Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Biotecnologa de la Respuesta Inmune

5BV1
Profesor:
Cesar Agustn Jimnez Sierra

Espinosa Pacheco Camilo

Morales Martnez Francisco Javier
Prez Mora Wendy Aracely.
Velo Silvestre Jazmn Elizabeth

Pruebas
Inmunolgicas
ENZIMOINMUNOANLISIS
(ELISA de Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay)

Pruebas Inmunolgicas
La serologa es la rama de la inmunologa que
estudia las interacciones antgeno-anticuerpo
para su aplicacin en el diagnostico clnico.
Hay seis tipos fundamentales de pruebas
serolgicas:
1. Reaccin de precipitacin
2. Aglutinacin
3. Fijacin del complemento
4. Inmunofluorescencia
5. Radioinmunoensayo
6. Enzimoinmunoanlisis (ELISA).

ENZIMOINMUNOANLISIS (Prueba
De ELISA)
Fue descrito en 1971 por los investigadores
suecos Eva Engvall y Peter Perlman, y en
la actualidad se designan con este nombre
a todos los inmunoensayos enzimticos
en fase heterognea.

Este ensayo se basa en el

uso
de
antgenos
o
anticuerpos marcados con
una enzima, de forma que
los conjugados resultantes
tengan
actividad
tanto
inmunolgica
como
enzimtica pudiendo ser
revelada
mediante
la
adicin de un substrato
especfico
que,
en
contacto con la enzima,
producir
un
color
observable a simple vista y
cuantificable por un lector
de densidad ptica.

Componentes de una prueba ELISA

Muestra
Fase slida o soporte: Posos o placas en donde se
realizan las pruebas estos pueden ser de
diferentes materiales; nitrocelulosa, polivinilo,
poliestireno, ltex, nylon, celulosa y sefarosa.
Antgeno o Anticuerpo (policlonales o
monoclonales)
-Anticuerpos policlonales:
heterogneos
Reconocen eptopos diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de Linfocitos B
-Anticuerpos Monoclonales:
Homogneos
Especificidad nica
Producidos por un nico clon de Linfocitos B

 Conjugado-Enzima: Algunas de las caractersticas de deben

reunir son:
Actividad especifica
Pureza
Estabilidad
Solubilidad
Fcil medicin y deteccin
No se reduce la actividad por la conjugacin
Bajo costo
Estables en amplio intervalo de condiciones del ensayo.
Con grupos funcionales adecuados para su unin a
Anticuerpos o Antgenos.
Algunas de las enzimas que se utilizan son:
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
-galactosidasa
Penicilinasa
Ureasa
Glucosa oxidasa

 Bloqueo: Protena ajena al sistema que se esta

manejando el cual recubre los espacios huecos que
no llena el Antgeno; Estos se utilizan para que los
Anticuerpos no se unan de forma inespecfica a la
fase solida.
Casena
Casena/Tween20
Tween 20
Gelatina
BSA
Sustrato:
Solubles en agua
Fcil de manipular
No txicos
No mutgenicos
Bajo costo

La tcnica de ELISA se caracteriza por presentar

alta sensibilidad, especificidad, rapidez y
economa. Brinda la posibilidad de analizar un
gran nmero de muestras de manera sencilla ,
rpida y econmica, sin mayor infraestructura.
Existen diferentes modalidades de ELISA y el
mtodo
competitivo,
que
permiten
la
determinacin de antgenos o anticuerpos en
fluidos biolgicos.

Directo. Inmunohistoqumica
Indirecto
Sndwich
Competitivo
Inhibicin

Directo
Se utiliza especficamente para detectar un antgeno,
porque busca a una sustancia extraa.
En una prueba de ELISA directa la cual es considerada
la ms simple, el antgeno se adsorbe en una placa
de plstico, a continuacin un exceso de otra
protena (generalmente albmina de suero bovino)
se aade para bloquear todos los otros sitios de
unin. Mientras que una enzima est ligada a un
anticuerpo en una reaccin separada, el complejo
enzima-anticuerpo se aplica para adsorber al
antgeno.
Posteriormente el exceso de complejo enzimaanticuerpo se lava, quedando enzima anticuerpo
unido
a
antgeno.
Mediante la adicin del sustrato de la enzima se
detecta la enzima que ilustra la seal del antgeno.

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Mtodo Directo de ELISA

Antgeno
*
Bloquead
or

100 l

Conjugad
o
Ab-E
Sustrato
enzimtic
o
* Principalmente se
busca Ag problema

+ Color + [AbAg]

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras

mostradas.

E . l . i . s . a

Indirectos
Es utilizado para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado
contra el antgeno
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos
fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
3. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales
reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso
anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la
enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Mtodo Indirecto de ELISA

Antgeno
Bloqueador

100 l

Anticuerp
o*
Conjugad
o
Ab-E
Sustrato
enzimtic
o
* Principalmente
cuando se busca Ab
problema

+ Color + [AbAg]

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras

mostradas.

E . l . i . s . a

Sndwich
Es una variable menos comn, pero es altamente
eficiente en la deteccin de antgeno.
ELISA sndwich cuantifica antgenos entre dos capas
de anticuerpos (anticuerpo de captura y de
deteccin). El antgeno a medir debe contener al
menos dos eptopos antignicos capaces de unirse al
anticuerpo.
Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales
como policlonales. Los antecuerpos monoclonales
reconocen un eptopo nico que permite la deteccin
y cuantificacin final de las pequeas diferencias en
el antgeno, mientras que los policlonales a menudo
son utilizados como anticuerpo de captura.
Una de las ventajas de este tipo de prueba ELISA es
que la muestra no tiene que ser purificada antes de

Esquema de procedimiento:
1. Placa recubierta con anticuerpo de captura.
2. Se aade la muestra y cualquier antgeno
presente se une a la captura de anticuerpos.
3. Se aade anticuerpo de deteccin el cual se
une al antgeno.
4. Se aade el anticuerpo secundario ligado a
enzima y se une al anticuerpo de deteccin.
5. El sustrato es agregado , y es convertido a una
forma detectable por la enzima.

