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Facultad de Qumica
Qumica Analtica Instrumental II
Tcnicas Cromatogrficas
Diciembre de 2007
Captulo 1.
Introduccin a los mtodos de separacin
1.1 Introduccin a la cromatografa
En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo
que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte
superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que la
mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna a
diferentes velocidades.
Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera
que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo
largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se
mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el
experimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de
ellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la fase
estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos
retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o
papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,
logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica.
Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos
cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil:
Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un
slido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien un
lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquidolquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en
columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un
tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor
uniforme; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior
de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquidolquido.
Captulo 1
particin lquido-lquido
de afinidad
intercambio inico
Las reas de aplicacin son muy diversas y abarcan prcticamente todas las actividades en las que
interviene la qumica, por ejemplo: se emplea en:
El anlisis de drogas y frmacos en fluidos biolgicos como la saliva, la sangre, la orina;
Seguir la transformacin de las sustancias responsables de la transmisin neurolgica;
Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente;
Descifrar la composicin de los combustibles fsiles;
Realizar el control de calidad de los productos qumicos y farmacuticos manufacturados; en fin, la lista
de ejemplos es interminable.
Captulo 1
Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas
manchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una
lmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel se
emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia
por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por
la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).
=
[1]
En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de
elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que
ir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentes
que se pretenden separar.
Precio.
Pureza.
No
utilizar
mezclas
de
eluyentes
(catalizadores).
(reproducibilidad).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y
probar con eluyentes cada vez menos polares.
Captulo 1
K+
resina, K+ + H+
Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los iones
solvatados. La fase de resina presenta preferencia por:
1. El ion de carga mayor.
2. El ion con menor radio solvatado.
3. El ion que tenga mayor polarizabilidad.
Aplicaciones de intercambio catinico:
Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajos
en sodio, y en muestras de orina.
Aplicaciones de intercambio aninico:
Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico y
clorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.
Captulo 1
GAS
FLUIDO SUPERCRTICO
LQUIDO
Densidad (g/cm3)
(0,6-2)*10-3
0,2- 0,5
0,6- 2
(1-4) * 10-1
10-3 10-4
(1-3)* 10-4
(1-3) * 10-4
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases,
lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importante
de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su
notable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbono
supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segunda
propiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser
fcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la
atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que son
baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la
atmsfera sin efectos ambientales dainos.
La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la cromatografa
de gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada una de ellas. Esta tcnica es una de
los tres tipos importantes de cromatografa en columna, sta permite la separacin y determinacin de
compuestos que no son manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos
no voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable y (2) los
Captulo 1
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1.10 Electroforesis
Los orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separar
mezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso
al que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquier
especie cargada o alrededor de una doble capa elctrica.
El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de
especies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las
especies se separan en funcin de sus cargas y su movilidad inica en ese medio. Cuanto ms elevado
sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos de
estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente y
acumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable.
Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que
son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente
escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han
utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc.
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1.11 Bibliografa
Braithwaite, A. Mtodos cromatogrficos, 4 ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Pginas 216217, 271-272.
Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jess Hernndez Mndez, Qumica Analtica
Cualitativa, Ed. Thompson, Espaa, 2003 pp 321-322.
Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Anlisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, Espaa 2004, pp
730-739.
Lehninger, Albert. L. Principios de Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega. Barcelona, 1995,
pp 137
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McCABE / SMITH /HARRIOTT. Operaciones Unitarias en Ingeniera Qumica 1991. Cuarta Edicin en
Espaol. Editorial McGraw Hill S.A. Espaa
PERRY, ROBERT H. Manual del Ingeniero Qumico 1992. Sexta Edicin. Tercera Edicin en Espaol.
Editorial McGraw Hill. Mxico
Skoog A. Douglas. Principios de anlisis instrumental, 5 ed., Saunders Collage Publishing, Espana,
2001, pgs.: 785- 791 y 831- 836.
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht
m
http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel
http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml
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Parmetros cromatogrficos
Captulo 2
Parmetros cromatogrficos
2.1 Glosario
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un
separador de banda.
Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale de
cromatografico o de una columna electrofortica.
Coeficiente de difusin: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s.
Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases,
para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD).
Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un mtodo para un interferente dado en
comparacin con su sensibilidad para el analito (KA,I).
Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy
activos en la fase estacionaria.
Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligando
se disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD).
Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor
numrico de K depende de la fuerza inica del medio.
Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria.
Cromatografa gaseosa: tcnica cromatogrfico en la que la fase mvil es un gas.
Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen.
Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se suele
expresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en que
la distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianza
dividida entre la longitud de la columna del empacado.
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Parmetros cromatogrficos
Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza
desde el punto de inyeccin al detector.
Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k).
Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad
de la columna para uno de ellos ().
Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entre
el analito y el interferente.
Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posicin fija.
Fase mvil: fase extractarte que se desplaza a travs del sistema.
Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir su
eficiencia.
Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una
columna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto
entre las fases mvil y estacionaria
Relacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacin
con una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D).
Resolucin: separacin entre dos bandas cromatogrficas (R).
Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un mtodo que se mide ante el cociente de
selectividad del mismo.
Tiempo de retencin: es el tiempo entre la inyeccin en una columna cromatogrfica y la llegada a un
pico de analito al detector.
Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.
Captulo 2
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Parmetros cromatogrficos
Un parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,
una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodos
facilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y la
resolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con
descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.
1
2
Captulo 2
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Parmetros cromatogrficos
Una medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (o
factor de retencin), k
=
FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.
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Parmetros cromatogrficos
Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separacin, , donde
dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2:
= k2 / k1
El factor de separacin, , es usualmente identificado con la selectividad del sistema
cromatogrfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retencin para dos
compuestos especficos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significara que no hay
separacin, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retencin muy largos se
traducen en tiempo desperdiciado durante la operacin experimental. Los valores de depende de los
dos solutos y de
1) La composicin qumica de la fase estacionaria.
2) La composicin qumica de la fase mvil (excepto en cromatografa de gases).
3) La temperatura.
En cromatografa de fluidos supercrticos, la presin tambin puede afectar a al cambiar la densidad de
la fase mvil.
FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos .
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Parmetros cromatogrficos
valor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La
altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de
la columna, X:
=
2
X
donde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos la
anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto
el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.
El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por:
=
= 2
16 2
W2
La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,
con lo cual se puede utilizar
= 5.545
1/2
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Parmetros cromatogrficos
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados y
columnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la
fase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener el
mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiado
tiempo en anlisis.
+
+
2.7 Resolucin
La separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se define
como
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Parmetros cromatogrficos
=
2 1
1
( + 2 )
2 1
Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.
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Parmetros cromatogrficos
2.9 Resumen
La cromatografa es una tcnica de separacin que se basa en la diferencia de distribucin que
existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y mvil. As, cada soluto tendr un
tiempo de retencin distinto y podrn analizarse por separado.
Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientas
que ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo.
Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como el
factor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nos
indicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacin
entre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nos
indicar la eficiencia del sistema.
Una vez evaluados los parmetros cromatogrficos, se podr determinar si el cromatograma
obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condicin para optimizarlo.
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Parmetros cromatogrficos
2.10 Bibliografa
Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related
differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edicin, EUA, 1992, pp. 2-14
Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM,
Mxico 2002
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr14/skoog/26d.html
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Captulo 3
Cromatografa en fase lquida a columna abierta
3.1 Procedimientos de empaquetamiento
En cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende a travs de la
columna. La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un tubo capilar o
la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas
partculas slidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el
reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.
Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad
que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena
con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las
columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil.
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase
estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial,
inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan,
entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de
intercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a un
tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico que
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Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos
de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.
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Aplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para la
separacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestos
con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada para
separar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambin
se ha usado para obtener protenas biliares.
Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama
particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre
las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la
matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el
analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa
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Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene
diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla
se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la
columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.
Aplicaciones.
inmiscibles.
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El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel
(V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen del
lquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).
El volumen de elusin (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: Ve V0 K d Vi
Kd es el coeficiente de distribucin volumtrica: K d (Ve V 0) / Vi
Kd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gel
que es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una
serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:
En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta:
K d A B log M
La separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de la
red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material
para el gel: xerogeles y aerogeles.
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente
suave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el
vidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel
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KD
K [ HR]
[H ]
Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir
por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar un
intercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejos
de carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos,
se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.
Aplicaciones.
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Aplicaciones.
depuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).
2.14 Resumen
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con
partculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho
con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de
dos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)
Verificacin de compactacin (no espacios vacos).
