II.

-Captulo 5

2 Anlisis del cariotipo

Citogentica
Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A.
1 Introduccin
Los estudios citogenticos han permitido
realizar valiosos aportes al conocimiento de
los mecanismos de aislamiento reproductivo
y modos de especiacin en plantas. La
especiacin hbrida es muy comn en el reino vegetal, en especial la especiacin por
poliploida. En estos casos la citogentica, a
travs del anlisis genmico, ha contribuido
a la resolucin del origen y evolucin de distintos grupos taxonmicos. Mutaciones
cromosmicas que alteran la morfologa de
los cromosomas jugaran un papel importante en la determinacin de los mecanismos
de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiacin. Aun sin alterar la morfologa de los cromosomas, existen ejemplos
en los que mutaciones gnicas que afectan
el apareamiento han sido determinantes en
la evolucin de distintos grupos. La
citogentica brinda valiosos aportes para la
resolucin de problemas taxonmicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero tambin limitaciones y sus
aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. Sin
embargo es importante sealar que trabajar en biologa o gentica de eucariontes,
usando tcnicas clsicas o moleculares, pero
desconociendo las caractersticas y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a
errores en la interpretacin de causa y efecto de muchos fenmenos. En esta contribucin se explicar brevemente la informacin
que la citogentica puede brindar, con el
anlisis del cariotipo, anlisis meitico en
hbridos y poliploides, estudio de la variacin
intra e interespecifica en el tamao del
genoma y con la citogentica molecular (hibridacin in situ, FISH, GISH), exponiendo
como ejemplos, algunos aportes realizados
por nuestro grupo de trabajo.

Las caractersticas estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son

importantes en investigaciones bsicas
(taxonmicas y evolutivas) y aplicadas. Los
taxnomos y evolucionistas estn familiarizados con el hecho de que los cromosomas
son parte de un sistema dinmico que est
moldeando el proceso de evolucin. Esta variacin se expresa en caractersticas fcilmente analizables como el nmero, forma y tamao de los cromosomas y no est relacionada con complejidad gentica u
organsmica. Es importante analizar tambin,
la cantidad y localizacin de heterocromatina
(ADN repetitivo no codificante) mediante
distintas tcnicas de bandeo, y caracterizar
citoqumicamente distintos tipos de
heterocromatina utilizando fluorocromos, y
en algunos casos, identificar ADN satlite y
relacionarlo con bandas heterocromticas.
Adems, deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente y
normal la existencia de variacin cariotpica
interespecfica. Por otro lado, aunque menos
frecuente, tambin puede existir variabilidad
cariotpica intraespecfica manifestada como
polimorfismos o politipismos cromosmicos.
Varios parmetros del cariotipo pueden
ser alterados por rearreglos estructurales. En
algunos casos puede variar el nmero
cromosmico y la simetra del cariotipo. Un
ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones cntricas entre cromosomas con
centrmero subterminal produciendo
cromosomas metacntricos de mayor tamao, con o sin eliminacin de regiones
centromricas. El fragmento con centrmero
puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. En otros casos
no se encuentra variacin en el nmero
cromosmico ya que en muchos gneros el
nmero y, a veces, la morfologa cromosmica
es constante entre las distintas especies que
lo componen.
En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las
nueve especies que lo componen son
diploides (2n=26). Sin embargo existen diferencias importantes interespecficas en cuanto a la morfologa cromosmica, simetra del
cariotipo y tamao del genoma. El cariotipo
de B. retama es el ms asimtrico ya que