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Mtodo del Sndwich de ELISA

Anticuerpo de
sensibilizacin

Bloqueado
r

100 l

Antgeno
*
Conjugad
o
Ab-E
Sustrato
enzimtic
o
* Principalmente
cuando se busca Ag
problema

+ Color + [AbAg]

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras

mostradas.

E . l . i . s . a

Competitivo
Consta de las siguientes etapas:
1.- Fijacinalsoporteinsolubledeanticuerpos
especficos del agente patgeno a detectar. Lavado
para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o
no fijados.
2.- Adicin en concentracin conocida de una mezcla
de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso
anterior, marcados con una enzima y antgenos
desconocidos objeto de estudio.
3.- Paralelamente, aadir nicamente antgenos del
anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con
una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no
hayan reaccionado.
4.- Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de
actuar la enzima marcadora. Se puede parar la
reaccin si se desea.

5.- Lectura visual o colorimtrica del producto

final coloreado de ambas pruebas y comparar
los resultados.
Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas,
el antgeno a estudio no tiene nada que ver
con los anticuerpos empleados para tapizar el
soporte.
Si
hay
diferenciaen
laslecturasde
ambospocillos,el antgeno objeto de estudio,
est relacionado serolgicamente con el
anticuerpo
empleado
para
tapizarel
soporteyla diferencia dedensidad ptica, es
proporcional a la concentracin del antgeno
problema en la muestra.

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Mtodo Competitivo de ELISA

Ab
estandar
Bloquead
or

100 l

Conjugad
o
Ag-E
Antgeno
*
problem
Sustrato
a
enzimtic
o
* Principalmente
cuando se busca Ag
problema

+ Color + [Ag-E] = - [Ag de

muestra]

Nota: Los esquemas varan con el tamao verdadero de las estructuras

mostradas.

E . l . i . s . a

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Mtodo de Inhibicin de ELISA

Ag
estandar

(+
)

Bloquead
or
Ag
problema*
de la
muestra
Ab
estandar

100 l

(+
)

()

Muestra
Problem
a

()

Conjugad
o
Ab-E
Sustrato
enzimtico

+ Color + [Ab-Ag] = - [Ag de

muestra]

* Principalmente
cuando se busca Ag
problema

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras

mostradas.

E . l . i . s . a

Importancia
Son utilizadas en el diagnostico medico,
industria de alimentos y el estudio y control del
medio ambiente.
En estudios serolgicos, hematolgicos,
endocrinolgicos, oncolgicos, en trasplantes,
medicina forense y antropologa.
Con propsitos mdicos se han aplicado en la
determinacin de hormonas y protenas
plasmticas, antgenos tumorales, drogas, Ag y
Ac de microorganismos (parsitos, hongos
bacterias, virus).
Los resultados aportan elementos diagnsticos,
informacin de una enfermedad y coadyuvan en
la planificacin del tratamiento.

Aplicaciones
Prueba de embarazo
Diagnstico de hepatitis vricas
Infecciones por el virus del herpes
simplex y virus de rubola
Infecciones por retrovirus

Patologa animal
Enfermedades producidas por parsitos
Babesias y tripanosomas
Toxocara canis
Toxoplasmosis
Triquinosis
Enfermedades producidas por
Micoplasmas
Enfermedades producidas por bacterias
Mycobacterium tuberculosis
Brucelas
Enterotoxinas Vibrio cholerae
Estreptococos
Salmonelas
Enfermedades producidas por virus
Enfermedad de Aujeszky
Enfermedad de Newcstle
Fiebre aftosa
Leucemia felina

Peste porcina africana

Peste porcina clsica
Rinotraqueitis infecciosa
Rotavirus
Artritis vrica

Otras aplicaciones
Hormonas
 Gonadotropina corinica
 Progesterona
 Testosterona
 Hormonas tiroideas
Cuantificacin de
inmunoglobulinas
 IgG
 IgE
 IgA
Inmunopatologa
 Anticuerpos anti-DNA
 Factor reumatoide
 Inmunocomplejos circulantes

Patologa vegetal
Enfermedades producidas
por virus
En frutales
 PPV
 CLSV
 TRSV
En ctricos
 CTV
En patata
 PLRV
 PVY
 PVX
 PVA
 TRV

En
En
En
En
En
En

cereales
guisante
lpulo
soja
ornamentales
plantas hortcolas

Enfermedades producidas
por bacterias
Enfermedades producidas
por Micoplasmas
Enfermedades producidas
por hongos

Bibliografa
Tortora et al; Introduccin a la Microbiologa; 9na edicin;
Editorial Medica Panamericana; Argentina, 2007, Pp.:544
John L. Ingraham. Introduccin a la Microbiologa; Volumen 2.
Editorial Reverte S.A. . Madrid, Espaa. Pp.:448, 449 y 457

Cibergrafa
http://cnia.inta.gov.ar/helminto/pub%2
0triquinosis/ELISAtrichinella.pdf
http://www.elisa-antibody.com