El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolvente
empleado para el proceso.
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2.15 Bibliografa
BERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma
edicin, Madrid 1991.
HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001.
ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003.
SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - New
York, 1975.
PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981.
BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994.
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm
www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm
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Cromatografa de gases
Captulo 4
Cromatografa de gases
Esta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar los
componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado
notablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos)
de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido y
sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidades
muy pequeas de muestra.
En cromatografa de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna
cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de un fase mvil de un gas inerte a diferencia de los
otros tipo de cromatografa, la fase mvil no interaccionan con la molculas del analito; su nica funcin
es la de transportar el analito a travs de la columna.Existen dos tipos de cromatografa de gases:la
cromatografa Gas-Slido (GCS) y la cromatografa gas liquido (GLC).La cromatografa gas liquido tiene
gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como
cromatografa de gases (GC).
En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionaria
como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitada
debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de
elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin),
de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas
especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin del
analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slido
inerte.
4.1 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran a
continuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utiliza
cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la
presencia de las molculas de analito.
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37
Cromatografa de gases
helio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de
presin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo un
tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente
mediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo de
regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo.
sea de un tamao adecuado y que sea introducida como un <tapn> de vapor, la inyeccin lenta de la
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .El
mtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una
muestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cmara de
vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente esta
unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
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Cromatografa de gases
excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas
abiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m de
longitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln.
La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de
regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de
temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullicin de la
muestra y del grado de separacin requerida.
Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientes
caractersticas.
1.- adecuada sensibilidad
2.- buena estabilidad y reproducibilidad
3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud
4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos
400C
5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal
6.-alta fiabilidad y manejo sencillo
7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente
predecible para uno o ms tipos de soluto
8.-no destructivo de la muestra.
Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna y
que se denomina resolucin de la columna y se define:
=
2 2 1
1 + 2
2 2 1
Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos como
para que baste medir slo uno.
Captulo 4
39
Cromatografa de gases
Como lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa de
los solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contiene
casi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para el
mismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto
aumentando el nmero de platos tericos.
Baja volatilidad, su punto de ebullicin debe de ser por lo menos 100 C superior a la
temperatura mxima de operacin de la columna.
Estabilidad trmica.
Captulo 4
40
Cromatografa de gases
Inercia qumica.
Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estar
dentro de los intervalos aconsejados.
La separacin en cromatografa gas-lquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del
analito entre la fase mvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los
compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una caracterstica muy importante de la fase estacionaria
es la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen
ms en las fases lquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las
compuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, los
alcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y
son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la fase
estacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la fase
lquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la
o
presin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullicin) por encima de esta
temperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,
suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.
En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero de
tomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de punto
de ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad de
puntos de ebullicin.
Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en las
columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase
lquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase
mvil y fase estacionaria.
2
Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m /g); una
superficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de las
partculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa.
Captulo 4
41
Cromatografa de gases
Los soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; de
vidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos de
algas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen
2
una superficie especfica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO (90%),
2
tratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb
W de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares.
Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,
tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no se
puede utilizar con compuestos polares.
Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en las
columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado
picos cromatogrficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la
superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicas
polares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el
2
3 2
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT,
de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto.
Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto
con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte
interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de
relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a
las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores
cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en
primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares
abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin
Captulo 4
42
Cromatografa de gases
apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo
proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede
enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de
2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de
10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja
reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.
Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m para
columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms
sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de
hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores
prestaciones.
En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de la
slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente
con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por
sililacin con DMCS. La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada
pureza de la slice empleada.
43
Cromatografa de gases
La cromatografa gas-slido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas
abiertas. En estas ltimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa del adsorbente; estas
columnas a veces se denominan columnas abiertas de pared porosa, o columnas PLOT. Se encuentras
dos tipos de adsorbente: los tamices moleculares y los polmeros porosos.
44
Cromatografa de gases
En la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicacin caracterstica de una columna
abierta revestida con un polmero poroso (columna PLOT).
4.4 Aplicaciones.
Se sabe que los cidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL
en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de cidos grasos trans aumenta el riesgo de
enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupacin por los cidos grasos trans requiere de
mtodos precisos y convenientes para el anlisis de productos comerciales.
Los mtodos analticos disponibles
actualmente
incluyen:
cromatografa
de
gases,
espectroscopia de infrarrojo, y cromatografa de gases de capa fina (AgNO3- TLC- GC, por sus siglas en
ingls). Dentro de estos mtodos la cromatografa de gases se ha usado preferencialmente dado su
conveniencia y su sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno son
las fases estacionarias comnmente usadas en el anlisis de cidos grasos trans en correspondencia a la
necesidad por una alta resolucin entre los picos de los metil- esteres de los cidos grasos (FAME).
Existen varios mtodos analticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los
mtodos del AOAC (Asociacin Oficial de Qumicos Agricultores) y AOCS (Asociacin Americana de
Qumicos y Aceites) (por sus siglas en ingls).
A pesar de que el mtodo de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un
tiempo de anlisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificacin de
los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos econmicos
debidos a el uso de un estndar caro.
Por lo tanto debe buscarse un mtodo ms conveniente de GC, particularmente para el
propsito de control de calidad.
Captulo 4
45
Cromatografa de gases
Mtodo 1
TM
Mtodo 2
TM
Columna
TC- 70
Fase estacionaria
Longitud
30m
100m
Dimetro interno
0.25mm
0.25mm
Grosor de pelcula
0.25m
0.20m
Temperatura
190C
180C
Inj/Det
250C/260C
250C/250C
Gas acarreador
1 ml/min Helio
1 ml/min Helio
Split
100:1
100:1
1l
1l
Volumen inyectado
Tiempo de corrida
(GL- Science)
Mtodo 3
60m
18min
40 min
SP-2560
(Supelco Inc.)
74min
Captulo 4
46
Cromatografa de gases
Tabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificacin de derivados de anfetaminas en orina
por GC-MS
4.5 Resumen
La cromatografa de gases constituye un poderoso instrumento en la determinacin de los
componentes de una muestra, al permitir tanto la separacin de stos como su deteccin individual. Una
gran ventaja de este mtodo es la rapidez y su lmite de deteccin, un requisito indispensable para el
anlisis es que la muestra debe ser voltil.
Dependiendo de la fase estacionaria utilizada la cromatografa de gas se subdivide en: gaslquido y gas slido.
En el caso de la cromatografa de lquidos, los parmetros dependen del poder del eluyente (la
polaridad de este); para la cromatografa de gases, los parmetros dependen de la temperatura a la cual
se est trabajando y del flujo del gas de arrastre.
Las partes esenciales de un equipo de cromatografa son: fuente de gas portador, sistema de
regulacin de caudales, bloque termostatado de inyeccin de las muestras, columna termostatada,
detector termostatado, con amplificador de seal y registro grfico y caudalmetro de precisin.
4.6 Bibliografa
http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm
http://instrumental.uprh.edu
BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Qumica Analtica generla, cuantitativa e
instrumental. Vol. 2. 6ta. Edicin. Ed. Paraninfo. Madrid 1991.
SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental,Madrid: McGraw-Hill.
Pirnay et al. Sensitive Gas Chromatography Mass Spectrometry Method for Simultaneous
Measurement of MDEA, MDMA, and metabolites HMA, MDA, and HMMA in human urine. Drug
Monitoring and Toxicology. Clinical Chemistry 52:9. 1728-1734. (2006).
Shirasawa et al. A Rapid Method for Trans- Fatty Acid Determination Using a Single Capillary GC
.Journal of Oleo Science. J. Oleo Sci. 56 (2) 53- 58. (2007)
Rubinson, Kenneth. Analisis Instrumental. Editorial Pearson Education, Madrid 2001. pps 680700.
Captulo 4
47
Captulo 5
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra mvil. En cromatografa
lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase
estacionaria. La cromatografa lquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. Despus se coloca la
muestra por la parte superior y se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la
gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la cromatografa de alta resolucin; el
tamao de las partculas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando altas presiones para lograr
que la fase mvil pueda fluir.
Tipo de fase
mvil
Tipo de fase
estacionaria
Particin
Lquido
Lquido
Adsorcin
Lquido
Slido
Papel
Lquido
Lquido
Capa delgada
Lquido
Lquido o slido
Gel
Lquido
Lquido
Intercambio
inico
Lquido
Slido
Captulo 5
48
Aplicaciones:
muestras solubles en
Captulo 5
49
Aplicaciones:
relacionadas. Ejemplos tpicos son la resolucin de los numerosos aminocidos formados en la hidrlisis
de una protena, la separacin y anlisis de alcoholes alifticos y la separacin de derivados de azucares.
