares son intercambiables y sus
poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de
potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos
ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado
Lente Objetivo: lente situada cerca del especimen.
Objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos
y la preparacin. En la cara externa llevan ndices que indican el aumento, la
abertura numrica y otros datos.
Un objetivo con estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que es
planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, con tubo de
longitud 160 mm. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente
utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes.
Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite
de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre
en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, son de 100X y se distingue
por uno o dos crculos negros en su extremo inferior.
Partes
Ocular
Objetivo
Diafragma
Si cerramos el diafragma
mayor profundidad de
campo, pero menos luz
Si abrimos el diafragma
menor profundidad de
campo, pero ms luz
Ocular (
X 10)
Muestra
Condensador
Fuente
UNIDAD
Protozoos
UNIDAD
CLULAS VEGETALES
Muestra
Condensador
Placa opaca
Chlamydomonas
Anillo de fase
Objetivo
Muestra
Condensador
Anillo transparente
Fuente
Contraste de fase
rayos
en
fase
-1/4
anillo de fase
-1/4
Contraste de fase
Se usa principalmente para
aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de
las clulas sin colorear. Es ideal
para espcimenes delgados, o
clulas aisladas
Con este mtodo, el material
denso aparece brillante,
mientras que las partes de la
clula que tienen una
densidad cercana al agua
(citoplasma) aparecen oscuras.
Microscopio de fluorescencia
Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y
380 nm) menor que la luz blanca (380 a 750
nm). Esta luz excita ciertas sustancias que
emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que las
hace visibles.
Algunos materiales no requieren colorantes
pues tienen fluorescencia propia y otros
deben ser teidos con colorante fluorescente,
es estimulado por un haz de luz, emitiendo
parte de la energa absorbida como rayos
luminosos.
La imagen observada es el resultado de la
radiacin electromagntica emitida por las
molculas que han absorbido la excitacin
primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda.
Para dejar pasar slo la emisin secundaria
deseada, se deben colocar filtros apropiados
debajo del condensador y encima del
objetivo
Se usa para detectar sustancias con
autofluorescencia (vitamina A).
Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo
(azul), microtubulos (verdes), actina (rojo).
Microscopio de fluorescencia
Filtro de emision
Muestra
Lampara
Filtro de excitacion
Mantenimiento y precuaciones
Al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de
menor aumento
Cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar
que se ensucien los lentes.
Nunca tocar los lentes con las manos
Despues de usar el objetivo de inmersion, limpiar el
aceite con pauelos para ptica, con una mezcla
alcphol acetona ( 7:3) o con xilol
El microscopio electrnico
En el, la luz se sustituye por un haz de
electrones que pasan por un tubo (con vaco
para mejorar el paso de los electrones).
Aumenta la imagen con lentes
magnticas.
Aumenta las imgenes hasta un milln de
veces.
Las imgenes que se producen son en
blanco y negro y muchas veces tienen
colores falsos.
Oculares. Lentes a travs de las que
se observa la preparacin ampliada
(externos).
Objetivos. Lentes que aumentan el
tamao de la imagen (internos).
Iluminacin. Can de electrones que
genera un haz que puede atravesar la
muestra o rebotar en ella (interno).
Microscopio electrnico
Los electrones chocan con la
muestra y se desvan, y estas
desviaciones son recogidas
por la pantalla.
Observamos la imagen a
travs de una pantalla que es
excitada por los electrones
que llegan a ella (mecanismo
similar a la televisin).
Las imgenes se recogen en
una placa fotogrfica que es
impresionada directamente
por los electrones.
UNIDAD
Imgenes en el MET
Microscopio de
Campo Claro
Alga verde
(eucariota)
Microscopio de
Fluorescencia
Bacteria filamentosa
Teida con naranja
de acridina
Microscopio de Contraste
de Fases
Saccharomyces cerevisiae
EJERCICIO
Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas
mediante microscopio (micrografas) y seala qu tipo de
microscopio se utiliz en cada caso. Justifica
a. Ameba, organismo
formado por una sola
clula (unicelular), que
mide cerca de 50
micrones
c. Espermio
acercndose a un
vulo. El vulo
humano es una
clula que mide
poco ms de 100
micrones
d. Ncleo de una
clula animal, de
alrededor de 5
micrones de
dimetro
f. Poros de salida de
glndulas gstricas.