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

69

posee un cariotipo
bimodal por adicin de
heterocromatina en 24
de los 26 cromosomas
del complemento.
El nmero cromosmico tambin puede
variar por poliploida.
Nuevos nmeros bsicos que no tengan relacin directa con los
ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridacin entre poliploides con distintos nmeros bsicos.
Variaciones en el
cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios
en el exofenotipo. Sin
embargo rearreglos en
condicin heterocigota
pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meitico e iniciar aislamiento reproductivo. Si se dan las
condiciones adecuadas
para la fijacin de estos
rearreglos pueden iniciarse eventos especiognicos que involucren
rearreglos cromosmi- FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitticas. B, D = interfases. A, B =
cos. Estos procesos Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas sealan
el nico par de cromosomas metacntricos eucromticos.- F = Metafase I. Eulophia
pueden conducir, en paiveana
ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociacin
algunos casos, a la exis- secundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis , n = 10; G =
tencia de especies Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha seala un bivalente heteromorfo;
crpticas o hermanas, H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea mays
ssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J =
con pocas diferencias a Asincrona meitica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K =
nivel bioqumico o Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5
morfolgico pero con univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones.
diferencias cromos- Ver explicacin extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al.,
1991.
micas que las mantendran aisladas reproductivamente.
matina constitutiva compuesta por secuenUn anlisis ms preciso de la variacin cias cortas repetidas en tandem. La
cariotpica puede obtenerse empleando tc- heterocromatina constitutiva es un componicas de bandeo que revelan marcadores nente aditivo del genoma y presenta, en
cromosmicos (secuencias de ADN altamen- muchos grupos, variacin intra e
te repetidas ricas en AT o GC, regiones orga- interespecfica. Aunque no contiene genes
nizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es activos podra tener importancia en eventos
el que se utiliza de rutina y revela heterocro- regulatorios, en el desarrollo y en la organi-

70

POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

zacin tridimensional de los cromosomas en

el ncleo. Bennett (1983, 1988) crea el trmino cariotipo natural para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a
la posicin real que los mismos ocupan en el
ncleo interfsico. Se han postulado varios
modelos que explican la organizacin
supracromosmica en los ncleos eucariontes
estableciendo que si bien sta no es universal, es indudable que la informacin gentica
no est contenida caoticamen-te en el ncleo sino que est ordenada de acuerdo a
patrones que actualmente no conocemos.
3 Anlisis meitico en hbridos y
poliploides
Una especie diploide con reproduccin
sexual para ser frtil debe poseer un comportamiento meitico normal, o sea que debe
poseer buen apareamiento entre
cromosomas homlogos y consecuentemente formacin de bivalentes. Ello determina
que exista buena segregacin y formacin de
gametos balanceados y frtiles. En general
el grado de apareamiento meitico es una
medida de la homologa que existe entre los
cromosomas. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiolgicamente
todas las etapas y procesos de la divisin
meitica.
Estos principios han permitido realizar
rpidas evaluaciones de la homologa
genmica entre dos entidades por medio del
estudio meitico de su hbrido F1, cuando
stos han sido posibles de obtener
artificialmente o se los ha encontrado en
poblaciones naturales. Si el hbrido analizado es frtil y posee formacin de bivalentes
se puede concluir que hay afinidad
(homologa) entre los genomas parentales.
El grado de irregularidades meiticas es una
estimacin de diferencias gnicas y estructurales de las entidades en estudio. Configuraciones meiticas anormales como univalentes, bivalentes heteromrficos o multivalentes en Profase-Metafase I y, en estados posteriores (puentes, fragmentos, cromosomas
con cromtidas desiguales, husos multipolares, etc.,), pueden deberse a heterocigosis
para distintos tipo de rearreglos estructurales.

Si el hbrido es estril habr que analizar

si el aislamiento reproductivo postcigtico
obedece a causas gnicas o cromosmicas.
La formacin de univalentes podra significar
falta de homologa entre los cromosomas de
los progenitores y, en estos casos, el
poliploide artificial debera poseer meiosis
regular y fertilidad elevada. Sin embargo podra ocurrir que aunque las especies
parentales tuvieran una elevada homologa
en cuanto a las secuencias de ADN, los
hbridos fueran estriles, con formacin de
univalentes en su meiosis. Esto ltimo podra
deberse a la accin de genes que interfieren
con el proceso normal de apareamiento (formacin del complejo sinaptonmico, ocurrencia y/o posicin de sobrecruzamientos) o alteran la disposicin espacial de los genomas
en el ncleo provocando asinapsis.
En algunos casos la formacin de
univalentes en los hbridos se debera a divergencia cuantitativa en el nmero de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. Este mecanismo disminuye el valor
adaptativo del heterocigota por provocar
disturbios en la alineacin estructural de los
cromosomas.
Otro caso frecuente en la naturaleza es
la existencia de hbridos diploides con formacin regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis, pero elevada esterilidad. Este fenmeno es muy comn en hbridos entre distintas especies de
Amaranthus, Prosopis y Bromus entre otros.
Stebbins (1971) ha denominado a este fenmeno hibridez estructural crptica y ocurrira cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeos rearreglos estructurales. En estos casos se pueden formar
bivalentes pero se segregan combinaciones
gnicas inviables a las gametas.
El comportamiento meitico puede tambin verse alterado por interacciones particulares ncleo - citoplasmticas. En los
hbridos el citoplasma puede ejercer una accin diferencial sobre la condensacin
cromosmica de los genomas parentales o
en el ritmo de contraccin cromosmica durante la meiosis (alociclia genmica). Cuatro
lneas aloplsmicas fueron obtenidas por el
Ing. Agr. L. Mazoti utilizando maz (Zea mays
ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