50
Aplicaciones: encuentra mucho uso en los analizadores para aminocidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgnicos y bioqumicos incluyendo frmacos y sus metabolitos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas.
Figura 3.-Cromatografa Inica (a) Separacin de aniones en una columna de intercambio aninico. (b) separacin
de iones alcalinotrreos en una columna de intercambio catinico .
51
Figura 4.- Cromatograma Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. Bovine serumalbumin; 4.
ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.
52
Aplicaciones:
finalidad didctica, tambin para la separacin de muestras clnicas y bioqumicas as como en otras
aplicaciones analticas generales por su gran sencillez y bajo costo.
Figura 5.- Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de slice) de algunos aminocidos. Disolvente A:
tolueno/2- cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/cido actico. Aminocidos: (1) cido
asprtico, (2) cido glutmico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9)
isoleucina y (10) cistena.
Captulo 5
53
5.8 Instrumentacin.
Un equipo para HPLC puede ser representado por la siguiente figura 6
La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es
que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan
interferir en la elucin de la muestra o bien que contengan algunas pequeas partculas que puedan
tapar la columna; por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna.
Dependiendo del equipo, cuando se trata de una mezcla de disolventes; se puede o no
programar la bomba para que tome las cantidades adecuadas de cada disolvente o bien, algunas otras
bombas (las ms antiguas) no tienen la capacidad de realizar esta mezcla y por lo tanto esta se tiene que
preparar por nosotros. Cuando durante toda la separacin se usa el mismo disolvente, se denomina
isocrtica.
La bomba enva el disolvente hacia la vlvula inyectora que es una vlvula de seis vas que
permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan al detector. El cual da una
seal elctrica proporcional a la cantidad de materia; esta seal es enviada al registrador que a su vez da
un cromatograma de intensidad en funcin del tiempo (figura 7); en el cual, lo ideal es obtener picos
gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.
Captulo 5
54
Captulo 5
55
donde KA es la constante de distribucin del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y
Vm el volumen del soluto en la fase mvil (Skoog y cols., 2001).
5.11 Selectividad
El factor de selectividad de una columna para dos solutos, A y B, se define como la relacin de la
constante de distribucin del soluto retenido con ms fuerza, B, y la constante de distribucin del soluto
retenido con menos fuerza, A:
=
5.12 Eficiencia
La eficiencia de una columna cromatogrfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre
cuando un compuesto pasa a travs de la columna. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de
las columnas cromatogrficas se emplean dos trminos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o
nmero de platos tericos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin:
=
donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatogrficas
aumenta a medida que es mayor el nmero de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes
diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de
las fases mvil y estacionaria. En trminos de nmero de platos tericos, la eficiencia puede variar desde
unos centmetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos vara desde unas dcimas hasta
milsimas de centmetro y son comunes incluso mas pequeas (Skoog y cols., 2001).
Captulo 5
56
2
2
=
+
+
Se puede mejorar la resolucin para una fase estacionaria determinada alargando la columna, lo
que incrementa el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de aadir platos es un
incremento en el tiempo necesario para la separacin de los componentes (Skoog y cols., 2001).
SF=A/B
Captulo 5
57
5.16 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC son:
A)
B)
C)
D) Columna cromatogrfica
E)
F)
Detectores
Como algunas de las fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas como
cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estn fabricados con
materiales resistentes, por lo que la mayora de las partes en contacto con la fase mvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable (Hernndez L. 2002).
Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes
orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y
degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas de slice muy
puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001).
Captulo 5
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Captulo 5
59
Columna para HPLC. Fuente: P.V.G. Lab. 3-D, Facultad de Qumica, 2007
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna
con otra ms corta, la precolumna, que retiene por adsorcin las impurezas de forma irreversible (Harris,
D. 2001).
E) No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, pero las separaciones resultan
ms reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante. Los instrumentos comerciales
modernos estn equipados con calentadores que regulan la temperatura de la columna.
F) El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los componentes, y proporcionar
indicacin cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la
muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena
estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la
temperatura. Se pueden clasificar de la forma siguiente: (Hernndez, L. 2002)
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentracin del soluto y se registra
en funcin del tiempo y obtenindose una serie de picos, generndose un grafico que se denomina
cromatograma. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra.
Captulo 5
60
61
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el
nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima
detectable y el lmite inferior del rango lineal.
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal
que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est
operativo sin que alguna sustancia pase a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
La separacin efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un
cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel la evolucin, en
funcin del tiempo, de un parmetro que depende de la concentracin instantnea del soluto a la salida
de la columna. Este grfico se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y
Rouessac, 2003).
Captulo 5
62
5.17 Bibliografa
BERMEJO, M. F. Qumica analtica general, cuantitativa e instrumental . Vol. 2. Ed. Paraninfo, S. A.
Madrid. 1991.
HARRIS, D. C. Anlisis qumico cuantitativo. Ed. Reverte, S. A. Barcelona. 2001.
HERNNDEZ, L. y GONZLEZ, C. Introduccin al anlisis instrumental. Ed. Arial Ciencia. 2002.
KIRK, R. S., SAWYER, R., EGAN, H. Compuestos y anlisis de alimentos de Pearson Ed. Continental, S.
A. Mxico. 1996.
LORO, J. F. Manual de cromatografa. Coleccin Textos Universitarios. 2001
ROUESSAC, F. y ROUESSAC, A. Anlisis qumico: Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Ed. Mc
Graw Hill. 2003.
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J. Qumica analtica. Ed. Mc Graw Hill. 7 edicin. 2001.
SKOOG, A y LEARY Anlisis instrumental. Ed. Mc Graw Hill. 1998
Captulo 5
63
64
Captulo 5
65
Aplicaciones.
Captulo 5
66
Fundamento
Es un proceso en el que una solucin de un electrolito es puesta en contacto con una resina
intercambiadora, en donde los iones activos de la resina son reemplazados por aquellos iones de la
misma carga presentes en el analito.
Resinas.
Inicialmente
la
fase
estacionaria
constaba
de
resinas
preparadas
por
policondensacin, de fenoles ya minas aromticas con formaldehdo. Algunos grupos inorgnicos eran
introducidos por condensacin de formaldehdo con sulfo o carboxil derivados. Actualmente estas se han
reemplazado por materiales basados en estireno (poliacrilatos y divinilbencen derivados) los cuales
pueden ser modificados para adaptar el tamao de partcula, as como para mejorar la selectividad y la
capacidad de retencin de la columna.
Captulo 5
67
funcionales a pH bajos. Elevado hinchamiento y contraccin lo que hace aumentar las prdidas de carga
o provocar roturas en las botellas cuando no cuentan con suficiente espacio en su interior. Se trata de
una resina muy eficiente, requiere menos cido para su regeneracin, aunque trabajan a flujos menores
que las de cido fuerte. Es habitual regenerarlas con el cido de desecho procedente de las de cido
fuerte.
Resinas aninicas de base dbil. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos
sosa para su regeneracin. No se puede utilizar a pH altos. Pueden sufrir problemas de oxidacin o
ensuciamiento.
Propiedades de las resinas:
1.
2.
3.
Tamao de la partcula
Estos se basan en los requerimientos estndares (50 mesh)
Captulo 5
68
Selectividad de la Resina.
funcin de la resina y de los iones. Esto se puede expresar como un equilibrio de la siguiente forma:
n(R- H+ ) + Mn+1 ( R- )n Mn+ + n H+
Donde R representa la matriz y puede establecerse la constante de equilibrio como se muestra:
Kd = [Mn+]r [H+]n / [M m+] [H+]n r
Donde el ltimo trmino representa las concentraciones de los iones. Entre mayor sea el valor se
Kd mayor ser la afinidad de la partcula por la resina intercambiada y en consecuencia aumentar la
capacidad de intercambio.
Fuerza inica
pH
Temperatura
Buffer
Observaciones
La fuerza del solvente incrementa la fuerza inica y en
consecuencia la selectividad se ve afectada
La retencin disminuye en la resina catinica y se incrementa en la
resina aninica cuando se modifica el pH a valores a mayores
Elevando la temperatura se aumenta el grado de intercambio entre
la fase mvil y la fase estacionaria
Pude aumentar el valor de Kd cuando se modifica la fase
[4]
estacionaria .
