Esterilizacin de

medios de cultivo

Esterilizacin
Para poder llevar a cabo una fermentacin con xito es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos
libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de produccin.
La presencia de otros microorganismos puede producir competencia por los nutrientes y/o produccin de
compuestos que inhiban la produccin de productos de inters, por ello se necesita que al inicio de la fermentacin
el sistema se encuentre libre de m.o.
Existen procesos que necesitan que los efluentes se encuentren libre de m.o., es el caso de las etapas finales de los
procesos de tratamientos de agua servidas o RILes.

Algunas definiciones previas:

1.

Esterilizacin: Erradicacin, remocin, destruccin o inactivacin de todo tipo de vida, de tal manera que las clulas remanentes no puedan reproducirse, es decir, una eliminacin de la capacidad de reproduccin.

2.

Desinfeccin: Remocin, destruccin o inactivacin de esas clulas que podran causar deterioro en el medio (no todas las clulas).

3.

Pasteurizacin: Remocin, destruccin o inactivacin de todo los patgenos viables naturales por medio de tratamiento trmico tanto para slidos como lquidos.

DONDE SE CONTROLA LA
ESTERILIDAD?
Mantener la pureza del inculo.
Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.
Esterilizar el material en contacto con el medio ( recipiente,
fermentador, vlvulas y conductos)
Esterilizar los gases entrantes y salientes.
Mantener las
manipulacin.

condiciones

aspticas

durante

la

Construccin apropiada del biorreactor para su

esterilizacin y para la prevencin durante la fermentacin.

Elementos que se deben esterilizar

1. Medio de cultivo
2. Fermentador
3. Equipos accesorios
1.

Mangueras

2.

Electrodos

3.

Agitadores

4.

Filtros

4. Aire que circula por el fermentador

1.

Entrada

2.

Salida

METODO

CONDICION
ES

USO

OBSERVACIONES

Calor
Hmedo
(vapor)

121C (250F),
14.7 psig, 15
minutos

Medios
Lquidos
Slidos

Barato
Eficiente

Calor seco

130 - 150C
1 - 2 horas

Elementos de
Vidrio, Slido

Ms caro que el calor hmedo y ms lento.

Filtracin

0.2 m

Para productos sensibles a la temperatura,

tales como enzimas, aire.

Agentes
qumicos

Capacidad Oxidativa o alcalina: Cloracin

que requiere de etapas posteriores para
eliminar el cloro. Ozonificacin.

Mecnicos

Vibracin

Ultrasonido

Centrifugacin a alta velocidad

Degradacin del DNA
Utilizada en tratamiento de efluentes con
flujos bajos

Radiacin
UV, Rayos
X

ESTERILIZACION POR CALOR SECO

a) Flameo o llama directa

b) Aire caliente
Se realiza usando un horno especial que toma el nombre de
horno bacteriologico u horno Pasteur.

ESTERILZACION POR CALOR HUMEDO

Por ebullicin
Vapor de agua sin presin Consiste en colocar el
material a esterilizarse a la accin del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100 oC. Para esterilizar sustancias
que de otra manera se alteran o destruyen a elevadas
temperaturas como la leche, caldo selenito, medios de cultivo
azucarados, etc.
Por vapor de agua con Presin

ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

Por tindalizacin : esterilizacin fraccionada, que Consiste en calentar
el material a 100o C por 30 minutos durante tres das consecutivamente,
con incubacin de los intervalos. Se emplean para esterilizar medios de
cultivo y otras sustancias que no pueden ser calentadas a temperaturas
superiores a 100o C.

Pasteurizacin
Cuando es lenta, consiste en someter el liquido a esterilizar a una
temperatura que flucta alrededor de los 63o C durante 20 minutos y
cuando es rpida, alrededor de 73o C durante 20 minutos aunque no
destruye la totalizada de organismos.
Se usa para la conservacin de la leche, de bebidas alcohlicas,
como vinos, cervezas, etc.

ESTERILIZACION POR FILTRACION

Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la

solucin de nutrientes que son sensibles al calor y que
seran por tanto desnaturalizados durante el proceso de
esterilizacin por vapor utilizado normalmente en
fermentacin industrial. Las vitaminas, los antibiticos o
los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos
lbiles al calor que deben ser esterilizados por filtracin.
El aire exterior tiene 10 - 100.000 partculas por m3 y 5 - 2.000
microorganismos por m3. De estos, el 50% son esporas de
hongos y el 40% son bacterias. (filtros de lana de vidrio, filtros
de cartucho)

Esterilizacin Qumica
No se utiliza ampliamente dado que la mayora de los
desinfectantes tienen baja accin. Adicionalmente pueden
interferir en el crecimiento de los m.o.
Se buscan agentes que:

Acten en forma rpida

No sean caros

No sean inflamables

No sean explosivos

No sean txicos
Los ms utilizados :
-propiolactona

Oxido de etileno (en medio frio)

Fenol o compuestos fenlicos (Cresol, ortofenil fenol)
Alcoholes: Etanol, Metanol
Halgenos: Hipoclorito, Cloroaminas.

