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Produccion de Amilasas Fungicas
Produccion de Amilasas Fungicas
fngico.
Las amilasas son producidas a gran escala para su uso en la industria de la alimentacin y de la
produccin de combustibles. Los usos ms importantes son:
1. Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas que son utilizadas como espesantes.
2. Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la fabricacin de la cerveza y
confituras (dulces, helados, tortas).
3. Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y repostera,
confituras y bebidas no alcohlicas.
4. Remocin del almidn utilizado como apresto en la industria textil.
5. Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa que es
sustrato de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa.
6. Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones,
entre ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible.
DISEO EXPERIMENTAL
Parte I: AISLAMIENTO Y SCREENING
Da 1: Aislamiento (1 parte)
Se colocan semillas de lenteja sobre un medio Slido de agar YPD conteniendo 5 % NaCl
(para evitar el desarrollo de especies Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibitico que inhibe el
crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28C durante 7 das.
Da 2: Aislamiento (2 parte)
Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican
con un escarbadiente en cajas de Petri con agar YPD. Se incuba a 28C durante 7 das.
Da 3: Screening de cepas productoras de amilasas (1 parte)
Las colonias aisladas se pican en cajas de Petri con medio slido de almidn 1 % y agar
1.5 %. Se incuba a 28C durante 4 das.
I2/IK se acompleja con la amilosa nativa con su estructura tridimensional intacta. El complejo
iodo-amilosa se cuantifica midiendo la absorbancia a 640 nm con un espectrofotmetro.
La reaccin consiste en incubar 10 l de extracto enzimtico con 0.5 ml de solucin de
sustrato. La incubacin se realiza a 37C durante 7.5 min. La reaccin se detiene por el agregado
de 4.5 ml de solucin revelador y se mide la absorbancia a 640 nm. El protocolo se detalla a
continuacin:
Extracto
Solucin de
Incubacin
Solucin
Absorbanci
enzimtico
sustrato
a 37C
reveladora
a a 640 nm
1-2
0.5 ml
3-4
10 l
7.5 min
4.5 ml
La Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede
hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos, en las condiciones de la reaccin. En esta tcnica se
incuban 10 l de muestra con 0.25 mg de almidn contenidos en 0.5 ml de solucin de sustrato
durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra con 10.000 mg de
almidn durante 30 minutos. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la
muestra sera de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilsica, la fraccin de
almidn digerido se multiplica por 1000.
Clculo de los resultados:
AmilasaUA / dl
Ejemplo:
Absorbancia Tubo (1-2): 0.450
Absorbancia Tubo (3-4): 0.200
0.450 0.200
1000 555 UA / dl
0.450
lo que se hace imprescindible la hidrlisis previa del polisacrido para su utilizacin por la
levadura usando para ello el extracto enzimtico obtenido.
Da 6: Inoculacin
Las fermentaciones se realizarn en erlenmeyers de 50 ml conteniendo 40 ml de agua
destilada y 1.0 g de harina de trigo o maz autoclavadas. A este sustrato se le agrega 5 ml del
extracto enzimtico obtenido o 5 ml de solucin de NaCl 1.0 % y 100 l de tetraciclina 10
mg/ml. Se extrae una alcuota de 3 ml de cada fermentacin para determinar las condiciones
iniciales. Luego se inocula con 0.5 ml de una suspensin de Saccharomyces cerevisiae de 50
mg/ml y se incuba durante 5 das a temperatura ambiente.
Da 7: Determinacin de etanol
Se cuantificar el etanol producido en las fermentaciones (4 muestras: antes y despus de
incubar s/c extracto enzimtico) por el mtodo de microdifusin. Este mtodo se basa en que si
una sustancia voltil y un solvente puro se mantienen en compartimientos separados pero en
contacto con la misma atmsfera, el soluto voltil tender a disolverse en el solvente puro. El
soluto voltil pasar de la solucin original hacia la atmsfera para luego disolverse en el solvente
originalmente puro. Finalmente, esto implicar una difusin del soluto desde la solucin original
al solvente. Este proceso ocurrir hasta alcanzar el equilibrio pero, si en lugar del solvente puro
utilizamos una sustancia que convierta al soluto voltil en no voltil, la difusin ocurrir hasta que
la presin de vapor en la atmsfera compartida tienda a cero. El ensayo se realizara en dos tubos
colocados uno dentro del otro. En el compartimiento exterior (tubo ancho) se colocar 0.5 ml de
solucin saturada de carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos soluble en la
solucin acuosa. Por otro lado se prepara el compartimiento interior (tubo angosto) que
contendr 1.0 ml de solucin de dicromato de potasio 0.145 % en cido sulfrico 10 N y se
coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinza; en presencia de esta solucin el etanol es
oxidado a cido actico y el Cromo pasa a Cr 3+ cambiando su color de amarillo anaranjado a
transparente. Una vez preparado el dispositivo se agrega al compartimiento exterior 0.1 ml de
solucin standard o muestra y se tapa con un tapn de goma. Se incuba 60 min a 45C, se saca el
tubo angosto y se le agrega 0.5 ml de agua destilada y se mide la absorbancia a 450 nm.
Compartimiento exterior:
Solucin saturada de
Carbonato de Potasio con
Standard o Muestra
Compartimiento interior:
Solucin de Dicromato de Potasio
El protocolo se detalla a continuacin:
Determinacin de Etanol
Tubo N
Muestra (100 l)
Absorbancia a 450 nm
1-2
Agua destilada
3-4
EtOH 0.25 %
5-6
EtOH 0.5 %
7-8
EtOH 1.0 %
Sin extracto / Sin incubar
9-10
11-12
13-14
15-16