71

bre teosinte como progenitor femenino. Estas lneas presentaron comportamiento

meitico regular con formacin de bivalentes.
Todas las lneas aloplsmicas presentaron
caractersticas citolgicas en comn. Una de
estas caractersticas es que, en mas del 50 %
de las clulas analizadas en Diplotene Metafase I, los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada
uno. Si bien este comportamiento meitico
fue descripto en hbridos y en razas nativas
de maz, en las lneas aloplsmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. Otra caracterstica observada en las lneas
aloplsmicas es que, en aproximadamente
20-40% de los meiocitos en Profase I,
Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 II
presentan una leve asincrona en su comportamiento meitico (es decir que, por ejemplo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). La drstica separacin en
dos grupos de 5 II en la mayora de las clulas
sugiere que la interaccin citoplasma de
teosinte-nucleo de maz influencia la distribucin espacial de los cromosomas en el ncleo. La presencia de dos grupos de 5 II y la
asincrona de los mismos en lneas
aloplsmicas de maz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separacin y
asincrona de dos genomas diferentes con 10
cromosomas cada uno (x=5). Evidencias
citogenticas de la naturaleza poliploide del
maz y especies afines se discutirn con mayor detalle en la prxima seccin.
Citogentica de poliploides. El estudio
meitico de poliploides e hbridos entre
taxones con distinto nivel de ploida aporta
mayor informacin que el realizado en
hbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas
en el mismo fondo gentico. En estos casos
la formacin de multivalentes es decisiva para
establecer las relaciones entre genomas.
En el gnero Larrea el hbrido estril entre la especie diploide L. divaricata (2n=26)
y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado,
en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje de
las clulas analizadas, indicando que L.
divaricata o una especie muy afn sera un
progenitor de L. cuneifolia. El anlisis de las
asociaciones meiticas en especies e hbridos
del gnero Zea nos revel la naturaleza

72

alotetraploide del maz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. En hbridos con
2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z.
perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) la
configuracin meitica ms frecuente fue 5
III + 5 II + 5I. Zea perennis, con 2n=40
cromosomas present, con frecuencia elevada, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones slo
pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas
cada uno, siendo AmAm BmBm y ApAp
ApAp Bp1Bp1 Bp2Bp2 las frmulas genmicas
postuladas para maz y Zea perennis, respectivamente. Nuestro grupo de trabajo ha
encontrado, en especies e hbridos con 2n=20
cromosomas, formacin frecuente de dos
grupos de 5 II cada uno en MI. Este doble
huso observado sera una evidencia de la
existencia de genomas ancestrales con 10
cromosomas cada uno. Adems, en alrededor del 50 % de las clulas observadas en algunas lneas de maz e hbridos interespecficos se observ asociacin secundaria de
bivalentes, sugiriendo la existencia de
homeologa entre los genomas ancestrales
A y B postulados.
Tratamientos premeiticos con soluciones
diluidas de colchicina (0,5 x 10 -4) en el gnero Helianthus indujeron apareamiento
homelogo y formacin de multivalentes en
especies que, aunque tienen origen
poliploide, posean meiosis regular con formacin de bivalentes. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenmico.
Este tratamiento produce el mismo efecto
que alelos mutantes de genes que controlan
el apareamiento, permitiendo recombinacin
entre genomas que normalmente no
recombinaran. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en
maz y Z. perennis con la finalidad de detectar recombinacin entre los genomas A y B
postulados anteriormente. El maz tratado
mostr en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras
que el maz testigo slo form bivalentes.
Estos resultados sugirieron que en maz existen genomas homelogos (Am y Bm) con 5
cromosomas cada uno. El tratamiento en Zea
perennis di como resultado un incremento
en la frecuencia de IV sealando tambin
manifestacin de homeologa dentro de los
genomas A y B. El tratamiento con colchicina

POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

de los hbridos con 2n=30 cromosomas, Z.

diploperennis x Z. perennis y Z. perennis x
Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tratamiento con colchicina provoc un aumento en la frecuencia de trivalentes, no observndose nunca IV VI. En cambio el hbrido
Z. perennis x Z. mays ssp. mays tratado con
colchicina, no slo mostr un aumento en el
porcentaje de III sino que el 43% de las clulas analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV
y VI. Estos resultados permitieron concluir que
si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y
Ap-Bp, slo son homelogos los genomas
Am y Bm.
El anlisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no slo confirma
la naturaleza alopoliploide del maz y especies afines con 2n=20 cromosomas, sino que
sugiere que en estas especies existen genes
(semejantes al Ph descripto en trigo) que
impiden el apareamiento entre genomas
homelogos.
En Amaranthus la configuracin
cromosmica de 8 II + 17 I observada en el
hbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus
(2n=34), conjuntamente con la asociacin
secundaria de bivalentes observada en especies e hbridos con meiosis regular apoyaron
la hiptesis de que las especies actuales de
Amaranthus con 2n=32 cromosomas son
poliploides con x=8. EL nmero n=16 sera un
nmero bsico derivado y n=17 habra surgido por trisoma primaria.
Se han dado varios ejemplos en los cuales el anlisis meitico ha permitido dilucidar
el origen y postular modos de especiacin en
varios grupos. Como ya se ha discutido, el
apareamiento puede estar bajo control
gentico (por ejemplo genes tipo Ph) y a
menudo estos genes pueden constituir un
sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnsticos de especies y
gneros.
El establecimiento de sistemas taxonmicos basados en relaciones genmicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de ADN,
etc.), morfolgicos, bioqumicos y moleculares.
Adems de la utilidad en estudios
taxonmicos y evolutivos el conocimiento de

la meiosis es de importancia fundamental en

estudios aplicados. En la produccin de
hbridos o poliploides de importancia
agronmica se debe lograr un mximo de
fertilidad y esto est relacionado con el comportamiento cromosmico. Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosmico,
ste es un parmetro que debe ser controlado.
4 Variacin intra e interespecifica en el
tamao del genoma: evolucin y
significado adaptativo
Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. En Angiospermas el tamao del genoma es muy variable entre grupos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsis
thaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriaca
no estando esta variacin relacionada necesariamente con nivel de ploidia. El contenido de ADN (valor C) se evala mediante
microdensitometra o citometra de flujo. Si
se descarta la variacin en el nivel de ploida,
las principales causas de variacin (intra o
interespecfica) del contenido de ADN serian:
aneuploida, polimorfismo numrico para
cromosomas accesorios o supernumerarios,
reordenamientos cromosmicos con perdida
o duplicacin de material gentico y variacin
en el nmero de copias de secuencias no
codificantes.
La variacin del tamao del genoma se
encuentra, a grandes rasgos, relacionada con
diferencias en la complejidad organsmica
pues los virus tienen genomas mas pequeos que las bacterias y stas a su vez menores que el de eucariotas. Sin embargo en organismos superiores se encontr que el aumento en el valor C no estaba relacionado
con complejidad organsmica, ni era explicable por la existencia de mayor nmero de
genes funcionales (el contenido de ADN de
un alga unicelular, por ejemplo, puede ser
igual al de una angiosperma leosa). Esta
paradoja o enigma del valor C (C: contenido
de ADN del genoma haploide no replicado)
fue explicada, en parte, cuando se demostr
que en Angiospermas la variacin del tamao del genoma involucra cambios en la cantidad y proporcin de secuencias de ADN repetidas. Los estudios moleculares han reve-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