Oxido de etileno: es un lquido que hierve a 10,7 C.

Se usa en la industria para la esterilizacin de
placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico
que se funden a temperaturas superiores a los 100
C. Debido a su alto poder de penetracin estos
objetos se empaquetan primero y despus se
esterilizan. El xido de etileno acta inactivando
enzimas y otras protenas que contienen grupos (RSH) mediante una reaccin llamada alquilacin (RS-CH2CH2O-H).

ESTERILIZACIN POR RADIACION

La esterilizacin por rayos ultravioleta (UV) desinfecta alterando el componente
DNA de los microorganismos e impidiendo su reproduccin, por tanto es un medio
no-qumico que inactiva bacterias, esporas, protozoos, levaduras y virus. El UV es un
proceso en lnea, por lo tanto no requiere tanque de contacto, el tiempo de retencin
requerido se mide en segundos en lugar de minutos.

ESTERILIZACIN DE MEDIOS
LQUIDOS

Cintica de muerte de los microorganismos

La cintica de inactivacin de los m.o es una cintica de primer orden respecta al nmero de m.o.
Se expresa como:
- dN/dt = k N

(1)

Donde:
Cintica de Inactivacin

N : Nmero total de clulas viables;

t : tiempo de esterilizacin

Num e ro m .o.

k : Constante de decaimiento o muerte, es funcin de la temperatura,

Su dependencia con la temperatura es del tipo Arrhenius:.

0,8
0,6
0,4
0,2
0
1

7
Tiem po

k ko e

Ea
)
RT

T = f (t)

11

13

Si se integra la expresin (1) se tiene:

t
t
N
k dt N N o exp( k dt )
ln
No 0
o

Si se trabaja a temperatura constante se tiene:

N N o . exp(k .t )

donde No es el nmero de m.o iniciales en el sistema.

RESISTENCIA RELATIVA DE MICROORGANISMOS A LA

DESTRUCCION TERMICA

M.0.

Resistencia Relativa

Clulas de bacterias y Levaduras

1
1-5
2-10
3 000 000

Virus y bacterifagos
Esporas de hongo
Esporas de bacterias

Parmetros de las cinticas de desactivacin de diferentes m.o.

Microorganismo

T
C

Constante
decaimiento
k
sec-1

Energa de
activacin
Ea
kcal/mol

Esporas de B.subtilis

121

0.0051

76

B.stearothermophilus

104
131

0.57
250

67.7

C.Botulinum

104

82

E.coli
Esporas en general

127
121

0.0167

Mas f
c
elimin
a

il de

Efecto de la Temperatura T3>T2 > T1

Ms resistentes

0,8

1
0,9
0,8
0,7

0,4

Numero m.o.

N
u
m
erom
.o
.

0,6

0,2

0,6
0,5
0,4
0,3

0,2

21

41

61

81

101

121

0,1
0

Tiempo

11

13
Tiempo

Esporas Bacillus

Bacillus

Esporas

Comparacin de cinticas de
decaimiento de diferentes m.o

T1

T2

T3

Comparacin de Cinticas de
decaimiento a diferentes temperaturas

Destruccin trmica de clulas de E.Coli

Destruccin

trmica

Stearothermophilus

de

esporas

de

B.

Los datos de la tabla adjunta reportan el recuento de clulas

viables luego de la esterilizacin de un medio a 85 y 90 C.
a. Calcular
la constanteMicroorganismos
de muerte especfica.viables

b. Cmo
vara la energa de
para la muerte
t (min)
85activacin
C
90 C
2400000000
2400000000
0
trmica segn
la temperatura?
0.5
1
1.5
2
3
4

2390000000
2370000000

2330000000
2320000000
2280000000

2380000000
2300000000
2290000000
2210000000
2170000000
2120000000

Diseo de procesos de esterilizacin

Objetivo: Determinar el ciclo de esterilizacin
Se define el factor DEL, (Criterio de Diseo), como:

No
k dt
ln
Nt 0
t

Total

Donde: No nmero de microorganismos iniciales

Nt nmero de microorganismos finales.

