Determinacin cuantitativa de saponinas y azcares

reductores del Agave brittoniana T

J. O. Guerra de L.,* C. Nogueiras L.,** R. Delgado C.,*** O. Hernndez S.*
*Facultad de Qumica Farmacia, Universidad Central de Las Villas,**Facultad de Qumica, Universidad de
La Habana,***Facultad de Educacin, Universidad de Cienfuegos

Resumen
En este trabajo se determin los contenidos de saponinas y azcares reductores en jugo y extractos
de hojas de la planta denominada Agave brittoniana T.
Los procedimientos empleados fueron, en la determinacin de saponinas, un mtodo fotocolorimtrico,
en el cual se midi el color desarrollado durante la hemlisis de la sangre por este tipo de compuesto; para
la determinacin de azcares reductores se utiliz el mtodo de Folin-Wu.
Los resultados obtenidos arrojaron un alto contenido de saponinas y baja cantidad de azcares
reductores en esta planta con respecto a otros agaves.
Palabras claves: glicsidos esteroidales, hemlisis.

Abstract
In this paper were determined the contents of saponins and reducing sugars in juice and leaf extracts
of the plant known as Agave brittoniana T.
The procedures used were, in the determination of saponins, a photocolorimetric method, in which
the color developed is measured during the blood hemolysis caused by this type of compound; for the
determination of reducing sugars Folin-Wo method was used.
The results obtained, gave a high content of saponins and a low quantity of reducing sugars on this
plant with respect to other agaves.
Key words: steroidal glycosides, hemolysis.

Introduccin
Las saponinas son compuestos naturales que se
encuentran en las plantas con una estructura glicosdica,
y de los cuales se reporta en la literatura un gran
nmero de propiedades bioactivas.
Por otra parte, estos tipos de compuestos son
precursores en la obtencin de frmacos esteroidales.
Dentro de las plantas que se caracterizan por el
alto contenido de estos glicsidos, estn las
pertenecientes al gnero Agave. Tal es el caso de la
denominada Agave brittoniana T., endmica de la
regin central del pas, la cual ha sido objeto de este
trabajo.

Resulta de inters cuantificar las saponinas

presentes en el material vegetal, as como en
distintos productos intermedios del proceso de
separacin de las mismas, pues esto nos da una
medida de rendimientos del producto final que se
separa, as como de la eficacia de
los
procedimientos de separacin utilizados.
Tambin es importante el contenido de azcares
reductores, teniendo en cuenta que en la medida que
ste sea mayor es ms dificil una eficaz separacin
de las saponinas presentes. Adems, conocer el
contenido de estos metabolitos forma parte de una
caracterizacin fitoqumica completa de la planta en
estudio.
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En la literatuta aparecen reportados varios

mtodos para la extraccin de saponinas, los que se
basan en la solubilidad de estos compuestos en solventes
polares como agua, metanol y n-butanol y su
insolubilidad en ter y otros solventes orgnicos.
Para la determinacin cuantitativa de estos
compuestos se ha planteado el uso de tcnicas
colorimtricas, espectrofotomtricas, cromatogrficas
y gravimtricas.
En la actualidad se emplea con mucho nfasis la
cromatografa en la determinacin cuantitativa de
saponinas, principalmente las tcnicas de HPLC
/1, 3/, aunque stas tienen como inconveniente su alto
costo. Tambin se han empleado tcnicas de capa
delgada preparativa /3/ lo cual no siempre conduce a
buenos resultados.
En muchos trabajos no se reporta la determinacin
directa de saponinas, sino que sta se infiere a partir
de la determinacin de las sapogeninas esteroidales,
despus de una hidrlisis de las saponinas. Ya desde
la dcada del 50, Wall y colaboradores /4/ reportaron
un mtodo utilizando espectroscopa infrarroja, basado
en la relacin existente entre la concentracin de las
sapogeninas y la intensidad de una banda situada en
982-987 cm-1. Ms recientemente se han desarrollado
tcnicas fotocolorimtricas en las que, despes de la
hidrlisis de las saponinas, se desarrolla el color por
reaccin con mezcla de cidos sulfrico y actico
glacial.

con una solucin alcalina cprica, formando un

precipitado de xido cuproso. Este ltimo se disolvi
en una solucin de cido fosfotungstomolbdico,
reduciendo el molibdemo presente a cido molibdoso,
el cual posee una coloracin azul cuya absorbancia se
mide a 500 nm.