73

lando gran complejidad dentro de los

genomas existiendo, adems del ADN
codificante, secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satlite, minisatlites,
microsatlites, y elementos transponibles.
En general, la relacin ADN gnico, no
gnico disminuye con el aumento del tamao del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del
ADN total. Estos resultados explican la naturaleza de la variacin pero plantean
interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma:
cul es el origen, funcin y/o significado de
esta variacin? cul es el papel del ADN repetido, tpicamente no codificante?, qu
relacin poseen estos cambios con la fluidez
y plasticidad del genoma en plantas? y cual
es la direccin, distribucin y extensin de
estos cambios en distintos grupos vegetales?.
Un enfoque para comprender el significado del tamao del genoma fue analizar las
relaciones que existan entre el contenido de
ADN y caractersticas celulares, organsmicas
y geogrficas. En varios grupos de plantas se
vio que las variaciones en el contenido de
ADN total estn correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosmicas,
rea y volumen celular, porcentaje de
heterocromatina, longitud del complejo
sinaptonmico, duracin del ciclo mittico,
duracin de la meiosis, tiempo mnimo de
generacin, factores fenolgicos, latitud y
altitud. Bennett (1987) crea el trmino
nucleotipo para referirse a los aspectos del
ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. En la
literatura existen muchos datos que sugieren
que el tamao del genoma posee significado adaptativo y que los parmetros
nucleotpicos juegan un papel importante en
la evolucin, diversificacin y adaptacin a
distintos ambientes, limitando el rango de
expresin fenotpica que puede ser alcanzado por accin gnica.
Por otro lado, varios autores opinan que
las secuencias de ADN no gnico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN egosta,
parsito o ignorante. Otros investigadores
sealan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen

74

ADN repetido no codificante que, en forma

oportunista, acte como mutgeno y /o
agente regulador.
En algunos organismos se ha demostrado que la transposicin de elementos mviles retrovirales pueden alterar la dinmica del
genoma provocando una inestabilidad que
se puede traducir en una sbita explosin de
variabilidad. Se conocen procesos de escisininsercin de elementos mviles produciendo
por ejemplo, plantas variegadas. Estos procesos pueden, adems, producir reestructuraciones cromosmicas alterando el orden y
posicin de los genes. Estos cambios rpidos
pueden ser potentes mecanismos evolutivos
ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en
rearreglos estructurales, los mismos pueden
involucrar efectos de posicin que, en algunos casos, poseen valor adaptativo. Todos
estos procesos tienen, adems relevancia en
aspectos aplicados ms inmediatos ya que
un cambio en la posicin de un gen puede
cambiar la expresin o la funcin bioqumica
del mismo.
Se ha demostrado que el genoma de las
plantas es inestable y responde al estrs provocado por alteraciones genmicas, ambientales, cromosmicas o citoplasmticas. Estos
factores fsicos, bioqumicos o genticos inducen mecanismos de inestabilidad
insercional o modifican el numero de copias
de secuencias de ADN no codificante. La hibridacin, en la naturaleza o en prcticas de
mejoramiento, ha sido, en algunos casos, un
factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. Otros experimentos han mostrado que la interaccin entre el
genoma y el medio resulta en una rpida
generacin de variacin. En lino, por ejemplo, se encontraron diferencias en el nmero de copias de ADN repetido entre lneas
que crecan en medios con diferentes
nutrientes. En lneas aloplasmicas de maz
hemos encontrado que el citoplasma de
teosinte provocaba activacin de elementos
transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromticas.
El anlisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rpidamente fenmenos de
aneuploida y poliploida generados por estrs
durante prcticas de cultivo de tejidos.

POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

La variabilidad intraespecfica en el contenido de ADN fue informada y probada en

varios grupos taxonmicos. El maz y especies silvestres relacionadas constituyen un
ejemplo de variacin intraespecfica donde
est bien demostrada la variacin en el contenido de ADN debida a variacin en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido)
y en el nmero de cromosomas supernumerarios. En veintiuna razas nativas de maz del
noroeste argentino ubicadas a lo largo de un
gradiente altitudinal encontramos una correlacin lineal negativa significativa entre el
contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo, esto significa
que el contenido de ADN de los cromosomas
del maz es menor en lugares de cultivo elevado, sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Es interesante sealar que esta disminucin del contenido de ADN de los
cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no
codificante (ADN repetido- cromosomas B),
su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas
en su mantenimiento. La presencia de
cromosomas accesorios (heterocromticos,
no codificantes sin funciones vitales para el
organismo), en razas nativas de plantas cultivadas tales como maz y centeno, es una
de las incgnitas actuales de la biologa evolutiva y aun no se comprende el papel que
pueden jugar los mismos en futuros planes
de mejoramiento. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con
mecanismos de impulso que hacen que se
hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigacin en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes
tiles en programas de mejora.
En resumen, la evolucin del genoma
eucariota ha involucrado casos de amplificacin, divergencia, reamplificacin y delecin
de secuencias de ADN repetido. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el
tamao del genoma, quedando aun muchas
cuestiones por resolver en lo que se refiere a
los mecanismos moleculares involucrados, la