5.25 Aplicaciones
Esta tcnica tiene una de sus aplicaciones primordiales en el campo del anlisis clnico, en donde
se utiliza comnmente para la determinacin de la presencia de desrdenes metablicos cuando se
separan aminocidos y otras aminas de importancia fisiolgica de las muestra de las pacientes. En
condiciones normales, los aminocidos se separan en su forma protonada como cidos, utilizando
diferentes combinaciones de buffers de citratos y boratos. Posteriormente estos aminocidos pueden
ser caracterizados por medio de tcnicas como espectroscopia UV y fluorescencia.
En la separacin de carbohidratos, en las cuales se utilizan ligantes sobre un resina polimrica,
con algunos metales como Ca2+ (recomendado para alcoholes) y Ag+ (para estructuras oligomericas),
utilizando agua destilada o una mezcla de solventes orgnicos como fase mvil. La retencin en este
caso se ve determinada por la atraccin electrosttica entre grupos electronegativos (OH-) y
electropositivos (Ca2+) y adems por el impedimento estrico entre grupos [5].
Captulo 5
70
1.
Fundamento
de
la
analitos
catinicos,
como
Captulo 5
71
Empaques de la columna.
1 000 8 000
10
1 000 30 000
25
55
150
250
Captulo 5
72
Disolventes.
muestra. Si la diferencia en la viscosidad entra una muestra inyectada y la fase mvil es muy grande,
puede producirse la distorsin del pico y anomala en los tiempos de elusin.
Detectores.
Comportamiento de la retencin.
caracterstica de los empaques de las columnas se puede describir en trminos muy simples. Si se
supone que el tiempo que toma un soluto para difundirse dentro de un poro es pequeo con respecto al
tiempo que la molcula est en la vecindad del poro, entonces el proceso de separacin es totalmente
independiente del proceso de difusin, esto se representa de la siguiente forma (coeficiente de
distribucin:
VR VM
VS
Se puede enunciar como la fraccin interna del volumen de poro que es accesible al soluto.
Donde VR (volumen de retencin): es el volumen de eluyente que fluye de una columna entre la
inyeccin de la muestra y su salida en el eluyente; VM: es el volumen ocupado por la fase mvil (esto es,
en los intersticios entre las partculas porosas llenas de disolvente), que s e estima con la elucin de un
soluto totalmente excluido; VS: es el volumen interno acumulado dentro de los poros de las partculas y
disponible para un soluto totalmente incluido o para las molculas del disolvente.
Las molculas totalmente excluida eluyen en un volumen vaco, esto es, VR=VM y por lo tanto
K=0. Para las molculas pequea que pueden entrar en todos los poros del empaque, VR=VM+VS y, por lo
tanto, K=1. Las molculas de tamao intermedio eluyen entre estos dos lmites y K se encuentra en el
intervalo de 0 a 1.
Captulo 5
73
5.27 Aplicaciones
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras fisiolgicas en las
que la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, se realiza con facilidad con columnas de
exclusin de aniones. Vino, cerveza, jugo de fruta y muchos productos lcteos se analizan rpidamente
con una preparacin mnima de la muestra (generalmente slo filtracin o centrifugacin). Otra
aplicacin es la separacin de oligosacridos y azcares de alcohol con una columna de exclusin de
aniones en la forma inica de calcio con agua como eluyente y una temperatura de 90C. La maltotriosa
y otros oligosacridos superiores se separan del mono y los disacridos por efectos de exclusin estrica.
En bioqumica la separacin de pptidos, protenas y dems molculas biolgicas es importante y se
puede separar efectivamente por este mtodo [7].
preparan uniendo covalentemente a la superficie de la slice una especie orgnica de hidrocarburo. Los
soportes incluyen geles de slice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartculas. El
siloxano se ha convertido en el estndar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la
porcin hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase mvil. Las fases
monomricas responden rpidamente a los cambios en la composicin de la fase mvil, cuando son
mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentndose adsorcin en la
interfase o entrecara adsorbente-disolvente en adicin al equilibrio de reparto lquido lquido
esperado.
Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas
longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este ltimo puede
utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un mximo de retencin.
Captulo 5
74
formas es el modo ms ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los mtodos de
cromatografa lquida. Esta tcnica es la que probablemente proporcionar retencin y selectividad
ptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrgeno o no tienen un carcter
predominantemente aliftico o aromtico. El mtodo es muy apropiado para separar solutos con base
en el tamao y estructura de los grupos alquilo.
En qumica clnica cada vez se realiza con ms frecuencia el anlisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de esta tcnica. Los productos farmacuticos que se analizan en forma rutinaria
incluyen a los barbitricos, drogas antiepilpticas, analgsicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los
mtodos de fase inversa son los preservativos alimentarios, herbicidas y azcares.
En el campo farmacutico ha venido en aumento el uso de esta tcnica a costa de la
cromatografa de adsorcin. Un amplio espectro de biomolculas, lipoflicas o inicas, pequeas o
grandes, pueden ser cromatografiazas debido a que el contenido de agua en la fase mvil puede variar
desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto. Los compuestos lipoflicos, tal como
los triglicridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con
Captulo 5
75
Bibliografa
[1]
L. R. Snyder. (1992). Chromatography, Part A: fundamentals and techniques. 5th edition. Editado
[3]
Satinder Ahuja, (1990). Chiral Separations by Liquid Chromatography. 1st Edition. Maple pres:
New York.
[4]
[5]
[6]
Harris Daniel C., (2001), Anlisis Qumico Cuantitativo, 2da Edicin, Editorial Reverte, Espaa,
pp.740-743.
[7]
Willard. (1991) Mtodos instrumentales de anlisis Edit. Iberoamrica S.A. de C.V. Mxico.
Captulo 5
76
Tcnicas acopladas
Captulo 6
Cromatografa y tcnicas espectroscpicas acopladas
Los mtodos de acoplamiento combinan las capacidades de separacin de la cromatografa con
las de deteccin cuantitativa y cualitativa de los mtodos espectrales tales como infrarrojo, resonancia
magntica nuclear y masas, entre otros. A estas tcnicas se les denomina en ocasiones tcnicas
hifenadas.
En los primeros mtodos de esta categora los eluyente de la columna cromatogrfica se
recogan como fracciones separadas en una trampa fra, despus de lo cual se usaba un detector no
selectivo ni destructivo para la identificacin de su presencia. Posteriormente, se investigaba la
composicin de cada fraccin por espectroscopia de resonancia magntica nuclear, infrarroja, masas o
con medidas electroanalticas. Una importante limitacin de esta aproximacin era la pequea cantidad
(usualmente de micromoles) de soluto contenida en las fracciones. Sin embargo, hoy da muchos
mtodos hifenados monitorizan el efluente de la columna cromatogrfica de manera continua, con
mtodos espectroscpicos dando como resultado una combinacin de dos tcnicas, que basadas en
principios distintos, permiten lograr una enorme selectividad.
Captulo 6
81
Tcnicas acopladas
Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una tcnica poderosa de separacin con una
herramienta poderosa de identificacin. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de toda la
separacin cromatogrfica. As pueden registrarse inequvocamente los picos y comprobar incluso su
pureza, es decir si la separacin ha sido completa o se ha producido en algn momento la co-elucin de
dos compuestos.
Tal vez una de las desventajas de esta tcnica es que los espectros de masas de los compuestos
orgnicos analizados por esta tcnica, dependen de las condiciones de anlisis, principalmente del tipo
de fase mvil y del potencial de ionizacin aplicado; ya que comnmente a partir del espectro de masas
se obtiene normalmente el in molecular y fragmentos que proporcionan a su vez el peso molecular del
compuesto. En tanto que en la tcnica del HPLC-MS, el in molecular forma fragmentos con el
disolvente empleado en la fase mvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular
del compuesto analizado. Razn por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrn que
contengan los compuestos objetos del anlisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente
potencial y ionizacin), para conocer el espectro de masas caracterstico del compuesto en cada caso.
Sin embargo pese a ello esta tcnica resulta extremadamente til en el anlisis de ultratrazas
(ng/kg) de compuestos orgnicos. Donde un anlisis de tan bajos niveles de concentracin (ultratrazas)
puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad y que se
cumula en los organismos vivos. Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los
dibenzofuranos policlorados (PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos
vivos principalmente ya que se acumulan en la materia orgnica del suelo.