Parte experimental
Recoleccin y preparacin del material
vegetal
El material vegetal fue colectado por el doctor
Alfredo Noa (botnico) en las afueras de la ciudad
de Santa Clara, en el lugar conocido como la loma de
"La Melchora", situada en las inmediaciones de la
Autopista Nacional en el mes de junio de 1997.
Las plantas seleccionadas posean hojas de
aproximadamente 1 m de longitud y 10 cm en la parte
ms ancha, las cuales se encontraban sobre un tallo de
50 cm de altura y 10 cm de dimetro; para el estudio
se tomaron hojas y races de la planta. De las hojas se
separ la cutcula que las cubre para su estudio por
separado. Cada una de estas partes se pic en finas
lascas, procedindose en el caso de las hojas a un
proceso de secado a la sombra hasta peso constante.
Se moli el material hasta polvo fino.

Determinacin cuantitativa de saponinas

sta se realiz de acuerdo con los siguientes
pasos :

Otra tcnica desarrollada /5/ en la determinacin

de saponinas en tubrculos de Dioscreas consiste
en un proceso simultneo de hidrlisis y extraccin,
as como el posterior desarrollo de un color rojo
estable al tratar la muestra con SbCl5.

a) Conservacin de la sangre. En un matraz de

100 mL se aadi 10 mL solucin de citrato de sodio
(36,5 g/L) y se complet con sangre de res. Esta
solucin puede conservarse hasta una semana a 2 8 0C.

La propiedad de las saponinas de romper la pared

celular de los glbulos rojos de la sangre (hemlisis) ha
servido de principio para que un gran nmero de
investigadores /6/ propusiera un mtodo de
determinacin directa de saponinas mediante la
aplicacin de una tcnica fotocolorimtrica. Ese
mtodo fue el utilizado en este trabajo.

b) Preparacin de los glbulos rojos. No

obstante el paso anterior, parte de la sangre siempre
se hemoliza, por lo que es necesario lavarla antes
de trabajar con ella. Se tom 5 mL de la sangre
preparada segn el inciso anterior y se suspendi en
50 mL de suero fisiolgico salino; se centrifug a 2
500 rpm durante 15 min; se decant el lquido
sobrenadante y se repiti el proceso dos veces
ms. El precipitado de glbulos rojos se resuspendi
en una solucin de citrato de sodio al 3 % en
proporcin 1:20.

Para la determinacin de azcares se emple el

mtodo fotocolorimtrico conocido como mtodo de
Folin-Wu, en el cual los azcares reductores reaccionan

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Vol. XIII, N 3, 2001

c) Preparacin de la curva de calibracin. Se

trasvas 10 mg de saponinas qumicamente puras a un
matraz de 50 mL, completndose con solucin buffer
de KH2PO4 de pH = 7,4 . A partir de esta solucin
madre, se prepar otras de concentracin 0,030;
0,025; 0,020; 0,015; 0,010 y 0,005 g/L, a las que se les
determin el por ciento de hemlisis.
d) Preparacin de las muestras. Las muestras
problemas de saponinas se diluyeron en proporciones
adecuadas con solucin buffer de KH2PO4 de
pH = 7,4 preparndose de esta forma las soluciones
de trabajo.
e) Determinacin de la hemlisis. Se prepar
6 tubos de ensayos, a los cuales se les aadi 0,3; 0,6;
0,9; 1,2; 1,5 y 1,8 mL de solucin de trabajo,
respectivamente y se complet con agua hasta un
volumen total de 6 mL. A cada tubo se le aadi
tambin 6 mL de solucin de citrato de sodio al 6 %
y 1 mL de la solucin de glbulos rojos (muestras para
determinar la hidrlisis). Por otra parte, se prepar 6
tubos de ensayos ms, de la misma forma que los
anteriores, pero se le aadi a cada uno 1 mL de
solucin de citrato de sodio al 3 % en lugar de la
solucin de glbulos rojos (blanco en la lectura
fotocolorimtrica). Los seis primeros tubos se
colocaron en un bao de agua a 35 0C durante 30 min,
se centrifugaron a 2 000 rpm durante 5 min.
Paralelamente, de la misma forma, se prepar controles
utilizando agua destilada y citrato de sodio al 3 % (en
lugar de las soluciones de saponinas) para determinar
el 100 % y el 0 % de hemlisis, respectivamente.
f) Clculos: El por ciento de hemlisis para todos
los casos se determin segn la siguiente ecuacin:

% hem = A

A
.100 / A
A
CTS
AGUA
CTS

donde
AM : Absorbancia de cada muestra
ACTS : Absorbancia del control con solucin del citrato
de sodio
AAGUA : Absorbancia del control con agua destilada.

De la curva de calibracin (% de hemlisis contra

concentracin de saponinas) se determin el valor de
K que es la concentracin de saponinas, para la
cual ocurri el 50 % de la hemlisis.
En el caso de las soluciones de trabajo se
grafic el por ciento de hemlisis contra el inverso de
las diluciones a las que se prepararon y se determin
el valor de 1/dil que es el inverso de la dilucin a la que
ocurri el 50 % de hemlisis.
La concentracin de saponinas en la muestra se
determin mediante la ecuacin:

b g

C sap = 2. K . Fd .1 / dil

Fd:factordedilucin

Determinacin cuantitativa de azcares

reductores
Para esta determinacin se dio los siguientes
pasos :
a) Preparacin de la curva de calibracin. Se
pes 50 mg de glucosa y se trasvas a un matraz
de 100 mL que se complet con agua. A partir de esta
solucin madre , se prepar otras de concentraciones
0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 y 0,6 mg/L, con las que se
confeccion la curva de calibracin.
b) Preparacin de las muestras. Las muestras
a las que se les determin el contenido de azcares
reductores se diluyeron en agua en proporciones
adecuadas, obtenindose as las soluciones de
trabajo.
c) Determinacin de los reductores. A 1 mL
de la solucin de trabajo se le aadi 7 mL de
agua, 1 mL de cido sulfrico de concentracin molar
equivalente 0,66 mol/L y 1 mL de solucin de
tungstato de sodio 10 %; se agit y se centrifug. Del
sobrenadante se tom 1 mL y se le aadi 1 mL de
solucin alcalina de tartrato de cobre 10 %; se
mantuvo 8 min en bao de agua. A esta solucin se le
aadi 1 mL de solucin fosfotngstica molbdica y se
mantuvo a ebullicin durante 2 min; se enfri
posteriormente a temperatura ambiente. En el tubo
folin se diluy con agua destilada hasta 25 mL,
leyndose en el fotocolormetro a 500 nm.

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Resultados y discusin

el epgrafe 3.4, se obtuvo los resultados que aparecen

en la tabla 2.

Determinacin cuantitativa de saponinas

TABLA 2: RESULTADOS EN LA
DETERMINACIN DE SAPONINAS

Para la confeccin de la curva de calibracin se

determin el por ciento de hemlisis de la muestra de
saponinas patrn a diferentes concentraciones
obtenindose los resultados que se muestran en la
tabla 1.
TABLA 1: DATOS PARA LA CURVA DE
CALIBRACIN

Punto
No.

Concentracin
saponinas

de

de

hemlisis

( g/L)

Crudo de saponinas
(g saponinas /100 g crudo de glicsidos)
X

JUGO (g/L)

RAICES

X1

41,00

4,58

1,15

X2

41,10

4,61

1,18

X3

41,12

4,67

1,20

X4

41,15

4,68

1,21

0,030

99,60

X5

40,93

4,55

1,17

0,025

81, 24

Prom.

41,02

4,62

1,18

0,020

60,87

0,09192

0,0563

0,0238

0,015

42,10

0,00845

0,00317

0,00057

0,010

22,12

C.V.

22,4 %

1,22 %

2,02 %

0,005

7,20

Int. Conf.