Los criterios de diseo son:

1. Si no se conoce k.
2. Imposibilidad de esterilidad absoluta, grado de
esterilidad, deseable a llegar Nt = 10-3 esporas o m.o
(estadstico).
3. Si la esterilidad inicial es desconocida, se asume una
concentracin, N 0 , del orden de 109 esporas/Litro.

N N .V

V : Volumen de liquido a esterilizar

Procesos de esterilizacin

K K 0e

E
RT

El proceso de esterilizacin discontinua comprende tres etapas:

a) Etapa de calentamiento
b) Etapa de mantencin
c) Etapa de enfriamiento
Por lo tanto el factor DEL puede
dividirse en estas tres etapas:

Total calentamiento mantencin enfriamiento

Esterilizacin Batch
Las etapas de calentamiento y/o enfriamiento pueden ser:
Para Calentamiento

a) Vapor Directo (Modelo hiperblico)

b) Resistencia Elctrica (Modelo Lineal)

c) Camisa de calefaccin con fuente isotrmico (Modelo Exponencial)

Vapor
Camisa de Vapor
Resistencia
Elctrica

Esterilizacin Batch
Para Enfriamiento
d) Camisa de enfriamiento alimentada con fuente no-isotrmica y
recirculacin.

Camisa de
Enfriamiento

Los factores DEL

Calentamiento
t2

calentamiento ko exp a
RT
t1

dt

donde la temperatura es una funcin del tiempo, ie. T = f(t)

Dependen del tipo de calentamiento utilizado.

Mantencin
mantencin = kT* t3-t2

t3

KT dt
t2

Enfriamiento

enfriamiento

t4

Ea
ko exp
dt
RT
t31

donde la temperatura es una funcin del tiempo, ie. T = f(t)

Dependen del tipo de enfriamiento utilizado.

Algoritmo para el diseo del proceso de esterilizacin batch.

El objetivo es determinar el tiempo que debe durar la etapa de
mantencin, dado el tiempo de las etapas de calentamiento y
enfriamiento dependen del proceso de transferencia utilizado.
a)
b)
c)
d)
e)

Medir o calcular T = f(t)

Calcular Total = ln (No/Nt)
Determinar perfiles de T vs tiempo de duracin de las etapas
Graficar k vs t, dependiendo del proceso de calentamiento y
enfriamiento.
Integrar el rea de k vs tiempo para las etapas de calentamiento y
enfriamiento. Integracin grfica, algebraica o numrica.

testerilizacion

mantencin total ( calentamiento enfriamiento )

kT
kT

Diseo de sistemas de esterilizacin continua

Los equipos de esterilizacin continua pueden ser de dos tipos:
Inyeccin directa de vapor.
Resultan ser ms eficientes dado que no hay barreras entre el medio y el vapor.

Diseo de sistemas de esterilizacin continua

Intercambiadores de calor.
Placa
Los que deben trabajar a bajas presiones, pero presentan una mayor rea de
transferencia de calor

Tubo y carcaza
Se recomiendan cuando se utilizan lquidos viscosos

Ventajas que presenta la forma de operacin continua v/s la batch

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Presentan mayor reproducibilidad

Tiempos cortos (2 a 3 minutos)
Mejor control sobre el proceso
Equipo compacto
Pueden operar a temperaturas ms altas (>135C)
Son fciles de automatizar (menor mano de obra)
Menor gasto de vapor
Se puede recuperar el calor
Apropiados para procesos continuos

Desventajas que presenta la forma de operacin continua v/s la batch

1.
2.
3.
4.

Instalacin mas rgida en cuanto a cambios de condiciones de

operacin.
Exige gran cuidado en el diseo, montaje y operacin del sistema
para mantener la esterilidad.
Problemas de sobreesterilizacin (o subesterilizacin) de
porciones o zonas de liquido que fluye.
Inadecuado para instalaciones pequeas

Diseo para sistemas de esterilizacin continua

Resultan ser anloga a la forma batch salvo que se debe disear el largo de la zona de
esterilizacin, L en vez del tiempo de esterilizacin.
Conocidos: Te,
Q : Caudal del medio a esterilizar
Se puede calcular la velocidad seleccionando el dimetro de Tubera d Donde la = Q/A

El algoritmo de resolucin debe considerar que en este tipo de proceso de esterilizacin los tiempos
de calentamiento y enfriamiento son despreciables (calentamiento continuo = enfriamiento continuo = 0)
por lo cual se cumple que:
mantencin continuo

ln (No/Nt) = kT* mantencin

El tiempo de mantencin es:

mantencin

ln (No/Nt)/( kT)

El largo del esterilizador se puede calcular por:

L = mantencin *