Captulo 6
82
Tcnicas acopladas
Otra de las aplicaciones de esta tcnica, es la identificacin de analitos desconocidos, ya sea como
productos secundarios de sntesis, anlisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas comerciales,
la identificacin inequvoca de sustancias de estructura similar, para las que un simple espectro masas
es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una herramienta muy selectiva que se
emplea hoy da permite la identificacin de algunos pptidos y protenas.
83
Tcnicas acopladas
El detector de UV-visible es de longitud de onda variable o espectrofotomtrico es el ms usado
ya que ofrece como ventaja la libre seleccin de longitud de onda de trabajo sin necesidad de cambiar
filtros o lmparas. Permite trabajar desde 190 hasta 700 u 800nm debido a que utiliza una red de
difraccin consistente en un prisma que posibilita, mediante su rotacin, seleccionar la longitud de onda
de trabajo de forma continua y no discreta como los detectores fotomtricos.
Estos detectores utilizan tambin como fuente de luz una lmpara de deuterio o halgeno, que
en algunos modelos puede ser intercambiada por una de tungsteno para la deteccin en el rango visible.
Al ser constructivamente ms complejos que los detectores fotomtricos son algo menos sensibles y ms
costosos.
La espectroscopia de ultravioleta (UV) es de mucho valor, especialmente en HPLC. El espectro UV
es muy utilizado para corroborar la identidad, ya que la identificacin basada en una sola longitud de
onda del rango UV puede presentarse a interferencias. En los detectores de arreglo de diodos (DAD) el
espectro UV puede ser registrado en computadora y comparado con el del compuesto sospechosos para
corroborar su variedad
As mismo en la industria lctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinacin de
vitamina D3 en determinacin de productos derivados de la leche y en premezclas vitamnicas. Esto
debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus
derivados en cantidades muy bajas. Por esta razn, industrialmente se adiciona la misma a algunos
productos lcteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinacin del contenido de
vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lcteo
terminado.
Otra de las aplicaciones de esta tcnica es la determinacin de sulfonamidas, nitrofuranos y
cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibiticos y otros quimioteraputicos
inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento
industrial de la misma, adems de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparicin
de cepas de microorganismos patgenos resistentes a los mismos.
El control de estas sustancias se basa en la extraccin selectiva de los residuos de sulfonamidas,
nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se
evapora hasta sequedad a presin reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M
desgrasndose por particin con hexano. La fase acuosa (buffer) contendr los residuos de sulfonamida,
Captulo 6
84
Tcnicas acopladas
nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatgrafo de lquidos de
alta resolucin con deteccin de UV-visible y columna de fase reversa (C18).
As mismo en la industria lctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinacin de
vitamina D3 en determinacin de productos derivados de la leche y en premezclas vitamnicas. Esto
debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus
derivados en cantidades muy bajas. Por esta razn, industrialmente se adiciona la misma a algunos
productos lcteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinacin del contenido de
vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lcteo
terminado.
Otra de las aplicaciones de esta tcnica es la determinacin de sulfonamidas, nitrofuranos y
cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibiticos y otros quimioteraputicos
inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento
industrial de la misma, adems de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparicin
de cepas de microorganismos patgenos resistentes a los mismos.
El control de estas sustancias se basa en la extraccin selectiva de los residuos de sulfonamidas,
nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se
evapora hasta sequedad a presin reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M
desgrasndose por particin con hexano. La fase acuosa (buffer) contendr los residuos de sulfonamida,
nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatgrafo de lquidos de
alta resolucin con deteccin de UV-visible y columna de fase reversa (C18).
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Tcnicas acopladas
cromatografa HPLC-RMN los experimentos son los mismos que en la cromatografa convencional, pero
el agua se sustituye por agua deuterada. El uso de disolventes deuterados orgnicos en general es
demasiado caro. Para un ajuste correcto del receptor de la ganancia RMN instrumento, la intensidad de
las seales de disolvente debe reducirse a la altura de la muestra mediante la aplicacin de una tcnica
de represin del disolvente.
La combinacin de tcnicas de separacin cromatogrfica con espectroscopa de RMN es uno de
los ms poderosos y los mtodos de ahorro de tiempo para la separacin y la determinacin estructural
de compuestos desconocidos y mezclas. Especialmente para la elucidacin de la estructura de sustancias
sensibles a la luz y el oxgeno, por ejemplo cidos de lpulo amargo y estereoismeros de carotenodes.
no se puede obtener informacin segura de la zona del espectro en el que el disolvente absorbe
fuertemente
2.- Acoplamiento con eliminacin del disolvente (previa a la identificacin IR): debe cumplirse la
condicin de que los analitos sean mucho menos voltiles que los componentes de la fase mvil para
lograr una volatilizacin selectiva. Se usa un muestreador con varios pocillos que contienen mg de KCl
Captulo 6
86
Tcnicas acopladas
soportados sobre una placa metlica. El efluyente cromatogrfico es rociado en un tubo concentrador,
usando nitrgeno que evaporara un 90 % del disolvente; al entrar un pico a dicho tubo se abre una
vlvula y se vierte el contenido en los pocillos del muestreador (se vierte de pozo en pozo al cerrarse y
abrirse la vlvula). La deteccin se realiza por reflectancia difusa.
Captulo 6
87
Tcnicas acopladas
Los instrumentos de CG/MS se han utilizado para la identificacin y caracterizacin de sabores,
olores en los alimentos, identificacin de contaminantes en el agua, llevar a cabo diagnostico medico
basado en componentes del aliento y estudio sobre los metabolitos de drogas.
88
Tcnicas acopladas
cromatogrma (c) comprobar la pureza de espectral. (d) Comparar los espectros obtenidos con
los almacenados para identificar a los analitos.
Muestra representativa de una determinacin de herbicidas en los sedimentos de una plata industrial
89
Tcnicas acopladas
procesos naturales). Pese a que estas tcnicas presentan una gran sensibilidad (generalmente el lmite
de deteccin es inferior al ng), siempre son necesarias tcnicas de preconcentracin debido a que se
encuentran en niveles sumamente bajos en la naturaleza. Lo limites de deteccin alcanzados para
compuestos organometlicos de plomo son 250pg Pb/m3 para tretrametilplomo y 375pg Pb/m3 para
tetraetilplomo.
Figura: Una de dichas tcnicas presente dos etapas: En la primera tiene lugar la retencin de los analitos en un tubo
de absorcin de polmetro poroso. La segunda etapa la desorcion-determinacin contina con la hibridacin CGEAA. Se utiliza una corriente adicional de hidrogeno y un tubo de cuarzo sobre la llama.
Captulo 6
90
Tcnicas acopladas
discontinuidad implcita de la deteccin por la necesidad de establecer ciclos precisos de incrementos de
temperatura para cada medicin por eso todo acoplamiento de este tipo debe ser de modo discontinuo
Otra posibilidad es HPLC-EAA (cmara de grafito); en general constan de dos vlvulas de
apertura/cierre, una mltiple de desvi y otra de inyeccin cuyo funcionamiento controlado por un
secuenciador es clave. Este secuenciador controla adems el funcionamiento de la bomba a alta presin,
los ciclos de temperatura en la atomizacin y el funcionamiento del EAA .La vlvula de inyeccin
introduce alcuotas a travs de u capilar de tntalo.
Las dos vlvulas de apertura/cierre permanecen cerradas durante el periodo de calentamiento
programado del tubo de grafito y posteriormente son abiertas cuando se realiza la inyeccin de la
siguiente muestra, Estas vlvulas tambin pueden permanecer abiertas y as la mayor parte del efluyente
no es enviado al instrumento de de medida, inyectando alcuotas despus de cada ciclo de
calentamiento.
Una posibilidad mas es de conectar HPLC con EAA (cmara de grafito) se utiliza un muestreador
comercial adaptado a la absorcin atmica con cmara de grafito. El eluyente cromatogrfico puede ser
recogido en su totalidad en los pocillos a intervalos regulares de tiempo o bien puede programarse de
tal forma que el eluyente valla alternativamente a los pocillos receptores y al desecho segn lo
programado.
Estas interfases son ms complejas respecto a las que origina un atomizador de llama, pero la
vaporizacin electrotrmica origina sensibilidades superiores, de ah su atractivo.
6.9 Resumen
El acoplamiento instrumental se define como la combinacin a travs de una interfase adecuada
de dos tcnicas analticas independientes, que genera informacin nica e integral de la composicin de
la muestra, la cual se caracteriza por ser ms completa que la informacin alcanzada
independientemente por cada tcnica. La razn es que se combinan el elevado poder de separacin de
la cromatografa para una amplia mezcla de analitos y el elevado poder de discriminacin e identificacin
que poseen estas tcnicas determinativas.