frecuencia con que ocurren estos eventos y

la relacin de los mismos con factores ambientales, genticos fisiolgicos. Resolver
estas cuestiones permitir comprender el
papel de la variacin del tamao del genoma
en la evolucin y analizar la relevancia de la
variacin del contenido de ADN con relacin
a caractersticas de importancia agronmica.
5 Citogentica molecular: resolucin de
problemas bsicos y aplicados
El hallazgo de tcnicas para identificar
genomas y cromosomas en preparaciones de
rutina ha representado un gran progreso en
la citogentica vegetal, ya que disponer de
marcadores cromosmicos permite estudiar
la organizacin del genoma y la arquitectura
nuclear. Las tcnicas de bandeo (C, fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composicin
molecular del ADN. En ausencia de bandas
marcadoras no es posible identificar
cromosomas con morfologa similar. Adems
en especies algamas suele existir
polimorfismo para nmero y posicin de zonas heterocromticas, lo que dificulta la caracterizacin cromosmica y la deteccin de
regiones introgresadas. Un notable ejemplo
de polimorfismo y politipismo para bandas
heterocromticas lo constituye el estudio de
lneas y razas nativas de maz. Los marcadores moleculares combinados con la
citogentica resultaron ser de gran utilidad
para entender la organizacin cromosmica
y la distribucin fsica de las secuencias repetidas. El gran potencial de las tcnicas de hibridacin in situ resulta de combinar informacin acerca de la morfologa nuclear o
cromosmica con la informacin molecular de
la estructura de las secuencias. Aunque estas
tcnicas se conocen desde 1969 utilizando
marcacin radioactiva, en plantas se comenz a aplicar a fines de la dcada del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias
clonadas para utilizar como sonda. Adems,
la posibilidad de utilizar ADN genmico total
como sonda ( GISH) y modernos sistemas de
marcacin y deteccin no radioactivos han
impulsado el uso de esta tcnica en forma
rutinaria, complementando los resultados
obtenidos por metodologas ms clsicas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

75

Mediante la aplicacin de estas tcnicas se

obtienen datos que podrn ser utilizados en
estudios de sistemtica, filogenia,
biodiversidad, evolucin, mejoramiento y
biotecnologa.
La hibridacin in situ (ISH) de sondas de
cidos nucleicos en preparaciones cromosmicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reaccin de hibridacin entre la sonda y el ADN blanco
(cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de
la sonda y del ADN de los cromosomas
hibridarn, en relacin a su homologa, en
un sitio citolgico; 3) remocin de la sonda que no se uni o que se hibrid en forma
inespecfica; 4) Deteccin de la hibridacin y
visualizacin de la hibridacin a travs de
fluorocromos.
Una de las aplicaciones de esta tcnica
(FISH o fluorescent in situ hybridization) es
la obtencin de un mapa fsico, funcional y
estructural del genoma utilizando secuencias
de distinto origen como sondas. El anlisis
de la organizacin fsica de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs,
ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc.,
permite identificar cromosomas, analizar la
arquitectura nuclear del genoma y verificar hiptesis acerca de la relacin entre posicin y
funcin de determinadas secuencias. Otras
aplicaciones de esta tcnica consisten en determinar la distribucin y posicin de material cromosmico extraespecfico, la existencia de apareamiento y recombinacin
intergen-mica, la existencia de segregacin
preferencial (responsables de herencia no
mendeliana de algunos tipos cromosmicos),
la presencia y tipo de rearreglos
cromosmicos y analizar la segregacin de
determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relacin entre estos
fenmenos y variaciones en la expresin
gnica.
La hibridacin in situ utilizando ADN
genmico total como sonda (GISH o Genomic
ISH) revela homologas especficas del ADN,
principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos,
biosistemticos y en mejoramiento vegetal.