Por una de ellas sale
un chorro de jugo
gstrico. Diametro de
poro, 5 micras
g. Corteza cerebral
humana, que tiene un
espesor de unos pocos
milmetros
h. Glbulo blanco
deformado al atravesar
por un capilar
sanguneo. Este capilar
tiene un dimetro de
unos 10 micrones
i. Capilar sanguneo
cortado
transversalmente,
por el que asoma un
glbulo rojo, clula
que mide 7 micrones
de dimetro
TINCION
Una tincin o coloracin es una tcnica utilizada en microscopa
para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.
Para mejor aprovechar la observacin microscpica, debe
relacionarse el comportamiento del tinte con la composicin qumica
de las partes de la anatoma bacteriana.
Los colorantes utilizados son compuestos orgnicos con grupos
cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos.
Cromforos son los grupos funcionales de la molcula responsables
de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbonocarbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo
(N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares libres).
Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si solo pero
que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia
longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades:
metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.
Tipos de Colorantes
Cationicos: se combinan con los constituyentes celulares
cargados negativamente tales como acidos nucleicos, polisacaridos
acidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta, Safranina.
Colorantes
Tipos de tincin
Tincin in vivo (colorantes vitales) es el proceso de teir
tejidos vivos.
El propsito ms comn es revelar detalles de la
citoestructura.
Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se
utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5000 a
1:50000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente
txicas para los organismos.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Tincin in vitro (colorantes no vitales). Involucra el coloreo de
clulas o estructuras que han sido removidas de su contexto
biolgico.
Ejem: tincion Gram.
Carmn
Es un colorante de un intenso color rojo que puede ser
utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las
sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al
ncleo. Las tinciones con carmn requieren del uso de un
mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.
Cristal violeta
El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado,
tie las paredes celulares de color prpura.
MORDIENTES
Tinciones
Simples: uso de un solo
Positivas: se emplea el
uso de colorantes que tien al
microorganismo y no al
medio.
2 tipos de
tinciones
Diferenciales: uso de un
colorante inical y luego un colorante
de contraste. Sirven para diferenciar
distintos tipos de celulas (Ejemplo:
tincion Gram)
Coloracin vital.
El procedimiento es similar al de la observacin en
fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de
solucin diluida de colorante en lugar del agua
Tincin negativa.
Se utilizan sustancias que no penetran en la clula y tie
el fondo quedando los microorganismos incoloros.
Normalmente el tamao de las bacterias observadas por
esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para
la medicin de microorganismos.
Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta
china.
Con este mtodo pueden observarse morfologa y
agrupacin as como tambin estructuras extracelulares
como la cpsula.
Tcnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa,
una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de
nigrosina y extender en forma de valo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con
objetivo de inmersin.
TINCIN SIMPLE
Tincin de clulas para
la observacin microscpica
Secado al aire
COLORACIONES ESPECFICAS.
Coloracin de Gram.
Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883
y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.
En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern
las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras
que las Gram (-) se vern rojas.
La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+)
y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.
TINCIN DIFERENCIAL
TINCIN DE GRAM
Tincin del frotis
Paso 1
Paso 2
Aadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las clulas siguen
de color azul-violeta.
Gram +
Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.
Paso 4
Las clulas G+
se ven azul-violeta.
Las G- rosas o rojas.
Gram -
Tincin Gram
Permite distinguir dos grandes grupos de bacterias que poseen diferencias
estructurales en la pared celular.
Peptidoglicano
Polimero de N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico unidos por peptidos.
Tincin Gram
Tincin Gram
Protocolo
1) Preparar un extendido
A partir de cultivos en medio liquido: Se toma un poco de
cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto.
Tincin Gram
Gram +
2) Fijar el material
Una vez que el material esta seco, pasar
el portaobjeto sobre el mechero.
Gram _
Tincin Gram
Gram +
Gram _
6) Agregar el decolorante
(Decolorante: solucion de acetona y EtOH).
Tincin Gram
Gram +
7) Agregar el colorante de
contraste (safranina)
Gram _
Tincin Gram
Rosa (Gram -)
Violeta (Gram +)
Tincin de esporas
Clasificacin en funcin de su posicin
Tincin de esporas
Protocolo:
1)
calor.
2)
3)
4)
5)