En general todas las tcnicas de acoplamiento constan de una interfase entre los dos
instrumentos que constituyen la conexin que produce el fluido que emerge de la columna
cromatogrfica y el sistema de deteccin. Es imprescindible el control coordinado del funcionamiento de
ambos instrumentos (separativo y determinativo).
Captulo 6
91
Tcnicas acopladas
La gran cantidad de datos generada exige un sistema de almacenamiento, tratamiento,
interpretacin y presentacin de resultados.
Hoy las tcnicas acopladas son una gran herramienta para los
qumicos y la ciencia en general y son por este orden las ms
usadas: Espectrometra de masas (EM), Espectroscopia de
Absorcin Infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF), Tcnicas
Espectroscpicas Atmicas de Emisin (ICP) Absorcin Atmica
(EAA) y Resonancia Magntica Nuclear (RMN).
6.10 Bibliografa
Revisiones de los Mtodos combinados en C.L. Wilkins, Science. 1983.222, 251; Anal. Chem., 1989, 59,
517A.
Thomson, Skoog, West, Holler y Crouch. Fundamentos de Qumica Analtica. Intenational
Thomson Editores S. A. de C.V., 8 Edicin, Mxico, p.p. 970, 2005.
http://www.analytical-tech.com/productos/HPLC_MS.html
Hirschmugl, C.J. Frontiers in infrared spectroscopy at surfaces and interfaces. Surf. Sci. 500, 577-604
(2002
http://www.quimica.izt.uam.mx/Docencia/DocenciaQA/CursoCromatografia2005.pdf
Noa P. M., Prez Fl. N., Daz G. G., Vega L. S. Cromatografa de gases y de lquidos de alta resolucin.
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la salud. Depto. de produccin agrcola y animal. UAM, unidad
Xochimilco. 1 edicin. Mxico D.F. pp.165-169, 175, 299,.2005.
Varcrcel M., Gomz H. Tcnicas Analticas de Separacin. Editorial Reverte S.A. Capitulo22. 1994.
Duglas A., Leary J., Skoog. Anlisis Instrumental. Editorial McGraw Hill, 4 ta. Edicin. p.p.722-727.1992.
Captulo 6
92
Captulo 7
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Una parte importante de la cromatografa de gases y lquidos son los detectores, Un detector es
un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una
seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. En
cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el eluyente puro y el mismo
eluyente llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta
accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador
grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un
mnimo de respuesta a otras.
Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto
que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas
portador requerido para la elucin.
Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad
de volumen de gas portador que pasa a travs de l.
93
94
Captulo 7
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Ventajas:
Alta sensibilidad, del orden de 10
-13
g/s.
7
Desventajas:
Destruye la muestra (la piroliza).
96
Ni radiactivo. Los electrones as formados son atrapados por un nodo, produciendo una pequea
corriente continua. Cuando llegan molculas de analito de gran electroafinidad captan algunos
electrones. El detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el nodo y el
ctodo para mantener constante la corriente. Cuando estos compuestos se difunden a la estratosfera,
catalizan la descomposicin de las molculas de ozono
Detector de Fotometra a la Llama. Basada en la medida de la intensidad de la emisin
molecular de la fluorescencia de heterotomos en las molculas orgnicas.
La fotometra de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biolgica,
debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de tomo
de sodio libre en fase gaseosa. Debe producirse la activacin de ese tomo pasando el electrn de
valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energa,
se trata de cuantificar la intensidad de la energa emitida por los electrones al volver a su nivel
fundamental.
Necesitamos: Fuente de radiacin, monocromador, detector.
La fuente de radiacin que provoca la activacin de los tomos es una llama. El monocromador
ser en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de
resolucin. Los detectores podrn ser clulas fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades
relativamente altas.
Detector de Ionizacin de Llama Alcalina. El detector de nitrgeno fsforo, tambin llamado detector de
llama alcalina, es un detector de ionizacin de llama modificado, que es especialmente sensible a
compuestos que contienen nitrgeno y fsforo (pero que, en general, responde tambin a
hidrocarburos.) En particular, tiene inters en anlisis de medicamentos, pesticidas y herbicidas.
Cuando estos elementos se ponen en contacto con una bola de vidrio, que contienen Rb2SO4 y
que est en la punta de un mechero, producen iones que crean una corriente que se puede medir. Desde
luego, no se puede usar N2 como gas portador, si se analizan muestras que contienen nitrgeno.
Otros detectores de cromatografa de gases:
Fotmetro de llama: ciertos elementos muy concretos, como P, S, Sn, Pb.
De fotoionizacin: compuestos aromticos e insaturados.
De quimiluminiscencia de azufre: S
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Captulo 7
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El detector ms comn en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la
que se muestra en la figura 3, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas ms
simples utilizan la intensa raya de emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio. Los instrumentos ms
verstiles tienen lmparas de deuterio, xenn o volframio, y un monocromador, con el que se puede
elegir la longitud de onda ptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
El sistema de la figura 4 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier
soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa
desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala ms sensible, una absorbancia de 0,0005, dara
una seal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre ms de
cinco rdenes de magnitud de concentracin de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que
se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta estn indicados para elucin gradiente, y para
disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo.
Detector de ndice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente
existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexin
Tipo Fresnel
Captulo 7
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Fig. 3. Camino ptico de una microcelda de un detector espectrofotomtrico. Una celda ordinaria contiene un
camino ptico de 0,5 cm y contiene slo 8l de lquido.
Un detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es
aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de
deflexin, que se muestra en la figura 5, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 l: a travs de
uno pasa disolvente puro, y a travs del otro eluato. Para eliminar la radiacin infrarroja (que calentara
la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a travs de la celda, con disolvente puro en los
dos compartimientos, y se dirige a la fotoclula mediante la placa de deflexin. Cuando entra en la celda
soluto de diferente ndice de refraccin, el haz se desva, y vara la seal dada por la fotoclula.
Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin gradiente, porque es imposible ajustar
exactamente la muestra y la referencia mientras vara la composicin del disolvente. Los detectores de ndice de refraccin son sensibles a las variaciones de presin y temperatura (~0,01 C). Debido a su baja
sensibilidad, los detectores de ndice de refraccin no sirven en anlisis de trazas. Tienen intervalos
Captulo 7
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Detector de dispersin de luz. Responde a todos los solutos que son claramente menos voltiles
que la fase mvil.
Como se ve en la figura 6, el eluato entra en este detector por la parte superior. En el
nebulizador, el eluato se mezcla con nitrgeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma
una fina dispersin de gotitas. El disolvente se evapora en un tubo caliente que se le hace recorrer,
dejando una nube de finas partculas slidas, que entran en la zona de deteccin por la parte inferior. Las
partculas se detectan por la luz que procede de un diodo lser y llega al fotodiodo por dispersin.
El detector de dispersin de luz responde a la masa del analito, no a su estructura o peso
molecular. Si se observa un pico grande y uno pequeo, se puede estar seguro de que el pico pequeo
corresponde a menos cantidad que el pico grande. Con un detector de ultravioleta, una pequea
cantidad de un analito que absorbe mucho da una seal ms intensa que una cantidad grande de un
analito que absorbe poco. La respuesta de un detector de dispersin de luz no es lineal, de modo que
frecuentemente se recurre a polinomios para construir la curva de calibrado.
El detector de dispersin de luz es compatible con una elucin gradiente. Adems, no hay picos
asociados con el frente del disolvente, y as no se dan interferencias con los picos que se eluyen al
principio.
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Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan
fluorescencia nativa o inducida.
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitacin. Semejantes a los detectores de absorbancia. Son altamente sensitivos
Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperomtrico, Detector
Conductimtrico y Detector Potenciomtrico
Se basan en mtodos electroqumicos (amperometra, voltamperometra, conductimetra y
coulombimetra). Elevada sensitividad. El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos
redox. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis
reproducibles:
Checar que estn conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registradorintegrador.