0,1141

0,069897

0,02964

Estos valores corresponden a una recta que fue

ajustada a los mismos por el mtodo de los mnimos
cuadrados. El coeficiente de correlacin obtenido fue
de 0,999 y la ecuacin de la misma es:
C(sap) = 0,0043 + 0,00026 . % Hem

donde
Prom: Valor promedio

C. V.: Coeficiente
de variacin

S: Desviacin tpica

Int. Conf.: Intervalo

de confianza

donde
C(sap) = concentracin de saponinas en g/L
% Hem = por ciento de hemlisis
Con esta ecuacin se calcul el valor de K
(concentracin de saponinas a la que ocurri el 50 %
de la hemlisis) que result ser 0,0173 g/L.
Teniendo en cuenta que en este mtodo la zona de
mnimo error se encuentra alrededor del 50 % de la
lectura fotocolorimtrica, a este valor se ajustaron
todas las mediciones realizadas.
Para conocer el contenido de saponinas en el jugo
y crudos, se determin el factor de dilucin a la que
cada muestra provoc el 50 % de hemlisis, y con
este resultado y aplicando la frmula que se explic en

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HOJAS

Vol. XIII, N 3, 2001

S2 : Varianza
Si bien estos valores no pueden interpretarse
como resultados absolutos, nos sirven para poder
comparar el contenido relativo de saponinas entre
distintas partes de una planta, variacin de este
metabolito con la poca del ao, con el tipo de suelo,
etctera, o la comparacin con otro tipo de plantas
siempre que las determinaciones se hayan realizado
por el mismo mtodo.
Se observ que el contenido de saponinas de este
agave es mayor que el reportado para el henequn
(66,67) que es del orden de 2-3 g/L. Tambin se
apreci cmo en las hojas la concentracin de
saponinas es aproximadamente 4 veces mayor que en
las races.

Determinacin cuantitativa de azcares reductores

Inicialmente se determin la absorbancia utilizando solucin patrn de glucosa a distintas concentraciones,
aprecindose los resultados en la tabla 3
TABLA 3: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRACIN
Punto

Concentracin de

No.

glucosa

Absorbancia

(mg/L)
1

10

0,15

20

0,27

30

0,40

40

0,53

50

0,66

60

0,78

Estos valores corresponden a una recta que fue ajustada a los mismos por el mtodo de los mnimos
cuadrados. El coeficiente de correlacin obtenido fue de 0,997 y la ecuacin de la misma es:
Abs= 0,0202 + 0,0127. Conc(Az. Red.)
donde
Abs= Absorbancia
Conc (Az. Red.)= Concentracin de azcares reductores
Se determin el contenido de azcares reductores en el jugo y extractos n-butanlicos de las hojas.
Se obtuvo los resultados que se muestran en la tabla 4.
TABLA 4: RESULTADOS DE LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES

Jugo (mg/100 mL)

X1

47,22

329,1

X2

47,27

328,7

X3

47,31

331,0

X4

47,20

331,2

X5

47,15

330,2

Prom.

47,23

330,04

0,062048

1,1149

0,00385

1,2430

C.V.
Int. Conf.

-1

1,31.10 %
0,077

Crudo (mg/g) (Hojas)

-2

3,38 . 10 %
1,3841

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donde Prom es el valor promedio; C.V. el coeficiente de variacin; S: Desviacin tpica; Int. Conf.: Intervalo
de confianza; S2: Varianza.
Estos valores resultaron menores que los resportados para el jugo de henequn (ms de 200 mg/L) [66, 67],
lo cual, junto al alto contenido de saponinas, favorece los procesos de extracin y purificacin de estas ltimas.

Conclusiones
Se estableci las condiciones adecuadas para la determinacin del contenido de saponinas por la
tcnica de hemlisis y del contenido de azcares reductores por la tcnica de Folin-Wu en productos
derivados de la planta denominada Agave brittoniana T.
El contenido de azcares reductores result ser muy bajo respecto al de saponinas, aspecto que
favorece la extraccin de estas ltimas.
Este mtodo puede ser de gran utilidad en la cuantificacin del principio activo durante la
preparacin de formas farmacuticas a partir de la droga seca o de extractos de la planta, dadas las
propiedades bioactivas reportadas para las saponinas esteroidales.

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