76

Esta tcnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en

hbridos y poliploides, analizar afinidades
genmicas interespecficas, detectar reestructuraciones cromosmicas, corroborar que en
el ncleo existen dominios espaciales de
genomas o secuencias particulares, detectar
la existencia de apareamiento intergenmico
y recombinacin. Adems, permite analizar
la organizacin nuclear y desarrollo
cromosmico en especies e hbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosmicos introgresantes en planes
de mejoramiento; analizar afinidades
genmicas interespecficas en cuanto a variacin en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meitico en generaciones segregantes de
hbridos y poliploides. Es importante sealar
que las relaciones obtenidas mediante GISH
no son afectadas por genes que producen
disturbios en el apareamiento meitico
(asinapsis, desinapsis, apareamiento
homelogo o heterlogo).
Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en
la mayora de los eucariontes. En maz, por
ejemplo, el genoma est dominado por elementos repetidos, siendo la mayora de stos del tipo disperso (como, por ejemplo,
retroelementos), los que ocuparan el 33- 62%
del genoma. En el gnero Zea, por ejemplo,
existen variaciones intra e interespecficas en
el tamao del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en lneas y razas
argentinas de maz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700
Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z.
luxurians. Estas variaciones, tanto intercomo intraespecficas se deberan principalmente a diferencias en la heterocromatina,
reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderan a secuencias repetidas en
tandem. Sin embargo, tanto este tipo de
ADN repetido en tandem, como as tambin el disperso correspondiente a los
retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones
durante la evolucin de las especies del gnero Zea. La tcnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar
tales amplificaciones y divergencias. Esta tcnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan
divergentes que no existe hibridacin cruza-

POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridacin con la sonda
Knobs de maz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratincin con DAPI, las zonas intensamente
hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , ncleo interfsico; la
mayora de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte seal de hibridacin en C; se utiliz sonda Knob
de maz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B),
hibridacin con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se sealan (puntas de flechas)
los organizadores nucleolares en cromosomas y ncleo interfsico. F = Prometafase I meitica de la F1 Zea mays ssp.
mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la seal de hibridacin se encuentra en un trivalente (sealado
con flecha), se utiliz como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = clula de Tricepiro; G = hibridada con
sonda de ADN genmico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14
cromosomas con fuerte seal de hibridacin indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual
clula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte seal con Cy3 (en rojo), permiti
reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratincin con DAPI. La barra representa 10 micrones,
todas con igual aumento. Ver explicacin extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b
y 2000.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

77

da entre ellas. El uso de ADN genmico total

como sonda especie-especfica tiene algunas
ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN
genmico total incluye un rango muy amplio
de secuencias mltiple copia y es por lo tanto improbable que exista slo un lugar afn a
la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una
sonda clonada sera homloga de algunos
pocos cromosomas o segmentos de
cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de
exigencia en la hibridacin y utilizar DNA no
marcado como bloqueante. Esta modificacin consiste en agregar a la mezcla de hibridacin ADN no marcado en alta concentracin. Este bloqueo no slo aumenta la diferenciacin entre la especie que se usa como
sonda y la que se usa como bloqueante, sino
que reduce la hibridacin cruzada con otras
especies, ya que muchas plantas de la misma
familia comparten muchas secuencias. Para
diferenciar especies y cuando la resolucin es
importante se requiere bloqueo y estricto
control de exigencia.
Estudios de hibridacin in situ (FISH, GISH)
mostraron que el cereal sinttico Tricepiro
(2n=6x=42) est compuesto por 28
cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeas zonas de introgresin de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logr identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que
Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramnea
patagnica de potencial importancia
forrajera. En el genero Zea la tcnica GISH
nos ha permitido: analizar la afinidad
genmica entre subespecies de la seccin Zea,
y entre maz, teosinte y gneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que
existen zonas de alta homologa entre
Tripsacum dactyloides (una de las especies
que pudieron haber estado involucradas en
el origen del maz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias
neocentromricas. Estos resultados apoyan
hiptesis planteadas previamente sobre la
existencia de zonas de homologa entre ambas especies que favoreceran el intercambio

78

gentico y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maz.

Estudios realizados en especies de la seccin
Luxuriantes permiti determinar, mediante
tcnicas de FISH, que Zea luxurians presentara secuencias telomricas de ADN altamente repetitivo. El anlisis de estas secuencias
marcadoras en meiosis nos permiti resolver
la constitucin cromosmica de las complejas configuraciones meiticas que se observan en hbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las frmulas genmicas planteadas para las distintas especies, avalando la hiptesis propuesta sobre el origen poliploide del maz y especies afines. Las mismas tcnicas, aplicadas en
razas de maz que presentan polimorfismo
numrico para cromosomas B, permitieron
postular hiptesis acerca del origen de los
mismos.
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