Usar bombas reciprocantes de doble pistn
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Captulo 7
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Detector
De ultravioleta
0,1-1
De ndice de refraccin
100-1000
No
De dispersin de luz
0,1-1
Electroqumico
0,01-1
No
De fluorescencia
0,001-0,01
De conductividad
0,5-1
No
De espectrometra de masas
0,1-I
1000
7.5 Bibliografa
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm#detectores
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm
http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/edpct(_4/edpct(_4.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Detector_de_ionizaci%C3%B3n_de_llama
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-aninstr14/harris/c24b.html
http://www.elergonomista.com/tecnicas/fotometria.htm
http://webservmida.mida.gob.pa/CYTED/CYTED%20PDF/tallerhomonologacionpma/anexos/CROMATOG
RAFIA%20LIQUIDA%20HPLC.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr14/harris/c25b.html
http://www.pucpr.edu/titulov/Q420/examen%203/Cap%2028.pdf
Captulo 7
103
Captulo 8
Procesamiento de datos cromatogrficos
Cromatogramas
Es la Representacin de la respuesta o seal del sistema de deteccin continuo (CLAR o CG) o discontinuo
en funcin del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho Cromatogrfico. El cromatograma puede
tomar varias diversas formas: un registro en la carta de un registrador o plotter, una mancha en cromatografa
plana, o un nmero determinado de datos tomados por un microcomputador despus de la correspondiente
transformacin. Segn el tipo de detector continuo, el cromatograma puede ser diferencial, cuando la seal
solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la seal se acumula (Figura 1).
Captulo 8
104
Ajuste de datos
El software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el
correcto funcionamiento del algoritmo de integracin. Con tal finalidad, se probaron distintos mtodos
optndose finalmente por splines de segundo orden con derivada primera continua. Este mtodo permiti una
mejor identificacin del comienzo de pico y de los mximos, an en condiciones de alto ruido.
En la Figura 4 se muestra en detalle un trozo de cromatograma, en el que puede observarse la curva continua del
ajuste y los datos con el ruido de la seal.
105
Picos superpuestos: En el caso de dos o ms picos fusionados o superpuestos se traza una lnea de base
entre el comienzo del primero y el fin del ltimo. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles
hasta la lnea de base comn y en base a esta divisin se asignan las reas.
Picos tangentes: Los picos pequeos montados sobre uno mucho mayor se denominan tangentes y su
lnea de base se traza de manera especial. Para detectarlo un criterio comn es comparar alturas con la misma
diferencia medida en el pico anterior, si este valor cae por debajo de un lmite prefijado, el pico ser
considerado tangente.
106
Deteccin
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una
seal elaborable y ofrece informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. Es la parte del
cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el analito por el final de la columna.
En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre la muestra a analizar y la
sustancia portadora llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna,
esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador
grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
*Detectores segn su Grado de Selectividad :
*Detectores segn el proceso de deteccin Ionizacin, ptico-espectroscpico, Electroqumico, etc.
*Detectores segn su Modo de Respuesta:
Caractersticas de los Detectores
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica
medible.
o Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el
que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable.
Rango Dinmico Lineal: Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el
107
operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro de la
cromatografa en la forma de un cromatograma. La seal del detector debe ser proporcional a la cantidad de
cada soluto (analito). Con lo cual debe ser posible realizar un anlisis cuantitativo.
Registro e integracin
La seal proveniente del detector, se transmite a un sistema de registro e integracin, el cual genera un
cromatograma que representa un registro del anlisis. Los datos obtenidos son procesados mediante un
registrador e integrador sin ninguna o muy poca capacidad de procesamiento, o a travs de sistemas
computarizados que incluyen un procesamiento posterior (post-run analysis) mas sofisticado y completo
mediante el empleo de un software apropiado.
automticamente el rea de cada pico, realiza los clculos e imprime un reporte con los resultados
cuantitativos y los tiempos de retencin.
en columna cuantitativa
comparacin de las alturas, o de las reas del pico del analito con la de uno o ms patrones, en la
cromatografa en plano el rea ocupada por las especies separadas sirve como parmetro analtico, si las
condiciones son controladas adecuadamente esos parmetros varan linealmente con la concentracin, es
decir, que el rea del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentracin del analito, as es
fundamental para la confiabilidad del anlisis que el rea de los picos sea medida lo ms exacto y
reproduciblemente posible.
Los instrumentos cromatogrficos modernos estas equipados con integradores electrnicos digitales, los
cuales permiten una precisa estimacin de las reas de los picos, si no se dispone de tales equipos tienen que
hacerse una estimacin manual. Existen varias maneras de medir el rea de los picos cromatogrficos. Una de
Captulo 8
108
=
=
Las limitantes de esta tcnica es que su utilizacin depende de la simetra y del ancho del pico.
Otra tcnica utilizada para determinar el rea del pico es la llamada corte y pesada esta tcnica consiste
en recortar el pico del cromatograma, luego se pesa en una balanza analtica y se determina su peso relativo
al peso de un rea conocida de papel de registro. Dicho recorte y pesada depende mucho de la habilidad del
operador, pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, homogeneidad del papel, etc.
Para la utilizacin de esta tcnica se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el
original. En general las tcnicas de integracin manual proporcionan reas que son reproducibles a un nivel del
2 al 5 por 100; por el contrario los integradores digitales son al menos un orden de magnitud ms precisos.
Como ya se menciona anteriormente los cromatgrafos modernos contienen integradores electrnicos
los cuales son dispositivos que se basan en microprocesadores que colectan la seal cromatografica,
digitalizndola, es decir, que transforma una seal elctrica en nmeros, detectan la presencia del pico y
calcula su rea, los integradores son ms precisos y rpidos que cualquier mtodo manual para determinar el
rea del pico cromatografico, aunque son dispositivos caros, cuando un anlisis requiere de rapidez en la
produccin de resultados su uso es casi indispensable.
Otra manera de obtener el rea del pico es sustituir el integrador por un computador el cual es un
dispositivo que convierte la seal elctrica en nmeros que puedan guardarse en una memora (conversor
analogo-digital) y que disponga de un programa para la realizacin del anlisis del cromatograma digitalizado,
Captulo 8
109
110
Captulo 8
111
112
Figura 15. Separacin isocrtica en HPLC de una mezcla de compuestos aromticos en una columna Hypersil ODS (C18
sobre slice de 5m), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( 22C). (1) alcohol benclico, (2) fenol,
(3)3,4-dimetoxiacetofenona, (4) benzona, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) ometixibifenilo.El eluyente estaba formado por un tampn acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El
tampn contena KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografa es utilizada para anlisis del principio activo de un producto farmacutico, por ejemplo
la determinacin de cafena y cido acetilsaliclico en cafiaspirina , los siguientes datos fueron obtenidos para
determinar la cantidad de cafena y cido acetilsaliclico contenidos una tableta de cafiaspirina. En este caso
se realizo el anlisis en HPLC
Para tal anlisis se tomo como estndar las siguientes concentraciones de cafena y cido acetilsaliclico:
Ccafena = 0.03mg/mL
CAAS = 0.53mg/mL
Captulo 8
113
Cafena
cido Acetilsaliclico
Nm. Inyeccin
rea
Nm. Inyeccin
rea
149019
615352
187639
784811
162884
684670
201409
874595
184141
797979
=177018.4
=751481.4
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente
ecuacin A=FrC.
Fr cafena = 177018.4 / 0.03 = 5900613.33
Fr AAS = 751481.4 / 0.53 = 1417889.43
Anlisis de la tableta de CAFIASPIRINA
Posteriormente se analizo la tableta de Cafiaspirina
(lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
Captulo 8
114
Cafena
cido Acetilsaliclico
Nm. Inyeccin
rea
Nm. Inyeccin
rea
177343
678496
178856
717425
182458
723643
= 179552.3
= 706521.3
Con los datos de las reas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de
cafena y cido acetilsaliclico en cada tableta.
Captulo 8
115
[Acetona](%)
rea [EtOH]
[EtOH](%)
752578
225296
394769
125961
175540
57133
Promedio
440962.3333
Promedio
Captulo 8
136130
270166
198196
251991
183560
168917
142527
230358
174761
183014
207592
177426
219475
116
282560
198363.6667
Promedio
236542.3333
276769
382117
145605
228924
211187
Promedio
305520.5
178488
341568
10
168642
350407
10
266046
486201
10
204392
392725.3333
Ae/Aei
2
1.5
1
0.5
0
0
0.5
1.5
Ce/Cei
2
y = 1.2536x - 0.075
R2 = 0.9868
Frr=1.2536 Ae/Aei=Frr*(Ce/Ci)
Tequila "Herradura" (EtOH 40%)
E.I.
Promedio
Captulo 8
rea [Acet]
[Acet] (%)
rea [EtOH]
R=[EtOH] (%)
250005
300125
5.789146394
213666
288804
6.518217346
294464.5
6.125112357
231835.5
117
Captulo 8
118
informacin cualitativa y cuantitativa y generar los reportes correspondientes, obtenindose los datos a
partir de un detector; ste es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible
directamente, en una seal elaborable que ofrece informacin sobre la naturaleza y magnitud de la
propiedad fsica. La seal proveniente del detector se transmite a un sistema de registro e integracin,
el cual genera un cromatograma. Los datos obtenidos son procesados mediante un registrador e
integrador.
La cromatografa en columna cuantitativa tiene como principio la comparacin de las alturas, o de
las reas del pico del analito con la de uno o ms patrones, en la cromatografa en plano el rea ocupada
por las especies separadas sirve como parmetro analtico, el rea del pico cromatografico es
directamente proporcional a la concentracin del analito, por lo cual
es fundamental para la
confiabilidad del anlisis que el rea de los picos sea medida lo ms exacto y reproduciblemente posible.
Existiendo as varias maneras manuales de medir el rea de los picos cromatogrficos; sin embargo, son
los instrumentos cromatogrficos modernos equipados con integradores electrnicos digitales son los
ms precisos y rpidos que cualquier mtodo manual para determinar el rea del pico cromatografico.
Se ha logrado un desarrollo y optimizacin de mtodos a travs de ciertas modificaciones en las
condiciones de trabajo tales como las rampas de temperatura utilizadas en cromatografa de gases en
donde el control de la temperatura de la columna es una de las formas ms sencillas y ms efectivas de
influenciar la separacin de los componentes.
En general, caben dos posibilidades de modificacin de las condiciones de trabajo cromatogrficas.
La modalidad Isocrtica, en la que las condiciones experimentales permanecen constantes durante el
proceso cromatogrfico y la modalidad no Isocrtica, en la que durante el proceso de separacin
cromatogrfica se varia de manera gradual y estrictamente controlada el parmetro de temperatura.
Captulo 8
119
Captulo 8
120
Captulo 8
121
(2)
Donde:
MM = peso del azcar correspondiente en la muestra
AM = rea del pico del azcar en la muestra (mm)
Mi = masa del estndar interno aadido a las muestras (mg)
Ai = rea del pico estndar interno aadido a las muestras (mm)
Km = valor promedio obtenidos mediante la frmula (1) para el azcar correspondiente.
Un cromatograma tpico de la separacin de algunos TMS derivados de azcar se muestra en la figura1.
Captulo 8
122
2. Se desea determinar el contenido de etanol en una bebida alcohlica. Para ello se realiz un
anlisis cromatogrfico utilizando una curva de calibracin relativa.
Preparacin de soluciones
Solucin de estndar interno (EI). Solucin de acetona 10%
Solucin patrn (SP). Solucin de etanol al 10%
Empleando estas soluciones se prepar la siguiente curva de calibracin
Tabla 2.
SP (mL)
EI (mL)
0.1
10
0.5
10
1.0
10
1.5
10
2.0
10
123
rea EI
Promedio
Promedio
29054.33
30556
25864
30743
290080
249370
287220
275556.6
123820
109170
123050
139240
214770
246810
266110
242563.3
243853.3
228380
247660
255520
241720
263180
261540
255480
360023.3
321700
371000
387370
220850
254990
265390
247076.6
468270
489390
481950
433470
261410
261700
247950
257020
Captulo 8
Inyeccin
rea de etanol
rea acetona
296800
187150
290840
185900
287960
185880
285800
183680
291010
187180
Promedio
29.0482
186078
124
rea EI
AEtOH / AEI
[sp] /[EI]
29054.33
275556.6
0.1054
0.1
123820
242563.3
0.5105
0.5
243853.3
255480
0.9545
360023.3
247076.6
1.4571
1.5
468270
257020
1.822
2.0
Curva Patrn
y = 0.9114x + 0.0403
R2 = 0.9974
AEtOH / AEI
2
1.5
1
0.5
0
0
0.5
1.5
2.5
[sp] /[EI]
Frr
AEtOH EI
AEI EtOH
Por lo tanto despejando y tomando en cuenta los promedios de la tabla 4. con las respectivas reas de
la muestra tenemos que:
EtOH
290,4820.1
0.1713
0.911 186078
Captulo 8
125
90C
Variacin de temperatura
20C/min
Tiempo Inicial
1 min
Temperatura final
220C
Captulo 8
126
10 min
Flujo de hidrgeno
30 ml/min
500 ml/min
250C
Flujo de aire
250C
Purga
Flujo de helio
20 ml/min
1 min
Se obtuvo
120
120
Donde: Am (rea del pico de vitamina A en la muestra), As (rea del pico de vitamina A en el estndar),
Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor de dilucin), Wm (Peso de la muestra.
Se analizaron muestras de papilla para cuantificar la
vitamina A expresada en g/g. El analito se adicion a
la matriz, disuelto en el mismo solvente usado para la
extraccin, y se dej en contacto con sta por varias
horas antes de la extraccin, para permitir su
interaccin. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y 1,78 mL de
una solucin estndar de 100 ppm de vitamina A y se
adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel. Se dej
en contacto la solucin estndar con las muestras
durante toda la noche bajo refrigeracin y, al da
siguiente, se realiz el tratamiento y se hicieron las
lecturas de los resultados de las 18 muestras.
Resultados
En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos concentraciones (mayor y menor)
de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo de retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min,
siendo el tiempo total de anlisis para una muestra de 7 min.
La respuesta de deteccin fue lineal en el rango de concentraciones de 5- 15 g/g Figura
(
2),
obtenindose un coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin del mtodo en base a la seal /
ruido (S/N) fue de 0,06 g/g y el lmite de cuantificacin de 0,58 g/g
Captulo 8
121
122
Las condiciones de trabajo para el cromatgrafo de gases equipado son las siguientes:
Temperatura del inyector 200 C
123
106
donde:
Ci= es la concentracin ambiental del contaminante (mg/m3).
ms= es la masa de contaminante captada (mg).
SR= es el caudal de muestreo especfico para el xido de etileno (49,3 ml/min 760 mm Hg, 25 %
Humedad relativa) .
CR= es el coeficiente de recuperacin especfico para xido de etileno en tanto por uno (0,92).
t es el tiempo de exposicin en minutos.
La concentracin de xido de etileno en aire, expresada en mililitro por metro cbico (ppm), se calcula
por medio de la siguiente expresin:
Cppm = Ci (24.0/44.05)*(101.3/P)*(T+273.15/293.15)
donde:
P= es la presin del aire muestrado en kPa (103 N/m3).
T= es la temperatura del aire muestreado en C.
44,05 = es el peso molecular de xido de etileno en g/mol.
Captulo 8
120
Captulo 8
121
405 (1)
Fase mvil
EI
Procedimiento de extraccin
Tampn Na2HPO4-KH2-PO4
1-Amino-4-Nitro
Precipitacin
naftaleno
protenas
stricas
con
sobrenadante.
382
(2)
Acetonitrilo
con
(55/45, v/v)
(60/40/,v/v)
Flujo 1 mL/min
405 (3)
Tr
NO
Acetonitrilo, 25mM
NO
Precipiatacin
Na2EDTA
protenas
2.5
mM
sricas
con
EDTA, metanol
(30:20:50 v/v/v)
5.5 min
6-7 min
4 min
1-Amino-4
Precipitacin
proteninas
sricas
con
Nitronaftaleno
EDTANa2 pH=4)
(80:20, v/v)
del sobresedante.
Acetronitirilo,
tampn
6.8
+-
0.5 min
8.4
+-
0.5 min
Captulo 8
122
1-Amino-4
Nitronaftaleno
Precipitacin
mL/min
protenas
4.9
sricas
con
+-
0.8 min
del sobrenadante.
acetilanfotericina
B
pretenas
sricas
con
Resultados
Se realiz una curva de calibracin, misma que se calcul por regresin lineal a partir de las reas
de los picos correspondientes a los estndares, procesados en cada serie analitica. La concentracin de
las muestras se obtuvo por interpelacin de su rea en la recta de calibracin. Se resenta un mtodo de
determinacin de AnB en suero humano por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en fase
reversa y columna corta (30 mm). Para ello. se escogib una columna de octadecilsilano (C18), ms corta
(30 mm x 4.6 mm ID) que en los mtodos de referencia (125 a 300 mm) (108,119,120,129,131), con el fin
de obtener tiempos de retencin ms pequeos y se utiliz la fase mvil del mtodo descrito por Wang
et al (131) (acetonitrilo y tampn EDTA ).
Bibliografia:
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Captulo 8
123